液相色譜培訓(xùn)講義課件

1、液相色譜培訓(xùn)講義北京東西分析儀器有限公司主要內(nèi)容高效液相色譜的基礎(chǔ)知識(shí)高效液相色譜系統(tǒng)固定相和流動(dòng)相LC-5500的使用、維護(hù)及應(yīng)用液相色譜分析中的樣品前處理高效液相色譜的基礎(chǔ)知識(shí)液相色譜培訓(xùn)（一）色譜色譜法 又叫色層法、層析法，其本質(zhì)是一種分離分析方法 色譜法是利用混合物中各組分在兩相間分布系數(shù)的差異，在兩相相對(duì)移動(dòng)過(guò)程中，各物質(zhì)在兩相間反復(fù)多次分配，從而使各組分得到分離的方法色譜 目前最有效的分離方法色譜的分類(lèi)按流動(dòng)相的物態(tài)分: 氣相色譜(Gas Chromatography, GC) 用氣體作為流動(dòng)相(又叫載氣) 液相色譜(Liquid Chromatography, LC) 用液體作為

2、流動(dòng)相(又叫洗脫劑)液相色譜發(fā)展簡(jiǎn)史1903年：俄國(guó)植物學(xué)家Tswett提出了應(yīng)用吸附學(xué)原理分離植物色素的新方法，標(biāo)志這現(xiàn)代色譜學(xué)的開(kāi)始1931年：Kuhn等以粉碎的碳酸鈣裝填色譜柱，成功地從蛋黃中分離出植物葉黃素，也證實(shí)了色譜法可以用于制備分離1941年：Martin等采用水分飽和的硅膠為固定相，以含乙醇的氯仿為流動(dòng)相，分離了乙?；被?，這是分配色譜的首次應(yīng)用20世紀(jì)60年代：高效液相色譜得到普及應(yīng)用1975年：美國(guó)Dow Chemical公司Small等研制成功了采用電導(dǎo)檢測(cè)器的高效液相色譜儀，這種方法稱為離子色譜法（IC），擴(kuò)展了高效液相色譜的領(lǐng)域。近年來(lái)：超高壓液相色譜（UPLC）問(wèn)

3、世，使得液相色譜應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛茨維特實(shí)驗(yàn)的原形1903年Tswett用右邊圖示的實(shí)驗(yàn)裝置，使用液體淋洗的辦法實(shí)現(xiàn)了多種物質(zhì)的分離從而確立了色譜分析法。從此這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法就成為： 經(jīng)典液相色譜法 時(shí)至今日這種方法還被廣泛地應(yīng)用著隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)工作者改進(jìn)了液相色譜柱的填料，從而就出現(xiàn)了高效液相色譜分析。幾種英文縮寫(xiě)的解釋：HPLCHigh Performance Liquid ChromatographyHPLCHigh Pressure Liquid Chromatography高效液相色譜 HPLC (High Performance Liquid Chromatography )以

4、氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法。是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段： o高性能色譜柱，高精度輸液泵，高靈敏度檢測(cè)器 廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域: o醫(yī)藥，環(huán)保，石化，生命科學(xué)，食品工業(yè)，農(nóng)業(yè)HPLC的分離原理高效液相色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相(stationary phase)時(shí)，由于與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、離子交換、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。流動(dòng)相色譜分離樣品的過(guò)程HPLC的特點(diǎn)“三高” “一快” “一廣”高柱效高靈敏度高選擇

5、性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè) 主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別分析對(duì)象 GC：可分析能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品 HPLC：可分析溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性 和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性 差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)流動(dòng)相 GC：流動(dòng)相為氣體 HPLC：流動(dòng)相為液體 HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典LCHPLC色譜柱：柱長(zhǎng)10200cm，內(nèi)徑1050mm色譜柱：柱長(zhǎng)1025cm，內(nèi)徑210mm常壓或減壓高壓，4050MPa填料顆粒大，75600m（20030目）填料顆粒小，25

6、0m（2500300目）柱效低，2050塊/m柱效高，4000060000塊/m分析速度慢，120h分析速度快，0.051.0h色譜柱只用一次色譜柱可重復(fù)多次使用不能在線檢測(cè)能在線檢測(cè)基本概念和術(shù)語(yǔ)色譜圖和峰參數(shù)色譜圖(chromatogram)-樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。基線(base line)-經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。噪音(noise)-基線信號(hào)的波動(dòng)。漂移(drift)-基線隨時(shí)間的緩緩變化。色譜峰(peak)-組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線

7、。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）不對(duì)稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見(jiàn)。檢測(cè)器響應(yīng)保留時(shí)間和峰形檢測(cè)器響應(yīng)保留時(shí)間和峰形檢測(cè)器響應(yīng)保留時(shí)間和峰形色譜圖基底基線色譜峰峰面積峰高拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色譜峰的對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱因子(symmetry factor)或不對(duì)稱因子(asymmetry factor)。中國(guó)藥典規(guī)定T應(yīng)為0.951.05。T0.95為前延峰，T1.05為拖尾峰。峰底基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。峰高(peak height，h)-峰的

8、最高點(diǎn)至峰底的距離。標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，)-正態(tài)分布曲線x1時(shí)（拐點(diǎn)）的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說(shuō)明組分在流出色譜柱過(guò)程中的分散程度。小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。峰寬（peak width，W)-峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與峰底的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W4半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。Wh/22.355峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積。基本概念和術(shù)語(yǔ)基本概念和術(shù)語(yǔ)定性參數(shù)（保留值）死時(shí)間(dead time，t0)

9、-不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過(guò)色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來(lái)測(cè)定死時(shí)間。死體積(dead volume，V0)-由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流通池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流通池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過(guò)程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0Ft0（F為流速）保留時(shí)間(retention time，tR)-從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。保留體積(retention volume，VR)-從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分在柱后出現(xiàn)濃

10、度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VRFtR柱效參數(shù)理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)-用于定量表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）。N取決于固定相的種類(lèi)、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的種類(lèi)和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計(jì)算理論塔板數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定，尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。 N與柱長(zhǎng)成正比，柱越長(zhǎng)，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則表示柱長(zhǎng)為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以

11、上。）若用調(diào)整保留時(shí)間(tR)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效)。理論塔板高度(theoretical plate height，H)-每單位柱長(zhǎng)的方差。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長(zhǎng)L和理論塔板數(shù)計(jì)算。基本概念和術(shù)語(yǔ)基本概念和術(shù)語(yǔ)相平衡參數(shù)分配系數(shù)(distribution coefficient，K)-在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。即， K = Cs / Cm 分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))， 凝膠色

