人中性粒細胞彈性蛋白酶及其抑制劑研究報告

1、.1人中性粒細胞彈性蛋白酶及其抑制劑研究人中性粒細胞彈性蛋白酶(human neutrophi l elastase，HNE)在機體各種炎癥反響、組織損傷重構如肺炎、成人呼吸窘迫綜合征、肺纖維化、急慢性肺損傷、肺水腫、動脈粥樣硬化、硬皮病等病理過程中起重要作用，并且具有促進病毒、細菌的侵人及癌細胞轉移的功能。炎癥機制研究顯示，體該酶及其源性抑制劑的平衡失調可導致組織基質降解和炎癥的惡化。目前，國外用HNE抑制劑來治療這一類炎癥疾病的研究非常廣泛，并已成功開發(fā)出第一個以抑制HNE為治療途徑的上市藥物西維來司鈉sivelestat sodium hydrate，從而促進了HNE抑制劑的研究與開發(fā)。

2、 1BM的生理、病理作用及構造特征 HNE，又稱人白細胞彈性蛋白酶human leukocyte elastase，IRE，屬于基質金屬蛋白酶類matri* metalloproteinases,MMPs，即MMP-12,是一種金屬離子依賴性基質降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+ 離子的存在才具有酶活性，其底物類型非常廣泛，幾乎可降解細胞外基質中的所有蛋白。白細胞、巨嗜細胞、肥大細胞都存在著這種酶，中性粒細胞中其含量很高，大約每106個細胞中含有HNE的總量為 3g。生理條件下，HNE可以協(xié)助去除異源性物質，促進吞噬細胞消除有害病菌，并幫助消化受損組織，有助于傷口的愈合與組織再生。而HNE過量

3、表達則會對機體組織、基質造成危害，表現(xiàn)為破壞血管壁組分，使中性粒細胞更容易滲出血管并向炎癥部位趨化集中及釋放IL-8、TNF-等炎癥因子；它還能降解細胞基質，催化caspase 3誘導的細胞凋亡。據報道，HNE還能增強病毒、細菌及癌細胞對正常細胞的黏附能力，促進微生物的入侵及癌細胞的增殖和轉移。 HNE存在于中性粒細胞嗜苯胺藍顆粒中，是由 218個氨基酸組成的單一肽鏈，分子質量大約25.9 kD，含4個二硫鍵，是絲氨酸蛋白酶家族一員，因此與其他絲氨酸家族蛋白酶具有30%40的同源性，最適pH值接近中性。HNE的基因位于19號染色體的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒細胞中并無HNE

4、的mRNA表達，說明此種酶只在未成熟的骨髓細胞中合成。酶的催化中心由 His 41、Asp 88和Ser 173三個氨基酸殘基構成，空間位置相互靠近，均由發(fā)夾構造延伸到蛋白外表，其中 Ser殘基側鏈上羥基具有很高的親核性，容易結合不帶電的小分子氨基酸，如Val、Ala、Leu、Met等。 2BM抑制劑 HNE對機體會產生各種病理作用，故關于其抑制劑的研究也受到廣泛關注，其中包括源性抑制劑、合成的外源性抑制劑蛋白類、擬肽和雜環(huán)化合物以及天然提取物等。 2.1源性抑制劑 人體存在許多種針對HNE的快速反響抑制蛋白，每一種蛋白存在于不同的生理部位而發(fā)揮不同的作用。選擇性HNE抑制劑Elafin存在于

5、皮膚及上皮組織中，分子質量為7 kD，是酸穩(wěn)定性多膚；1- 抗蛋白酶1-antiprotease在血漿中具高濃度，并由此進入組織發(fā)揮作用。上述源性抑制劑包括2- 巨球蛋白均為分泌性彈性蛋白酶抑制劑，其中 1-抗蛋白酶被認為是在體各種臟器中起主導作用的源性HNE抑制劑。 2.1.11-抗蛋白酶它在許多生理、病理過程中如血液凝結、纖維蛋白溶解、炎癥等起調節(jié)蛋白分解的作用，并且對防止蛋白水解性組織損傷起重要作用。據報道先天性1-抗蛋白酶缺損極易引發(fā)肺氣腫和自發(fā)性肺纖維化idiopathic pulmonary fibrosis。1-抗蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，存在于血漿中，平均分子質量

6、約50 kD，含有3 個片層構造和假設干螺旋構造，其中Met 358決定了它對HNE的抑制特異性，HNE與之結合后形成穩(wěn)定酯構造，致使酶的活性中心構象發(fā)生改變，不能去酞基化，這種抑制機制被稱為自殺性底物抑制。對1-抗蛋白酶的構造研究顯示，它和其他HNE拮抗劑一樣，在酶結合位點或附近的Met上的硫醚鍵對化學氧化非常敏感，一旦Met被亞砜化后，1-抗蛋白酶即失活。 在體氧化自由基的增多是造成這種源性抑制劑失活的主要原因，中性粒細胞分泌出的髓過氧化物酶通過過氧化酶-過氧化氫-鹵化物系統(tǒng)使1_ 抗蛋白酶氧化失活，從而到達HNE活性增高，促進細胞滲透轉移的目的。在體外試驗中，中性粒細胞中的過氧化物系統(tǒng)可

