農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序的轉(zhuǎn)化方法

1、農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序的轉(zhuǎn)化方法制備轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌菌液準(zhǔn)備：滅菌試管400毫升細長燒杯2瓶，離心瓶4-6個（250ml）。試劑：YEP1200ml（每瓶300ml共4瓶）+Kan1;1000，Rif1:500。1/2MS+2%蔗糖（滅菌115度20分鐘），Silwet在-20C貯存。步驟：共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：于中午12點接菌于有YEP培養(yǎng)液的試管中10ul：10ml接種。28C,3000rpm搖過夜，約30小時，次日下午6點將已搖活的菌按（1：400）及750ul菌液轉(zhuǎn)至漢300毫升YEP+K50+Rif中培養(yǎng)28C，300rpm約14小時，次日上午8點測OD值，用YEP+Rif作為空白對照，當(dāng)菌液達

2、到OD600為1.53.0之內(nèi)時，可收集菌體于250ml離心瓶（滅菌）,4C，4000g離心10min。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀釋至OD600約為0.81.0左右即，用10%蔗糖作對照。轉(zhuǎn)化時將花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生長。澆水：轉(zhuǎn)化前一天將需要做轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥苗子澆水澆透。（注意：選取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌體，在將混勻的菌體溶入600ml溶液中，混勻后再加入Silwet（100%）120ul終濃度為0.02%）。先將澆透水用于轉(zhuǎn)化的苗子的夾全部剪掉，再用寬膠帶把花盆的土封好。轉(zhuǎn)化的準(zhǔn)備工作：2個400細長燒杯，寬膠帶，記號筆，表等。轉(zhuǎn)化過程略

3、，視苗的長勢弱0.8Pa3，長勢好的0.8Pa5。標(biāo)記好，將轉(zhuǎn)化好的苗平放于盒子內(nèi)，上蓋封口膜封好，避光培養(yǎng)24hrs2天后，將植株立起正常培養(yǎng)，澆水，3天1次?；ㄐ蚪荩╢lower-dipping）法轉(zhuǎn)化擬南芥（2）擬南芥種植取Columbia生態(tài)型的擬南芥種子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min,10%次氯酸鈉消毒10min，無菌水沖洗5-6次，用0.1%的Topagar混勻，平鋪在1/2MS培養(yǎng)基上，4C保濕黑暗條件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18C、RH為70%條件下培養(yǎng)。一周后，選擇生長健壯的幼苗移栽到培養(yǎng)土中。每周澆一次1/

4、2PNS培養(yǎng)液。當(dāng)幼苗長至3-4cm時，去除花序，在去除頂端花序四天后進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前將已經(jīng)開花授粉的花和種子去除干凈。（3）抽濾法轉(zhuǎn)化擬南芥及陽性苗篩選1活化農(nóng)桿菌；2、以1:50比例轉(zhuǎn)接到200mlLB培養(yǎng)基中，28C，2000rpm培養(yǎng)至0D600=1.2-1.6;3、4000rpm，離心15min，收集菌體；4、重懸于滲透緩沖液（1/2MS培養(yǎng)基+5%蔗糖配置后在121C滅菌20min，加終濃度0.02-0.03%SilwettL-77，振蕩混勻），以重懸滲透液為對照，調(diào)節(jié)OD600=0.8-1.；05、將已授粉、結(jié)莢的擬南芥用消毒剪去除，倒置于裝有滲透緩沖液的合適大小的容器上侵染50

5、S,用塑料薄膜覆蓋整個托盤并適留通氣孔后，在弱光下培養(yǎng),24h后取下薄膜，于室溫中繼續(xù)培養(yǎng)。6、約30日后收獲種子，將收獲的轉(zhuǎn)基因種子用含有0.2%的TritonX-100浸泡10min；7、用10%的次氯酸南表面消毒10-12min；8、滅菌水沖洗5-6次，每次約2min；9、用水將轉(zhuǎn)基因種子置于含50mg/LKan的MS平板上，4C暗培養(yǎng)兩天；20mg/LHyg潮霉素篩選連續(xù)暗培養(yǎng)7天；10、Kan抗性篩選的種子在22C，16h光照/8h黑夜光周期培養(yǎng)。兩周后，經(jīng)Kan抗性篩選的陽性植物表現(xiàn)良好，長勢正常，而陰性植物則不萌發(fā)或不久死亡。擬南芥的種植試劑配制人工土：3份蛭石，1份珍珠巖和1份

6、黑土混合PNS營養(yǎng)液：每升含5ml1MKNO3，2ml1MCa(N03)2*4H2O，2ml1MMgSO4*7H2O，2.5ml20mMFe.EDTA，2.5ml1M磷酸緩沖液(pH5.5),1mlMS微量元素。PNS營養(yǎng)液母液配方1MKNO3101.1g1MCa(NO3)2*4H2O236.15g1MMgSO4*7H2O，246.48g20mMFe.EDTA：FeSO45.57gEDTA7.45g注意先各自配成溶液，在混合。1M磷酸緩沖液(pH5.5)：磷酸二氫鉀130.4g磷酸氫二鉀9.12gMS微量兀素硼酸0.434g硫酸錳(MnS04H2O)1.7626gCuSO4*H2O0.0798

7、gZnSO4*7H2O0.172gNaMoO4*2H2O0.0432gNaCl0.585gCoCl*6H2O0.00129g以上母液均配至1L種植步驟將春化過的擬南芥種子種于澆過飽和PNS營養(yǎng)液的人工土中，并用保鮮膜罩上。兩天后光照，三天后揭膜。人工培養(yǎng)室條件：相對濕度80%，恒溫20-240C，光照強度80-200umol/M2/S,光照周期為8h黑暗、16h光照培養(yǎng)。擬南芥的轉(zhuǎn)化試劑配制滲透培養(yǎng)基(一升中)：1/2xMurashige-Skoog；5%蔗糖；0.5克MES；用KOH調(diào)至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA母液；200微升SilwetL-77)注意：6-BA母液配

8、制時用乙醇溶解1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本組分配制，但大量元素減半。另：經(jīng)轉(zhuǎn)化的擬南芥，種子收獲后需在相應(yīng)的抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化步驟制備好已轉(zhuǎn)化了相應(yīng)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液10ml，在轉(zhuǎn)化前一天晚上，轉(zhuǎn)入大瓶培養(yǎng)過夜，第二天取出使用時農(nóng)桿菌液O.D600當(dāng)在1.2到1.6之間。室溫5000rpm離心15分鐘。棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基里，使O.D600在0.8左右。將農(nóng)桿菌懸浮液直接噴灑至整個植株(或用抽真空的方法)，蓋上透明的塑料蓋子或保鮮膜以保持濕度，移入恒溫室避光培養(yǎng)，第二天可開蓋，正常光照培養(yǎng)。一周后再噴灑一次，方法同上。轉(zhuǎn)化子的篩選種子消毒：先用70%乙醇浸泡10分鐘，在上述處理時要不時地使種子懸??；然后用無菌水洗四次，在這步處理時最好也不時地使種子懸浮。注意：用乙醇浸泡的時間不宜過長！處理后