12、譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來(lái)表示。 在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無(wú)關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。 在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的

13、前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的?；靖拍詈托g(shù)語(yǔ)容量因子(capacity factor，k)-化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。 容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間（tR）是不保留組分保留時(shí)間（t0）的幾倍。k0時(shí)， 化合物全部存在于流動(dòng)相中，在固定相中不保留， tR 0；k越大，說(shuō)明固定相對(duì)此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)。 容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性

14、質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無(wú)關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于tR 、t0較Vs、Vm易于測(cè)定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。選擇性因子(selectivity factor，)-相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。又稱為相對(duì)保留時(shí)間（美國(guó)藥典）。 要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無(wú)關(guān)。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異?；靖拍詈托g(shù)語(yǔ)分離參數(shù)分離度(resolution，R)-相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的

15、分離程度。當(dāng)W1W2時(shí)，R1。當(dāng)R1時(shí)，稱為4分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R1.5時(shí)，稱為6分離，裸露峰面積為99.7%。R1.5稱為完全分離。 中國(guó)藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5。 提高分離度有三種途徑：增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加選擇性。當(dāng)1時(shí)，R0，無(wú)論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來(lái)改變選擇性：a. 改變流動(dòng)相的組成及pH值； b. 改變柱溫； c. 改變固定相。改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來(lái)實(shí)現(xiàn)。k趨于0時(shí)，R也趨于0；

16、k增大，R也增大。但k不能太大，否則不但分離時(shí)間延長(zhǎng)，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般k在110范圍內(nèi)，最好為25，窄徑柱可更小些。R = 1R = 1.5色譜分離的理論 色譜理論有平衡色譜理論；塔板理論；速率理論等理論。下面對(duì)塔板理論和速率理論作簡(jiǎn)單的介紹。塔板理論(Tower plank Theories)塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過(guò)程看成在分餾塔中的分餾過(guò)程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過(guò)程。塔板理論的基本假設(shè)為： 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)

17、到分配平衡。 樣品加在第0號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。 流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無(wú)關(guān)。雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過(guò)程不符，如色譜過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，很難達(dá)到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評(píng)價(jià)色譜柱柱效。 理論塔板數(shù) 色譜柱效能 描述當(dāng)溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時(shí)譜帶展寬速率理論塔板等效高度有效理論塔板數(shù)塔板理論(Tower plank Theories)速率理論(Velocity Theories)1956年荷蘭學(xué)者Van De

18、emter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來(lái)，提出了色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)理論速率理論。它把色譜過(guò)程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過(guò)程，研究過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響 速率理論(Velocity Theories)H = A + B/u + Cgu + CluHuB/uCuAu最佳A渦流擴(kuò)散項(xiàng)B分子擴(kuò)散項(xiàng)Cg固定相傳質(zhì)阻抗Cl流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗高效液相色譜的分類(lèi)按色譜過(guò)程的分離機(jī)制，可將高效液相色譜分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、離子對(duì)色譜和體積排阻色譜等類(lèi)別根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別，可分為正相色譜和反相色譜兩種模式。固定相極性大于流動(dòng)相極性時(shí)，稱為正相色譜（N

19、P）；反之，稱為反相色譜（RP）正相高效液相色譜以極性的親水性填料作固定相（如羥基柱、氨基柱、氰基柱），以非極性的疏水性溶劑或混合物作流動(dòng)相（如己烷）的高效液相色譜正相高效液相色譜的流動(dòng)相：常用己烷，環(huán)己烷作基礎(chǔ)溶劑，加二氯甲烷、短鏈醇、四氫呋喃調(diào)節(jié)極性應(yīng)用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物，如甾醇類(lèi)、類(lèi)脂化合物、磷脂化合物、脂肪酸及其它有機(jī)物反相高效液相色譜以強(qiáng)疏水性的填料作固定相（如硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相），以可以和水混溶的有機(jī)溶劑做流動(dòng)相（如甲醇、乙腈）的高效液相色譜反相高效液相色譜的流動(dòng)相：高純度的水，甲醇，乙腈，一定pH值的緩沖液應(yīng)用十分廣泛，占高效液相色譜的70%

20、80%，從一般小分子有機(jī)物到藥物、農(nóng)藥、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量不大的蛋白質(zhì)（50kD）的分析均可應(yīng)用高效液相色譜流程圖高壓泵進(jìn)樣器檢測(cè)器色譜工作站色譜柱儲(chǔ)液瓶色譜分離樣品的過(guò)程色 譜 柱檢測(cè)器色 譜 圖時(shí)刻A時(shí)刻B時(shí)刻C時(shí)刻D時(shí)刻E時(shí)刻F進(jìn)樣色譜圖的作用 說(shuō)明樣品中的組分?jǐn)?shù) 根據(jù)保留時(shí)間值定性 根據(jù)峰面積（峰高）定量 評(píng)價(jià)柱效及分離情況定性和定量方法死時(shí)間t0，保留時(shí)間tR峰高h(yuǎn)，峰面積A基線峰底色譜峰峰高峰面積利用保留值定性在液相色譜中，組分的保留行為不僅與固定相有關(guān)，還與流動(dòng)相的種類(lèi)、組成有關(guān)在液相色譜中主要是用與已知物對(duì)照的方法定性，改變條件進(jìn)一步判斷利用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)只能作為參考利用

21、三維圖譜進(jìn)行定性，可靠性大大增加用保留時(shí)間定性的譜圖對(duì)比三聚氰胺標(biāo)樣蛋白粉樣品定量方法峰高和峰面積法定量，主要有四種定量方法 歸一化法 內(nèi)標(biāo)法 外標(biāo)法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法 內(nèi)加法外標(biāo)法液相最常用的定量方法峰高法和峰面積法的選擇主要決定于檢測(cè)器的線性范圍、峰高和峰面積測(cè)量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。歸一化法最好用峰面積法，其余方法峰高和峰面積都可使用分離度較好，色譜峰形較好，峰面積可以準(zhǔn)確測(cè)量時(shí)，用峰面積定量為好，特別是HPLC使用多元梯度時(shí)，最好用峰面積定量分離度不好、色譜峰形不好時(shí)，用峰高法為好保留時(shí)間短的用峰高法，長(zhǎng)的用峰面積法高效液相色譜系統(tǒng)液相色譜培訓(xùn)（二）高效液相色譜流程圖高壓泵進(jìn)樣器檢測(cè)器色譜工作站