7、使1-抗蛋白酶在10秒之失活50%，20秒之完全失活。 2.1.2Elafin它是一種被研究得比較深入的源性抑制劑，又稱為彈力素，屬于Trappin-2基因家族。它在多種上皮組織中表達，如毛囊、食管、陰道和口腔中等。在人皮膚正常組織中沒有表達，但在皮膚受外傷和牛皮癬等炎癥反響時則會強烈地表達。翻譯后的elafin蛋白質前體是由117個氨基酸組成的多膚鏈12.3 kD，包括由22個氨基酸組成的信號膚，其活性部位在C端，以4個二硫鍵為中心。在切除了信號肽后，該蛋白質變成分子質量為9.9 kD的成熟蛋白，即elafin。研究說明，在HNE誘導的急性肺損傷倉鼠模型中，于誘導前1小時經氣管給予 elaf

8、in，其抑制HNE的IC50為8.1g/kg。 目前對elafin的研究著眼于其在動脈粥樣硬化、心臟移植后冠狀動脈疾病、心肌壞死以及呼吸道炎癥等方面的治療效果。異體心臟移植后冠狀動脈疾病及其后遺癥是器官承受者患有的主要并發(fā)癥，發(fā)病原理與冠狀動脈血管壁增厚有關，而由HNE活性升高引起的彈性蛋白降解沉積、IL-1活性增高、纖維連接蛋白合成、平滑肌細胞轉移等在冠狀動脈血管壁增厚過程中起關鍵作用。在家兔心臟移植模型中，給予重組人elafin可以有效的降低HNE活性，形態(tài)學、免疫組化和生化分析說明，與對照組相比， elafin給藥組家兔的血管壁增厚程度降低 70%。將elafin基因引入嫁接后的血管中，

9、可以有效減少血管嫁接早期的炎癥發(fā)生和減少細胞外彈性蛋白量；雖然elafin會導致血管膜形成減緩，總體上仍具有防止血管粥樣硬化惡化的效果。 2.2外源性抑制劑 對合成類HNE抑制劑的研究已有約20年歷史，其間涌現(xiàn)出大批很有前景的小分子合成物。然而到目前為止，僅有西維來司鈉作為治療全身性炎癥反響綜合征systemic inflammatory response syndrome，SIRS的HNE特異性抑制劑上市。合成類 HNE抑制劑又包括蛋白類、三肽或四肽和氮雜環(huán)類化合物等，此外，有報道稱酰胺類抗生素和苯基丁氮酮類上市老藥對HNE也有抑制作用。 2.2.1蛋白類抑制劑采用分子生物學的方法，通過對酶

10、與多肽類抑制劑相互作用的分析研究，可以提醒兩種分子的識別方式，從而為蛋白類抑制劑藥物設計提供思路。在蛋白類抑制劑的研究中，采用構建的限制性構造組合膚庫，篩選HNE的特異底物，這種方法篩選得到的抑制劑其優(yōu)點在于分子質量低，且特異性高。有文獻報道，從此多肽庫中篩選得到的HNE抑制劑在序列上具有很高的同源性，并且對其重組蛋白的分析說明它們均具有HNE抑制作用，抑制常數(shù)Ki可達65 nmol/L。 在對天然HNE抑制劑的研究過程中發(fā)現(xiàn)，每種抑制劑與HNE活性中心結合的作用位點P1幾乎都在一個延伸出來的環(huán)上，而P1位點上的氨基酸殘基主要決定抑制劑的抑制特異性。HNE容易與P1 位點上有小烷基側鏈的底物結

11、合，尤其易與Val殘基結合。構建的多肽按照天然底物的構造形式，形成環(huán)狀構造，可將P1位點遞呈到酶的活性中心。在此構造根底上，對P1和其他位點的氨基酸殘基進展修飾，使之進一步成為對HNE具有高度選擇性的化合物。據報道，限制性構造組合肽庫同樣可以用來篩選-胰糜蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶等絲氨酸蛋白酶的抑制劑，并且研究發(fā)現(xiàn)這幾種酶的活性中心具有一定的同源性，因此篩選出的大局部抑制劑可以同時抑制這一類酶。 2.2.2西維來司鈉2002年11月，氮雜環(huán)類化合物西維來司鈉商品名Elaspol在日本上市，其化學名為N-2-4-(2，2-二甲基丙酸基苯磺酰氨基丁氨基乙酸鈉，分子質量為528.51 D，適應證是全身

