人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶及其抑制劑研究報(bào)告

1、.1人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶及其抑制劑研究人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(human neutrophi l elastase，HNE)在機(jī)體各種炎癥反響、組織損傷重構(gòu)如肺炎、成人呼吸窘迫綜合征、肺纖維化、急慢性肺損傷、肺水腫、動(dòng)脈粥樣硬化、硬皮病等病理過程中起重要作用，并且具有促進(jìn)病毒、細(xì)菌的侵人及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。炎癥機(jī)制研究顯示，體該酶及其源性抑制劑的平衡失調(diào)可導(dǎo)致組織基質(zhì)降解和炎癥的惡化。目前，國外用HNE抑制劑來治療這一類炎癥疾病的研究非常廣泛，并已成功開發(fā)出第一個(gè)以抑制HNE為治療途徑的上市藥物西維來司鈉sivelestat sodium hydrate，從而促進(jìn)了HNE抑制劑的研究與開發(fā)。

2、 1BM的生理、病理作用及構(gòu)造特征 HNE，又稱人白細(xì)胞彈性蛋白酶human leukocyte elastase，IRE，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶類matri* metalloproteinases,MMPs，即MMP-12,是一種金屬離子依賴性基質(zhì)降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+ 離子的存在才具有酶活性，其底物類型非常廣泛，幾乎可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的所有蛋白。白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、肥大細(xì)胞都存在著這種酶，中性粒細(xì)胞中其含量很高，大約每106個(gè)細(xì)胞中含有HNE的總量為 3g。生理?xiàng)l件下，HNE可以協(xié)助去除異源性物質(zhì)，促進(jìn)吞噬細(xì)胞消除有害病菌，并幫助消化受損組織，有助于傷口的愈合與組織再生。而HNE過量

3、表達(dá)則會(huì)對(duì)機(jī)體組織、基質(zhì)造成危害，表現(xiàn)為破壞血管壁組分，使中性粒細(xì)胞更容易滲出血管并向炎癥部位趨化集中及釋放IL-8、TNF-等炎癥因子；它還能降解細(xì)胞基質(zhì)，催化caspase 3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道，HNE還能增強(qiáng)病毒、細(xì)菌及癌細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的黏附能力，促進(jìn)微生物的入侵及癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。 HNE存在于中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是由 218個(gè)氨基酸組成的單一肽鏈，分子質(zhì)量大約25.9 kD，含4個(gè)二硫鍵，是絲氨酸蛋白酶家族一員，因此與其他絲氨酸家族蛋白酶具有30%40的同源性，最適pH值接近中性。HNE的基因位于19號(hào)染色體的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒細(xì)胞中并無HNE

4、的mRNA表達(dá)，說明此種酶只在未成熟的骨髓細(xì)胞中合成。酶的催化中心由 His 41、Asp 88和Ser 173三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，空間位置相互靠近，均由發(fā)夾構(gòu)造延伸到蛋白外表，其中 Ser殘基側(cè)鏈上羥基具有很高的親核性，容易結(jié)合不帶電的小分子氨基酸，如Val、Ala、Leu、Met等。 2BM抑制劑 HNE對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生各種病理作用，故關(guān)于其抑制劑的研究也受到廣泛關(guān)注，其中包括源性抑制劑、合成的外源性抑制劑蛋白類、擬肽和雜環(huán)化合物以及天然提取物等。 2.1源性抑制劑 人體存在許多種針對(duì)HNE的快速反響抑制蛋白，每一種蛋白存在于不同的生理部位而發(fā)揮不同的作用。選擇性HNE抑制劑Elafin存在于

5、皮膚及上皮組織中，分子質(zhì)量為7 kD，是酸穩(wěn)定性多膚；1- 抗蛋白酶1-antiprotease在血漿中具高濃度，并由此進(jìn)入組織發(fā)揮作用。上述源性抑制劑包括2- 巨球蛋白均為分泌性彈性蛋白酶抑制劑，其中 1-抗蛋白酶被認(rèn)為是在體各種臟器中起主導(dǎo)作用的源性HNE抑制劑。 2.1.11-抗蛋白酶它在許多生理、病理過程中如血液凝結(jié)、纖維蛋白溶解、炎癥等起調(diào)節(jié)蛋白分解的作用，并且對(duì)防止蛋白水解性組織損傷起重要作用。據(jù)報(bào)道先天性1-抗蛋白酶缺損極易引發(fā)肺氣腫和自發(fā)性肺纖維化idiopathic pulmonary fibrosis。1-抗蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，存在于血漿中，平均分子質(zhì)量