22、色譜柱儲(chǔ)液瓶一個(gè)存放流動(dòng)相的容器。其結(jié)構(gòu)材料必須對(duì)流動(dòng)相是化學(xué)惰性的，常用的溶劑儲(chǔ)液瓶的材料應(yīng)耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料、特種塑料聚醚醚酮(PEEK)或聚四氟乙烯襯里不銹鋼容器等，貯液罐容積一般為0.52 L 儲(chǔ)液瓶輸液系統(tǒng)功能：溶劑輸送目標(biāo)：穩(wěn)定準(zhǔn)確重要指標(biāo)：耐壓能力壓力脈動(dòng)流量精密度流量準(zhǔn)確性高壓輸液泵柱雙柱塞往復(fù)式并聯(lián)泵柱雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器和手動(dòng)進(jìn)樣器原理：六通閥手動(dòng)進(jìn)樣器六通閥一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國(guó)Rheodyne公司的7725和7725i型最常見(jiàn)），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。耐高壓（3540MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性

23、好，操作方便 分離系統(tǒng)功能：組分分離目標(biāo)：分辨力強(qiáng)效率高色譜柱液相色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，是分析好壞、成敗的關(guān)鍵鍵合相色譜柱鍵合相:反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅膠、 -NH2、 -CN、-OH其它 (手性柱, 離子交換柱): 10%反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18 和 C8 在反相色譜中應(yīng)用得最為廣泛。檢測(cè)器功能：檢測(cè)組分濃度目標(biāo)：準(zhǔn)確檢出限低重要指標(biāo)：噪聲、漂移、線性、檢出限紫外檢測(cè)器（包括二極管陣列檢測(cè)器）熒光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選

24、擇性吸收定量基礎(chǔ)：朗伯-比耳定律，ACL優(yōu)點(diǎn)： 1）靈敏度高 2）對(duì)溫度和流速不敏感 3）可用于梯度洗提缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定有紫外吸收的物質(zhì)紫外檢測(cè)器 樣品池二極管陣列光柵D2 / W 燈每一組分可在每一波長(zhǎng)處得到一吸光度值二極管陣列檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器1）采集三維譜圖2）峰純度檢驗(yàn)3）光譜庫(kù)檢索4）可以發(fā)現(xiàn)單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)未測(cè)到的峰二極管陣列檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度，所以紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器可以測(cè)定大多數(shù)的化合物，是目前實(shí)驗(yàn)室中使用最多的檢測(cè)器 -多數(shù)公司售出的檢測(cè)器中75%以上是吸光度檢測(cè)器（其中50%以上是紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，25%是PDA）紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器原理：基于被分析組

25、分發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)： 1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測(cè)器之一 2）選擇性好 3）對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可檢測(cè)物質(zhì)：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、兒茶酚氨等（具有對(duì)稱共軛體系）熒光檢測(cè)器原理：連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率來(lái)測(cè)定試樣中各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測(cè)器，缺點(diǎn)：1）對(duì)溫度變化敏感2）對(duì)溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測(cè)3）屬于中等靈敏度的檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器原理：根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化來(lái)測(cè)定電離物質(zhì)含量。廣泛應(yīng)用于離子色譜法優(yōu)點(diǎn)：對(duì)流動(dòng)相流速和壓力的改變不敏感，可用于梯度洗脫缺點(diǎn)：對(duì)溫度變化敏感（每升高1

26、度，電導(dǎo)率增加2%-2.5%)主要用于離子色譜檢測(cè)水溶性無(wú)機(jī)和有機(jī)離子電導(dǎo)檢測(cè)器蒸發(fā)激光光散射檢測(cè)器（ELSD）通用型檢測(cè)器（適合于揮發(fā)性比流動(dòng)相低的任何組分）；響應(yīng)值與組分質(zhì)量有關(guān)；可用于梯度洗脫HPLC柱噴霧氣體蒸發(fā)漂移管激光光源樣品液滴光二極管檢測(cè)器散射室工作站數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)功能：采集處理數(shù)據(jù)目標(biāo)：使用便捷功能完善梯度洗脫HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式 等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品 梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差

27、異較大的復(fù)雜樣品 比例閥檢測(cè)器進(jìn)樣器ABCD色譜柱高壓輸液泵低壓梯度阻尼器混合器高壓輸液泵檢測(cè)器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器高壓輸液泵高壓梯度梯度洗脫梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)縮短分析時(shí)間增加分離能力提高檢測(cè)靈敏度缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復(fù)性較低高效液相色譜的配件管路與連接件脫氣裝置：在線脫氣機(jī)或超聲波清洗器過(guò)濾器：溶劑過(guò)濾器和針筒式過(guò)濾器進(jìn)樣器：平頭進(jìn)樣器不同材質(zhì)的管路不銹鋼管：耐腐蝕性好，有精密的同軸度，一般用于高壓部分聚合物管：用在液相色譜系統(tǒng)中從儲(chǔ)液瓶到泵、檢測(cè)器出口以后和進(jìn)樣器排液口等低壓部分PEEK（聚醚醚酮）管：是一種耐高溫、高性能的工程塑料，具有良

28、好的惰性，適宜于生物樣品的分離分析液路連接件連接件也稱接頭一般可分為兩種：高壓接頭和低壓接頭 高壓接頭采用不銹鋼材質(zhì) 低壓接頭采用高聚物材質(zhì)連接件主要有卡套和空心螺釘液路連接密封示意圖 液路連接裝配不合適的示意圖脫氣裝置超聲波清洗器通過(guò)超聲波作用使流動(dòng)相中的氣泡排除，超聲脫氣效率只有2030左右在線脫氣機(jī)脫氣效果好，脫氣效率大于70，在線脫氣機(jī)使用方便、省事，尤其是在作梯度洗脫時(shí)最好用在線脫氣機(jī)。過(guò)濾裝置溶劑過(guò)濾器為了除去流動(dòng)相中的雜質(zhì)，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾溶劑過(guò)濾器要配濾膜（有機(jī)系和水系，規(guī)格0.45m或更小孔徑的濾膜）針筒式過(guò)濾器樣品溶液在進(jìn)入色譜系統(tǒng)前必須經(jīng)過(guò)針筒式過(guò)濾器針筒式過(guò)濾器也分為有