12、性炎癥反響綜合征和急性肺損傷，且正在進展用于呼吸窘迫綜合征治療的n期臨床試驗。它可改善肺損傷病人的呼吸功能，縮短使用呼吸器的時間，降低安裝呼吸器引起的壓力性損傷及呼吸道感染的并發(fā)率，減輕或緩解全身性炎癥反響綜合征及特發(fā)性肺纖維化等引發(fā)的急性肺損傷；另外，它還能使病人盡早脫離危險期。由于本品可治療與非典型性肺炎臨床表現(xiàn)密切相關的病癥，我國已于2003年5月批準對其進展臨床試驗，它是我國發(fā)生非典型性肺炎后首個通過“綠色通道加快批準進入臨床試驗的藥物。 以琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-N-對硝基苯胺為底物的酶抑制實驗說明，西維來司鈉對HNE的IC50為 (0.0440.003)mol/L,

13、抑制常數(shù)Ki為(0.200.02) mol/L。西維來司鈉是HIVE的競爭性抑制劑，并且具有很高的專一性，即使在濃度為100mol/L時，它對胰蛋白酶、凝血酶、纖溶酶、激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G等仍沒有抑制作用，對豬胰彈性蛋白酶僅有很微弱的抑制作用，其IC50是對 HNE的IC50的130倍。而它對各種試驗動物，如小鼠、倉鼠、大鼠、狗及家兔的中性粒細胞彈性蛋白酶都有抑制作用，且酶學反響測得的其IC50甚至比對 HIVE的IC50更小。 西維來司鈉在各種肺部疾病如肺纖維化、急慢性肺損傷、肺出血、肺炎、肺癌等的動物及體外模型中均表現(xiàn)出良好的藥理作用。給伯萊霉素誘導的肺纖維化小鼠模型靜脈

14、注射本品，可以減少成纖維細胞的生成，降低中性粒細胞在炎癥部位的聚集數(shù)量以及炎癥因子如IL-1、血小板源生長因子PDGF、巨嗜細胞炎癥蛋白-2、胰島素樣生長因子A等的 mRNA表達。從總體藥效來看，與對照組模型相比，西維來司他鈉可以明顯改善肺纖維化程度，并主要作用于發(fā)病急性期。 目前西維來司鈉的藥效研究已進一步擴展到用于肺癌、肝癌細胞轉移抑制及治療腎炎、胰腺炎等，其應用前景廣闊。 3HNE的體外表達研究 體外篩選HNE抑制劑使用的酶絕大局部是從人白細胞中提取獲得，由于提取本錢昂貴，得率不高，且血液制品缺乏平安性，迫切需要尋找替代的酶生產方法。為了更快速、有效、大量的篩選HNE抑制劑，有人進展了H

15、NE的體外表達純化。 3.1全酶表達 由于HNE對大腸桿菌細胞壁組分具有降解作用以及在T7啟動子表達系統(tǒng)中難以獲得有活性的 HNE，酶完整cDNA克隆表達研究采用了M13噬菌體系統(tǒng)。HNE的cDNA位于人白細胞株cDNA文庫中，由編碼8個氨基酸殘基的IL-2前導肽DNA以及 238個氨基酸殘基的HNE前體DNA組成，以可溶性蛋白的形式表達，并可以通過賴氨酞肽酶切割獲得有活性的HNE。表達純化后所得HNE經一系列酶活性檢測和與抑制劑反響的檢測，說明其性質與天然HNE極其相似見表1)。這種表達系統(tǒng)中，每毫升發(fā)酵液可以產生5gHNE34天，與天然 HNE提取方法相比并沒有多大優(yōu)勢每毫升全血中可得2.

16、36g HNE。 表1重組HNE和天然HNE與抑制劑的結合活性比較Tab 1.The paration of bining activities of rebinantHNE and native HNE with inhibitors 抑制率(%)抑制劑(0.1g/L) 重組HNE 天然HNE胰蛋白酶抑制劑 93 731-抗蛋白酶 78 47糜蛋白酶抑制劑 0 03.2酶催化構造域表達 MMPs的催化構造域通常和其完整蛋白酶具有一樣的催化效果，并且可被用來進展其抑制劑的篩選，這就使單獨表達酶催化構造域多肽片段，以實現(xiàn)高通量篩選藥物具有可行性。另外，采用催化構造域單獨作用，還具有比全酶更高的穩(wěn)定性，可能是因為缺失了C端自我降解構造的緣故。 HNE催化構造域Phe100-Gly263片段DNA是缺失前導構造和血液結合素樣構造的平頭末端蛋白 DNA序列，以pGEME*質粒為載體，在大腸桿菌中表達，經過復性、提取純化后獲得的每升菌液可產生蛋白量約為23 mg比天然蛋白酶提取法及全酶表達法的產率大大提高。蛋白幾乎全部存在于包含體中，經上柱純化，并在Ca2+、Zn2+存在下稀釋