6、約50 kD，含有3 個(gè)片層構(gòu)造和假設(shè)干螺旋構(gòu)造，其中Met 358決定了它對(duì)HNE的抑制特異性，HNE與之結(jié)合后形成穩(wěn)定酯構(gòu)造，致使酶的活性中心構(gòu)象發(fā)生改變，不能去酞基化，這種抑制機(jī)制被稱為自殺性底物抑制。對(duì)1-抗蛋白酶的構(gòu)造研究顯示，它和其他HNE拮抗劑一樣，在酶結(jié)合位點(diǎn)或附近的Met上的硫醚鍵對(duì)化學(xué)氧化非常敏感，一旦Met被亞砜化后，1-抗蛋白酶即失活。 在體氧化自由基的增多是造成這種源性抑制劑失活的主要原因，中性粒細(xì)胞分泌出的髓過氧化物酶通過過氧化酶-過氧化氫-鹵化物系統(tǒng)使1_ 抗蛋白酶氧化失活，從而到達(dá)HNE活性增高，促進(jìn)細(xì)胞滲透轉(zhuǎn)移的目的。在體外試驗(yàn)中，中性粒細(xì)胞中的過氧化物系統(tǒng)可

7、使1-抗蛋白酶在10秒之失活50%，20秒之完全失活。 2.1.2Elafin它是一種被研究得比較深入的源性抑制劑，又稱為彈力素，屬于Trappin-2基因家族。它在多種上皮組織中表達(dá)，如毛囊、食管、陰道和口腔中等。在人皮膚正常組織中沒有表達(dá)，但在皮膚受外傷和牛皮癬等炎癥反響時(shí)則會(huì)強(qiáng)烈地表達(dá)。翻譯后的elafin蛋白質(zhì)前體是由117個(gè)氨基酸組成的多膚鏈12.3 kD，包括由22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)膚，其活性部位在C端，以4個(gè)二硫鍵為中心。在切除了信號(hào)肽后，該蛋白質(zhì)變成分子質(zhì)量為9.9 kD的成熟蛋白，即elafin。研究說明，在HNE誘導(dǎo)的急性肺損傷倉鼠模型中，于誘導(dǎo)前1小時(shí)經(jīng)氣管給予 elaf

8、in，其抑制HNE的IC50為8.1g/kg。 目前對(duì)elafin的研究著眼于其在動(dòng)脈粥樣硬化、心臟移植后冠狀動(dòng)脈疾病、心肌壞死以及呼吸道炎癥等方面的治療效果。異體心臟移植后冠狀動(dòng)脈疾病及其后遺癥是器官承受者患有的主要并發(fā)癥，發(fā)病原理與冠狀動(dòng)脈血管壁增厚有關(guān)，而由HNE活性升高引起的彈性蛋白降解沉積、IL-1活性增高、纖維連接蛋白合成、平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等在冠狀動(dòng)脈血管壁增厚過程中起關(guān)鍵作用。在家兔心臟移植模型中，給予重組人elafin可以有效的降低HNE活性，形態(tài)學(xué)、免疫組化和生化分析說明，與對(duì)照組相比， elafin給藥組家兔的血管壁增厚程度降低 70%。將elafin基因引入嫁接后的血管中，