29、機(jī)系和水系，規(guī)格0.45m或更小孔徑的進(jìn)樣器液相色譜的進(jìn)樣器必須是平頭進(jìn)樣器常配的進(jìn)樣器規(guī)格為10、25、50、100 L最常使用的為50 L的進(jìn)樣器LC-5500和LC-5510高效液相色譜儀介紹LC-5500高效液相色譜儀LC-5500高壓輸液泵P-101型高壓液相平流泵由泵體、過(guò)濾器、緩沖器、步進(jìn)電機(jī)、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器、控制電路板、鍵盤(pán)以及液晶顯示器等部件構(gòu)成 LC-5500高壓輸液泵技術(shù)指標(biāo)工作壓力：040MPa流量范圍：0.015.0mL/min流量穩(wěn)定性：1壓力脈動(dòng)： 1LC-5500高壓輸液泵主要特點(diǎn)采用雙柱塞交替輸液吸液，特殊設(shè)計(jì)的非圓凸輪運(yùn)動(dòng)曲線，保證輸出液體流速穩(wěn)定精密電機(jī)及

30、電路設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)流量控制和流速的穩(wěn)定性壓力傳感器避免了過(guò)壓對(duì)色譜柱和泵的意外損害性能良好的阻尼器有效消除了輸液脈沖采用LCD帶背光的顯示屏來(lái)顯示泵的設(shè)置參數(shù)和運(yùn)行參數(shù)。梯度洗脫流量程序智能化，流量準(zhǔn)確LC-5500高效液相色譜儀主機(jī)主機(jī)包括兩部分：柱溫箱紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器LC-5500柱溫箱技術(shù)指標(biāo)：溫度控制范圍：室溫1080溫度控制精度：1功能特點(diǎn)：控溫精度準(zhǔn)確更換色譜柱方便分析結(jié)果重現(xiàn)性好保證檢測(cè)穩(wěn)定性LC-5500紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器技術(shù)指標(biāo)：波長(zhǎng)范圍：190650nm波長(zhǎng)精度: 2nm 波長(zhǎng)重復(fù)性:優(yōu)于2nm基線噪聲：110-4AU基線漂移：510-4AU/h光譜帶寬：8nm流通池體積：5

31、ul最小檢測(cè)濃度：410-8g/mL (萘的甲醇溶液) LC-5500紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器功能特點(diǎn)：使用波長(zhǎng)范圍寬波長(zhǎng)精度準(zhǔn)確能夠?qū)崿F(xiàn)多波長(zhǎng)測(cè)定LC-5500工作站功能特點(diǎn)：具有儀器控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)；可進(jìn)行波長(zhǎng)程序控制可設(shè)定柱溫可對(duì)兩臺(tái)泵進(jìn)行程序控制，進(jìn)行梯度洗脫 LC-5510高效液相色譜儀LC-5510 在線脫氣機(jī)在線脫氣機(jī)主要由真空泵、脫氣膜管、傳感器、控制電路、真空腔等組成在線脫氣機(jī)的主要目的是脫除流動(dòng)相中的氣泡LC-5510高壓輸液泵技術(shù)指標(biāo)工作壓力：042MPa流量范圍：0.015.0mL/min流量穩(wěn)定性：1壓力脈動(dòng)： 1LC-5100高壓輸液泵主要特點(diǎn)采用雙柱塞交替輸

32、液吸液，特殊設(shè)計(jì)的非圓凸輪運(yùn)動(dòng)曲線，保證輸出液體流速穩(wěn)定精密電機(jī)及電路設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)流量控制和流速的穩(wěn)定性壓力傳感器避免了過(guò)壓對(duì)色譜柱和泵的意外損害性能良好的阻尼器有效消除了輸液脈沖采用LCD帶背光的顯示屏來(lái)顯示泵的設(shè)置參數(shù)和運(yùn)行參數(shù)。梯度洗脫流量程序智能化，流量準(zhǔn)確LC-5510柱溫箱技術(shù)指標(biāo)：溫度控制范圍：580溫度控制精度：0.2溫度設(shè)定值誤差： 0.5LC-5510柱溫箱功能特點(diǎn)：控溫精度準(zhǔn)確分析結(jié)果重現(xiàn)性好保證檢測(cè)穩(wěn)定性采用LCD帶背光的顯示屏來(lái)顯示柱溫的設(shè)置和運(yùn)行溫度既可升溫也可降溫，能滿足一些特殊用戶的需求LC-5510紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器技術(shù)指標(biāo)：波長(zhǎng)范圍：190650nm波長(zhǎng)精度:

33、 0.2nm 波長(zhǎng)重復(fù)性:優(yōu)于0.2nm基線噪聲：610-5AU（動(dòng)態(tài)，254nm）基線漂移：2.510-4AU/h（動(dòng)態(tài)，254nm）光譜帶寬：8nm流通池體積：5ul最小檢測(cè)濃度：110-8g/mL (萘的甲醇溶液) LC-5510紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器功能特點(diǎn)：使用波長(zhǎng)范圍寬波長(zhǎng)精度高噪聲低漂移小可用汞燈自動(dòng)校正波長(zhǎng)采用LCD帶背光的顯示屏來(lái)顯示波長(zhǎng)的設(shè)置參數(shù)和運(yùn)行參數(shù)LC-5510工作站功能特點(diǎn)：具有色譜儀控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)；可進(jìn)行波長(zhǎng)程序控制可對(duì)兩臺(tái)泵進(jìn)行程序控制，進(jìn)行梯度洗脫功能健全，操作便捷 固定相和流動(dòng)相液相色譜培訓(xùn)（三）色譜柱色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，要求分離度

34、高，柱容量大，分析速度快。高性能的色譜柱與固定相本身性能、柱結(jié)構(gòu)、填裝和使用技術(shù)等有關(guān)。液相色譜柱是分析好壞、成敗的關(guān)鍵，整個(gè)液相分析過(guò)程中，其作用的重要性猶如人的心臟色譜柱的分類(lèi)按填料表面改性與否分為吸附型和化學(xué)鍵合型按照分離模式分為正相、反相、離子交換、疏水作用、體積排組、親和、手性等類(lèi)型按照分離規(guī)模及色譜柱的幾何尺寸，可分為制備柱、分析柱、微型柱等類(lèi)型色譜柱結(jié)構(gòu)色譜柱的基質(zhì)填料硅膠基質(zhì)填料聚合物基質(zhì)填料硅膠基質(zhì)填料目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)填料高機(jī)械強(qiáng)度和高的比表面積可利用直接的廣泛的表面鍵合反應(yīng)來(lái)滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求重現(xiàn)性好pH 適用范圍為pH 28具

35、有容易導(dǎo)致強(qiáng)堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基聚合物基質(zhì)填料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 穩(wěn)定性好：pH 113可以在很寬的范圍內(nèi)進(jìn)行表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求在中等 pH 條件下對(duì)強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。填料的體積隨著流動(dòng)相的不同而改變，如膨脹或收縮分離效率相對(duì)硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好化學(xué)鍵合固定相將各種不同的有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，而生成化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相對(duì)各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性由化學(xué)鍵合固定相制備的色譜柱柱效高、使用壽命長(zhǎng)、重現(xiàn)性好，幾乎對(duì)各種類(lèi)型的

36、有機(jī)化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作 類(lèi) 型性 質(zhì)色譜分離方式應(yīng) 用 范 圍烷基非極性反相、離子對(duì)中等極性化合物，溶于水的高極性化合物，如：小肽、蛋白質(zhì)、甾族化合物（類(lèi)固醇）、核堿、核苷酸、極性合成藥物等苯基非極性反相、離子對(duì)非極性至中等極性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烴、酯類(lèi)（鄰苯二甲酸酯）、脂溶性維生素、甾族化合物（類(lèi)固醇）、PTH衍生花氨基酸酚基弱極性反相中等極性化合物，保留極性相似于C8固定相，但對(duì)多環(huán)芳烴、極性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的選擇性醚基弱極性反相或正相醚基具有斥電子基團(tuán)，適用于分離酚類(lèi)、芳硝基化合物，其保留行為比C18更強(qiáng)（k增大）二醇基弱極性正相

37、或反相二醇基團(tuán)比未改性的硅膠具有更弱的極性，易用水潤(rùn)濕，適于分離有機(jī)酸及其齊聚物，還可作為分離肽、蛋白質(zhì)的凝膠過(guò)濾色譜固定相芳硝基弱極性正相或反相分離具有雙鍵的化合物，如芳香族化合物多環(huán)芳烴腈基極性正相（反相）正相相似于硅膠吸附劑，為氫鍵接受體，適于分析極性化合物，溶質(zhì)保留值比硅膠柱低，反相可提供與C8、C18，苯基柱不同的選擇性胺基極性正相（反相、陰離子交換正相可分離極性化合物，如芳胺取代物，脂類(lèi)，甾類(lèi)化合物，氯代農(nóng)藥；反相分離單糖、雙糖等碳水化合物；陰離子交換可分離酚、有機(jī)羧酸和核苷酸二甲胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離弱有機(jī)酸二胺基極性正相、陰離子交換

38、正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離有機(jī)酸化學(xué)鍵合固定相的類(lèi)型及其應(yīng)用范圍類(lèi) 型性 質(zhì)色譜分離方式應(yīng) 用 范 圍烷基非極性反相、離子對(duì)中等極性化合物，溶于水的高極性化合物，如：小肽、蛋白質(zhì)、甾族化合物（類(lèi)固醇）、核堿、核苷酸、極性合成藥物等苯基非極性反相、離子對(duì)非極性至中等極性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烴、酯類(lèi)（鄰苯二甲酸酯）、脂溶性維生素、甾族化合物（類(lèi)固醇）、PTH衍生化氨基酸酚基弱極性反相中等極性化合物，保留極性相似于C8固定相，但對(duì)多環(huán)芳烴、極性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的選擇性醚基弱極性反相或正相醚基具有斥電子基團(tuán)，適用于分離酚類(lèi)、芳硝基化合物，其保留行為比C18

39、更強(qiáng)（k增大）二醇基弱極性正相或反相二醇基團(tuán)比未改性的硅膠具有更弱的極性，易用水潤(rùn)濕，適于分離有機(jī)酸及其齊聚物，還可作為分離肽、蛋白質(zhì)的凝膠過(guò)濾色譜固定相芳硝基弱極性正相或反相分離具有雙鍵的化合物，如芳香族化合物多環(huán)芳烴腈基極性正相（反相）正相相似于硅膠吸附劑，為氫鍵接受體，適于分析極性化合物，溶質(zhì)保留值比硅膠柱低，反相可提供與C8、C18，苯基柱不同的選擇性胺基極性正相（反相、陰離子交換正相可分離極性化合物，如芳胺取代物，脂類(lèi)，甾類(lèi)化合物，氯代農(nóng)藥；反相分離單糖、雙糖等碳水化合物；陰離子交換可分離酚、有機(jī)羧酸和核苷酸二甲胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離弱有

40、機(jī)酸二胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離有機(jī)酸 使用鍵合固定相應(yīng)注意的問(wèn)題（1）硅膠鍵合相的穩(wěn)定性 鍵合相的使用壽命取決于鍵合的有機(jī)官能團(tuán)在硅膠表面的覆蓋程度，覆蓋量大或呈多分子 覆蓋層時(shí)會(huì)增加其穩(wěn)定性。通常正相鍵合相的穩(wěn)定性要低于反相鍵合相反相烷基鍵合相的 穩(wěn)定性與使用流動(dòng)相的pH值有關(guān)，通常水溶液的pH應(yīng)保持在28之間，pH8.5會(huì)引起基 體硅膠的溶解。（2）鍵合相色譜分離的重現(xiàn)性 使用鍵合相時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到，同一類(lèi)型的鍵合相，因生產(chǎn)廠家不同，或生產(chǎn)批號(hào)不同，而表 現(xiàn)出不同的色譜分離特性，為此應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室中準(zhǔn)備一定數(shù)量相同批號(hào)的鍵合固定相（或色 譜柱），以保證分

41、析結(jié)果有良好的重現(xiàn)性。（3）鍵合相色譜分離的選擇性 在反相色譜分析中，使用同一種ODS固定相，并用兩種極性參數(shù)值相近，但由不同溶劑 組成的流動(dòng)相時(shí)，會(huì)由于“溶劑誘導(dǎo)選擇性的變化”而獲得不同的結(jié)果。（4）鍵合相的再生 使用鍵合相色譜柱時(shí)，由于大量極性或非極性樣品的連續(xù)注入，會(huì)引起固定相對(duì)樣品的吸 附、締合等不良效應(yīng)，而使柱分離性能變差，引起峰形變寬或拖尾等現(xiàn)像此時(shí)應(yīng)及時(shí)對(duì)色 譜柱進(jìn)行再生處理。對(duì)正相鍵合相柱可用11甲醇氯仿流動(dòng)相來(lái)進(jìn)行再生；對(duì)反相鍵合 相柱可用甲醇流動(dòng)相再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基酰胺或約0.01mol/L無(wú)機(jī)酸水 溶液進(jìn)行再生。正相色譜固定相最常用的正相色譜固定相硅膠最