9、可以有效減少血管嫁接早期的炎癥發(fā)生和減少細(xì)胞外彈性蛋白量；雖然elafin會(huì)導(dǎo)致血管膜形成減緩，總體上仍具有防止血管粥樣硬化惡化的效果。 2.2外源性抑制劑 對(duì)合成類HNE抑制劑的研究已有約20年歷史，其間涌現(xiàn)出大批很有前景的小分子合成物。然而到目前為止，僅有西維來司鈉作為治療全身性炎癥反響綜合征systemic inflammatory response syndrome，SIRS的HNE特異性抑制劑上市。合成類 HNE抑制劑又包括蛋白類、三肽或四肽和氮雜環(huán)類化合物等，此外，有報(bào)道稱酰胺類抗生素和苯基丁氮酮類上市老藥對(duì)HNE也有抑制作用。 2.2.1蛋白類抑制劑采用分子生物學(xué)的方法，通過對(duì)酶

10、與多肽類抑制劑相互作用的分析研究，可以提醒兩種分子的識(shí)別方式，從而為蛋白類抑制劑藥物設(shè)計(jì)提供思路。在蛋白類抑制劑的研究中，采用構(gòu)建的限制性構(gòu)造組合膚庫，篩選HNE的特異底物，這種方法篩選得到的抑制劑其優(yōu)點(diǎn)在于分子質(zhì)量低，且特異性高。有文獻(xiàn)報(bào)道，從此多肽庫中篩選得到的HNE抑制劑在序列上具有很高的同源性，并且對(duì)其重組蛋白的分析說明它們均具有HNE抑制作用，抑制常數(shù)Ki可達(dá)65 nmol/L。 在對(duì)天然HNE抑制劑的研究過程中發(fā)現(xiàn)，每種抑制劑與HNE活性中心結(jié)合的作用位點(diǎn)P1幾乎都在一個(gè)延伸出來的環(huán)上，而P1位點(diǎn)上的氨基酸殘基主要決定抑制劑的抑制特異性。HNE容易與P1 位點(diǎn)上有小烷基側(cè)鏈的底物結(jié)

11、合，尤其易與Val殘基結(jié)合。構(gòu)建的多肽按照天然底物的構(gòu)造形式，形成環(huán)狀構(gòu)造，可將P1位點(diǎn)遞呈到酶的活性中心。在此構(gòu)造根底上，對(duì)P1和其他位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)展修飾，使之進(jìn)一步成為對(duì)HNE具有高度選擇性的化合物。據(jù)報(bào)道，限制性構(gòu)造組合肽庫同樣可以用來篩選-胰糜蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶等絲氨酸蛋白酶的抑制劑，并且研究發(fā)現(xiàn)這幾種酶的活性中心具有一定的同源性，因此篩選出的大局部抑制劑可以同時(shí)抑制這一類酶。 2.2.2西維來司鈉2002年11月，氮雜環(huán)類化合物西維來司鈉商品名Elaspol在日本上市，其化學(xué)名為N-2-4-(2，2-二甲基丙酸基苯磺酰氨基丁氨基乙酸鈉，分子質(zhì)量為528.51 D，適應(yīng)證是全身

12、性炎癥反響綜合征和急性肺損傷，且正在進(jìn)展用于呼吸窘迫綜合征治療的n期臨床試驗(yàn)。它可改善肺損傷病人的呼吸功能，縮短使用呼吸器的時(shí)間，降低安裝呼吸器引起的壓力性損傷及呼吸道感染的并發(fā)率，減輕或緩解全身性炎癥反響綜合征及特發(fā)性肺纖維化等引發(fā)的急性肺損傷；另外，它還能使病人盡早脫離危險(xiǎn)期。由于本品可治療與非典型性肺炎臨床表現(xiàn)密切相關(guān)的病癥，我國已于2003年5月批準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)展臨床試驗(yàn)，它是我國發(fā)生非典型性肺炎后首個(gè)通過“綠色通道加快批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物。 以琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-N-對(duì)硝基苯胺為底物的酶抑制實(shí)驗(yàn)說明，西維來司鈉對(duì)HNE的IC50為 (0.0440.003)mol/L,

13、抑制常數(shù)Ki為(0.200.02) mol/L。西維來司鈉是HIVE的競爭性抑制劑，并且具有很高的專一性，即使在濃度為100mol/L時(shí)，它對(duì)胰蛋白酶、凝血酶、纖溶酶、激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G等仍沒有抑制作用，對(duì)豬胰彈性蛋白酶僅有很微弱的抑制作用，其IC50是對(duì) HNE的IC50的130倍。而它對(duì)各種試驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠、倉鼠、大鼠、狗及家兔的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶都有抑制作用，且酶學(xué)反響測得的其IC50甚至比對(duì) HIVE的IC50更小。 西維來司鈉在各種肺部疾病如肺纖維化、急慢性肺損傷、肺出血、肺炎、肺癌等的動(dòng)物及體外模型中均表現(xiàn)出良好的藥理作用。給伯萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型靜脈

14、注射本品，可以減少成纖維細(xì)胞的生成，降低中性粒細(xì)胞在炎癥部位的聚集數(shù)量以及炎癥因子如IL-1、血小板源生長因子PDGF、巨嗜細(xì)胞炎癥蛋白-2、胰島素樣生長因子A等的 mRNA表達(dá)。從總體藥效來看，與對(duì)照組模型相比，西維來司他鈉可以明顯改善肺纖維化程度，并主要作用于發(fā)病急性期。 目前西維來司鈉的藥效研究已進(jìn)一步擴(kuò)展到用于肺癌、肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制及治療腎炎、胰腺炎等，其應(yīng)用前景廣闊。 3HNE的體外表達(dá)研究 體外篩選HNE抑制劑使用的酶絕大局部是從人白細(xì)胞中提取獲得，由于提取本錢昂貴，得率不高，且血液制品缺乏平安性，迫切需要尋找替代的酶生產(chǎn)方法。為了更快速、有效、大量的篩選HNE抑制劑，有人進(jìn)展了H

15、NE的體外表達(dá)純化。 3.1全酶表達(dá) 由于HNE對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁組分具有降解作用以及在T7啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)中難以獲得有活性的 HNE，酶完整cDNA克隆表達(dá)研究采用了M13噬菌體系統(tǒng)。HNE的cDNA位于人白細(xì)胞株cDNA文庫中，由編碼8個(gè)氨基酸殘基的IL-2前導(dǎo)肽DNA以及 238個(gè)氨基酸殘基的HNE前體DNA組成，以可溶性蛋白的形式表達(dá)，并可以通過賴氨酞肽酶切割獲得有活性的HNE。表達(dá)純化后所得HNE經(jīng)一系列酶活性檢測和與抑制劑反響的檢測，說明其性質(zhì)與天然HNE極其相似見表1)。這種表達(dá)系統(tǒng)中，每毫升發(fā)酵液可以產(chǎn)生5gHNE34天，與天然 HNE提取方法相比并沒有多大優(yōu)勢每毫升全血中可得2.

16、36g HNE。 表1重組HNE和天然HNE與抑制劑的結(jié)合活性比較Tab 1.The paration of bining activities of rebinantHNE and native HNE with inhibitors 抑制率(%)抑制劑(0.1g/L) 重組HNE 天然HNE胰蛋白酶抑制劑 93 731-抗蛋白酶 78 47糜蛋白酶抑制劑 0 03.2酶催化構(gòu)造域表達(dá) MMPs的催化構(gòu)造域通常和其完整蛋白酶具有一樣的催化效果，并且可被用來進(jìn)展其抑制劑的篩選，這就使單獨(dú)表達(dá)酶催化構(gòu)造域多肽片段，以實(shí)現(xiàn)高通量篩選藥物具有可行性。另外，采用催化構(gòu)造域單獨(dú)作用，還具有比全酶更高的穩(wěn)定性，可能是因?yàn)槿笔Я薈端自我降解構(gòu)造的緣故。 HNE催化構(gòu)造域Phe100-Gly263片段DNA是缺失前導(dǎo)構(gòu)造和血液結(jié)合素樣構(gòu)造的平頭末端蛋白 DNA序列，以pGEME*質(zhì)粒為載體，在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)過復(fù)性、提取純化后獲得的每升菌液可產(chǎn)生蛋白量約為23 mg比天然蛋白酶提取法及全酶表達(dá)法的產(chǎn)率大大提高。蛋白幾乎全部存在于包含體中，經(jīng)上柱純化，并在Ca2+、Zn2+存在下稀釋