42、常用的極性鍵合固定相氰基（CN）、氨基（NH2）等反相色譜固定相大多數(shù)是各種烴基硅烷的鍵合硅膠：如C2、C4、C6、C8、C16、C18和C22等 最常用的是C18，又稱ODS，即十八烷基硅烷鍵合硅膠測(cè)柱效-良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣 評(píng)價(jià)色譜柱好壞的標(biāo)準(zhǔn) 1）理論塔板數(shù)N 2）拖尾因子Tf 3）色譜柱背壓 4）pH值的適用范圍 5）使用壽命理論塔板數(shù) N粒徑 (m)柱長(zhǎng) (cm)塔 板 數(shù) N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00

43、031012,000-14,00031517,000-20,000拖尾因子TfAs = 1.0-1.05 很 好As = 1.2 一 般As = 2 差A(yù)s = 4 很差不對(duì)稱因子和拖尾因子的關(guān)系A(chǔ)s (at 10%)Tf (at 5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不對(duì)稱因子 (As) = BAA拖尾因子 (Tf) = A + B2A10% 峰高5% 峰高色 譜 柱 背 壓粒徑均一會(huì)使色譜柱的背壓相對(duì)較低。色譜柱兩端的壓力降不應(yīng)超過(guò)公式計(jì)算所得的30。硅膠粒徑對(duì)色譜柱的壓力具有很大的影響；硅膠粒子越小，色譜柱的背壓越大。色譜柱的背壓還與流動(dòng)相的粘度有

44、關(guān)。P = 3000Lt0dp2P 是色譜柱背壓 (psi)，L 是色譜柱的長(zhǎng)度 (cm), 流動(dòng)相的粘度 (cP)， t0 是色譜柱死時(shí)間, dp 是粒子的直徑 (m)常用色譜柱的典型流速色譜柱的保護(hù)柱柱心柱套在使用新柱之前，最好用強(qiáng)溶劑在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)沖洗 30 min，長(zhǎng)時(shí)間未用的分析柱也要同樣 處理定期使用強(qiáng)溶劑沖洗柱子3、使用緩沖鹽時(shí)，要先用含低濃度有機(jī)溶劑的水溶液沖洗，再用有機(jī)溶劑沖洗4、凈化樣品5、不使用時(shí)，要蓋上蓋子，避免固定相干枯6、使用預(yù)柱7、避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化8、避免壓力脈沖的劇烈變化分 析 柱 的 維 護(hù)色譜柱常見(jiàn)毛病柱壓過(guò)高多少

45、才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低柱壓過(guò)高 為什么柱壓會(huì)過(guò)高微粒堵塞樣品流動(dòng)相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長(zhǎng)柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過(guò)濾片部分堵塞樣品、流動(dòng)相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動(dòng)相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理?yè)p壞機(jī)械震動(dòng)造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯重復(fù)性差、回收率低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差色譜柱被污染流動(dòng)相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過(guò)強(qiáng)或流動(dòng)相過(guò)弱非特異性吸附流動(dòng)相選擇的一般要求化學(xué)穩(wěn)定性好，不與固定相和樣品組分發(fā)生化

46、學(xué)反應(yīng)與所用檢測(cè)器相匹配，不影響檢測(cè)器的正常工作對(duì)分析樣品要有足夠的溶解能力，以利于提高檢測(cè)器的靈敏度 流動(dòng)相的黏度要小，以保證合適的柱壓降 無(wú)毒或低毒，易于操作易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境正相色譜流動(dòng)相 常用流動(dòng)相為烷烴：戊烷、己烷等 通過(guò)填加二氯甲烷、短鏈醇、四氫 呋喃等極性較大的溶劑來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng) 相的極性 正相色譜最常用的流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度： 正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇反相色譜流動(dòng)相通常以水作為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等反相色譜溶劑洗脫強(qiáng)度的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?水甲醇乙腈乙醇四氫呋喃丙醇二氯甲烷（其中二氯甲烷無(wú)法與水混溶，常用來(lái)清洗被強(qiáng)保

47、留樣品污染的色譜柱）在分離極性和離子型化合物時(shí)常采用緩沖溶液作為流動(dòng)相水 的 等 級(jí)純化水蒸餾水去離子水波長(zhǎng) (nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無(wú)機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率溶 劑 等 級(jí)HPLC級(jí)優(yōu)級(jí)純分析純都經(jīng)過(guò)蒸餾和0.45um的過(guò)濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級(jí)經(jīng)過(guò)0.2um的過(guò)濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫甲醇 乙睛 正己烷-為HPLC 級(jí)溶劑；為分析純級(jí)溶劑幾種常用溶劑的吸光度比較圖溶劑截止波長(zhǎng)流動(dòng)相的脫氣易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作氣泡會(huì)影響色譜柱的分離效率氣泡會(huì)影響檢測(cè)器

48、的靈敏度、基線的穩(wěn)定性溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相發(fā)生反應(yīng)流動(dòng)相必須脫氣常用的脫氣方法氦氣脫氣法 加熱回流法 抽真空脫氣法 超聲脫氣法 在線真空脫氣法流動(dòng)相的過(guò)濾流動(dòng)相用前均應(yīng)過(guò)濾，尤其是配置的流動(dòng)相所用濾膜為0.45m的孔徑或者更小孔徑的用濾膜過(guò)濾時(shí)，特別注意分清有機(jī)相濾膜和水相濾膜過(guò)濾的目的是除去微小顆粒，防止堵塞色譜柱和液路流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中貯存溶劑一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，同時(shí)防止空氣中的氧和二氧化碳溶于流動(dòng)相中緩沖溶液極易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量現(xiàn)用現(xiàn)配貯存容器應(yīng)經(jīng)常清洗，尤其是盛水、緩沖液和混合溶液的

49、瓶子流動(dòng)相的貯存有機(jī)溶劑流動(dòng)相:室溫下密封,避光保存緩沖鹽流動(dòng)相:當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保存,一般不超過(guò)3天防止長(zhǎng)菌有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相:低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)溶劑使用注意事項(xiàng)避免使用下列對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑：鹵化物堿金屬溶液和相應(yīng)的酸溶液。高濃度的無(wú)機(jī)酸例如：硝酸和硫酸。能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。含有過(guò)氧化物的色譜級(jí)醚必須用氧化鋁干燥劑。在有機(jī)溶劑中的有機(jī)酸溶液。含有強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液。四氯化碳和異丙醇或THF混合液。LC-5500的使用、維護(hù)及應(yīng)用液相色譜培訓(xùn)（四）LC-5500高效液相色譜的使用與維護(hù)高液相色譜儀 開(kāi)機(jī)前的準(zhǔn)備工作 流動(dòng)相和樣品的前處理

50、 過(guò)濾 脫氣 流動(dòng)相的前處理：過(guò)濾設(shè)備和材料：溶劑過(guò)濾器、真空泵、 0.45m或更細(xì)的水 性濾膜和有機(jī)濾膜過(guò)濾的方法：用加了濾膜的溶劑過(guò) 濾器和真空泵抽濾過(guò)濾的目的：除去溶劑中的微小顆粒， 避免堵塞色譜柱和液路， 尤其是使用無(wú)機(jī)鹽配制 的緩沖液儲(chǔ)液瓶一個(gè)存放流動(dòng)相的容器儲(chǔ)液瓶的材料應(yīng)耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料，一般常用有機(jī)溶劑的原裝瓶作為儲(chǔ)液瓶用棕色玻璃瓶作為儲(chǔ)液瓶，可避免藻類(lèi)的生長(zhǎng)為保持流動(dòng)相的純凈，應(yīng)經(jīng)常清洗或更換儲(chǔ)液瓶流動(dòng)相的前處理：脫氣脫氣的目的：使色譜泵的輸液準(zhǔn)確 輸液均勻準(zhǔn)確，且脈動(dòng)減小。 保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高 提高檢測(cè)的性能 防止氣泡引起的尖峰 基線穩(wěn)定，信噪比

51、增加 溶劑的紫外吸收本底降低 保護(hù)色譜柱 減少死體積 防止填料的氧化常用的脫氣方法氦氣脫氣法加熱回流法抽真空脫氣法超聲脫氣法在線真空脫氣法脫氣機(jī)超聲波清洗器樣品的前處理使用流動(dòng)相溶解樣品 - 減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)由為重要 - 保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀 樣品需要過(guò)濾如果樣品中有氣泡，也要超聲脫氣LC-5500液相色譜儀組成簡(jiǎn)圖P101泵鍵盤(pán)單向閥結(jié)構(gòu)拋光面透明塑料墊片寶石球單向閥原理吸液沖程排液沖程出口單向閥進(jìn)口單向閥泵頭泵工作原理泵使用注意事項(xiàng)泵不能在沒(méi)有溶劑時(shí)空轉(zhuǎn)，否則活塞與泵缸的密封之間磨損會(huì)造成泄漏 泵不能用具有腐蝕性的物質(zhì)，pH使用

52、范圍為28.5含鹽流動(dòng)相使用后不能長(zhǎng)期存放在泵中，隨著液體的蒸發(fā)，留下的少量鹽的晶體會(huì)磨損高壓密封圈和泵塞，所以在應(yīng)用含鹽流動(dòng)相后，一定要用純水徹底清洗泵 絕對(duì)不允許在大于最大允許壓力限定值（40MPa）下操作 LC-5500主機(jī)進(jìn)樣閥檢測(cè)器電源柱箱電源調(diào)零旋鈕柱溫箱液晶顯示屏進(jìn)樣方法 1.在INJECT（進(jìn)樣）狀態(tài)下清洗閥口 2.在LOAD（裝填）狀態(tài)下插入微量注射器 3.注入樣品 4.切到INJECT（進(jìn)樣）狀態(tài)進(jìn)樣注意事項(xiàng)用注射器吸取樣品后，一定要排除氣泡后方可進(jìn)樣將注射器針頭插入進(jìn)樣口，直到針頭頂住進(jìn)樣閥體平面為止，且不可用力過(guò)大，以免損傷閥體密封面緩慢推進(jìn)注射針，使定量管完全充滿樣液

53、旋轉(zhuǎn)手柄時(shí)一定要快，否則對(duì)泵和柱子都會(huì)產(chǎn)生不良影響進(jìn)樣量和檢測(cè)器響應(yīng)的關(guān)系示意圖進(jìn)樣體積 檢測(cè)器響應(yīng)值定量環(huán)體積的一半2倍定量環(huán)體積全量注入部分注入進(jìn)樣閥的沖洗進(jìn)完樣后一定要及時(shí)沖洗進(jìn)樣閥，特別是用含鹽緩沖液作流動(dòng)相，由于這些溶液會(huì)形成結(jié)晶從而磨損墊圈將進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)至INJECT（進(jìn)樣）位置，利用液相泵輸送純水沖洗定量環(huán)及溝槽，利用注射器沖洗進(jìn)樣閥的閥口經(jīng)常用濕潤(rùn)的軟布清潔進(jìn)樣閥，特別是進(jìn)樣口周?chē)M(jìn)樣閥使用注意事項(xiàng)閥應(yīng)該保持在LOAD或INJECT中的一個(gè)位置。如果閥處在兩者中間的位置，系統(tǒng)內(nèi)的高壓可能會(huì)破壞其密封表面 只允許用平端的沖洗注射器和樣品注射器，絕對(duì)禁止用尖端（GC）注射器，以防劃傷閥

54、的密封面。柱溫箱結(jié)構(gòu)圖柱箱門(mén)保護(hù)柱色譜柱接檢測(cè)器柱溫箱的使用注意事項(xiàng)打開(kāi)柱溫箱電源開(kāi)關(guān)，通過(guò)工作站軟件設(shè)定柱箱溫度使用柱恒溫箱時(shí)，應(yīng)先輸入流動(dòng)相然后再升溫；關(guān)機(jī)時(shí)則相反，即先關(guān)閉升溫電源，待色譜柱溫度降至室溫后方可停泵 在常溫下操作時(shí)，則不必打開(kāi)柱溫箱電源 色譜柱日常使用注意事項(xiàng)過(guò)濾所有的溶劑和樣品使用保護(hù)柱不要把柱接頭上得太緊，損壞接頭螺紋易滲液開(kāi)機(jī)時(shí)，流速和柱壓要逐漸增加注意色譜柱的pH值使用范圍不要高壓沖洗柱子不能讓緩沖鹽溶液留存在色譜柱中，關(guān)機(jī)前要先用含低濃度有機(jī)溶劑的水溶液沖洗，然后再用純有機(jī)溶劑來(lái)保存柱子色譜柱的更換 對(duì)于反相色譜柱的更換：拆卸色譜柱時(shí)，必須先關(guān)斷柱箱電源。待色譜柱

55、柱溫降到室溫后，繼續(xù)用溶劑如甲醇沖洗色譜柱約20min；先卸下色譜柱出口端接頭，待有甲醇流出后再擰上螺帽；然后擰下色譜柱進(jìn)口端接頭，繼續(xù)使甲醇滴入色譜柱，當(dāng)柱進(jìn)口端有甲醇溢出，且沒(méi)有氣泡時(shí)，表明色譜柱已被甲醇充滿，此時(shí)可再擰上保護(hù)性螺帽。換新色譜柱的程序相反。 色譜柱更換、保存注意事項(xiàng)沖洗或活化色譜柱時(shí)，流出液應(yīng)放入廢液瓶中，千萬(wàn)不可接到檢測(cè)器上，以免污染流通池按柱子進(jìn)出口方向接入系統(tǒng)，不可更改色譜柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，絕不可干燥放置。正相柱用正己烷或乙腈，反相柱用甲醇。用原配的柱端堵頭封緊柱兩端色譜柱存放時(shí)防止震動(dòng)，以免損壞柱床檢測(cè)器的使用注意檢測(cè)器的波長(zhǎng)通過(guò)工作站的軟件設(shè)定氘燈通電后在一分鐘內(nèi)起

56、輝，然后進(jìn)入工作狀態(tài)，一般氘燈穩(wěn)定需要0.51h，穩(wěn)定后就可以進(jìn)樣分析 ，所以要等儀器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，也即基線走穩(wěn)后方可進(jìn)行樣品分析注意液晶顯示屏所顯示的數(shù)字要為正，通過(guò)調(diào)零旋鈕調(diào)節(jié)基線與零點(diǎn)的位置，使基線在零點(diǎn)的上方。工作站界面整套液相色譜儀的維護(hù)1、在使用過(guò)含鹽緩沖液后，用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）沖洗整個(gè)系統(tǒng)，時(shí)間為30min，流量1mL/min。本步驟主要是沖洗干凈系統(tǒng)內(nèi)含鹽緩沖液。2、用純的強(qiáng)溶劑（甲醇或乙腈）沖洗整個(gè)系統(tǒng)，時(shí)間為30min以上，流量為1mL/min 。本步驟主要是保護(hù)色譜柱。3、如果未使用緩沖液，上面步驟1可免去，直接用純的強(qiáng)溶劑沖洗整個(gè)系統(tǒng)，時(shí)間為30min以

57、上，流量為1mL/min每次用過(guò)儀器后必須做!注意事項(xiàng) 流動(dòng)相的選擇：對(duì)樣品易溶，且溶解度盡可能大化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子不妨礙檢測(cè)器檢測(cè)，所選波長(zhǎng)處無(wú)吸收 黏度低，流動(dòng)性好 無(wú)毒或低毒，易于操作易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境注意事項(xiàng)緩沖液的使用：使用前必須過(guò)濾 使用后一定要進(jìn)行清洗 ，以免造成腐蝕、磨損、阻塞: 用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min易受到細(xì)菌和霉菌的影響，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配 不能直接用有機(jī)溶劑沖洗液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題及其對(duì)策液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題類(lèi)型 A. 壓力異常（偏高、波動(dòng)） B. 漏液 C. 保留時(shí)間漂移 D. 基

58、線問(wèn)題（漂移、噪聲） E. 峰形異?，F(xiàn)象：無(wú)壓力，流動(dòng)相不流動(dòng)可能原因： 1、柱塞桿折斷 2、泵頭內(nèi)有空氣或流動(dòng)相不足 3、單向閥堵塞 4、漏液 5、壓力傳感器損壞(流動(dòng)相流動(dòng)正常，但無(wú)壓力)壓力異?，F(xiàn)象：壓力持續(xù)偏高或不斷上升可能原因： 1、流速設(shè)定過(guò)高 2、保護(hù)柱或柱子篩板堵塞 3、流動(dòng)相使用不當(dāng)或有緩沖鹽析出 4、色譜柱選擇不當(dāng) 5、進(jìn)樣閥損壞壓力異常現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏低可能原因： 1、流速設(shè)定過(guò)低 2、色譜柱選擇不當(dāng) 3、柱溫過(guò)高 4、系統(tǒng)漏液壓力異常壓力異常現(xiàn)象：壓力波動(dòng)可能原因： 1、泵頭中有氣泡 2、單向閥損壞 3、柱塞密封圈損壞 4、脫氣不充分 5、系統(tǒng)漏液 6、使用了梯度洗脫漏

59、液接頭處漏液 可能原因： 1、接頭處松動(dòng) 2、接頭磨損 3、接頭被污染 4、部件不匹配 漏液泵漏液 可能原因： 1、單向閥松動(dòng) 2、泵密封圈損壞 3、接頭松動(dòng)（不要擰的太緊）進(jìn)樣閥漏液 可能原因： 1、轉(zhuǎn)子密封損壞 2、定量環(huán)堵塞 3、進(jìn)樣口密封松動(dòng) 4、進(jìn)樣針尺寸不合適 5、廢液管產(chǎn)生虹吸 6、廢液管堵塞漏液檢測(cè)器漏液 可能原因： 1、流通池墊片損壞 2、流通池透鏡破碎 3、廢液管堵塞 4、流通池堵塞漏液保留時(shí)間漂移 可能原因： 1、柱溫變化 2、流動(dòng)相組分變化 3、色譜柱沒(méi)有平衡好 4、流速變化 5、泵中有氣泡 6、流動(dòng)相選擇不當(dāng) 7、鍵合相流失保留時(shí)間漂移基線漂移 可能原因： 1、溫度波

60、動(dòng) 2、流動(dòng)相不均勻(脫氣，使用純度更高的溶劑) 3、流通池被污染或有氣泡 4、流通池窗口破裂 5、流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化 6、色譜柱沒(méi)有平衡 7、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成 8、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)以饅頭樣峰被洗出 9、檢測(cè)器沒(méi)有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處基線問(wèn)題基線噪聲（規(guī)則的） 可能原因： 1、流動(dòng)相、泵、檢測(cè)器中有氣泡 2、有地方漏液 3、流動(dòng)相混和不均勻 4、溫度影響（檢測(cè)器和柱溫差別太大） 5、其他電子設(shè)備的影響 基線問(wèn)題基線噪聲（不規(guī)則的） 可能原因： 1、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成 2、有地方漏液 3、流動(dòng)相各溶劑不相溶或混和不均勻 4、流通池污染 5、檢測(cè)池能量不足