反相高效液相色譜法測(cè)定肝臟維生素A

1、反相高效液相色譜法（HPLC）分析小鼠血清和組織中的視黃醇以及視黃基酯1-材料0標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備乙醇（ACS級(jí)）。視黃醇（Sigma）。視黃酯（Sigma）。4維生素A棕櫚酸酯（Sigma）。5帶帽棕色試劑瓶o視黃醇的提取1新鮮或冷凍的血清或組織（全部樣品解剖后立即在液氮中快速冷凍，并儲(chǔ)存在-80C。如果可能的話，從血清和組織萃取視黃醇必須“在黑暗中迅速地進(jìn)行，所有的提取步驟應(yīng)在冰上或在冷室中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室窗戶應(yīng)覆蓋合適的材料,如鋁箔或厚重的窗簾（沒有窗戶的房間，是執(zhí)行此過程的理想場(chǎng)所）。人工照明應(yīng)在零售商店買黃色燈泡。另外，使用昏暗的燈光下，不要把樣品直接暴露在燈光下，盡量減少光敏感視黃醇損失）。

2、2使用內(nèi)標(biāo)法所需要的內(nèi)標(biāo)物（視黃醇乙酸酯）。乙醇（ACS級(jí)）。己烷（HPLC級(jí)）。H20（HPLC級(jí)）。PVDF過濾膜即聚偏二氟乙烯膜（0.22微米，47毫米）。全玻璃過濾裝置。磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），僅用于組織。N2氣體，Evap-O-Rac系統(tǒng)（科爾-帕默）。PR0200手持式均質(zhì)勻漿器，僅用于組織。巴斯德玻璃移液管（9英寸）和洗耳球。聚丙烯管（12毫米X75毫米）。玻璃試管（13毫米X100毫米16毫米X100毫米）。1-3o視黃醇的分析1高效液相色譜法系統(tǒng)（本章中所提到的HPLC配件如棕色小瓶，進(jìn)樣瓶，瓶帽與戴安終極版3000系列高效液相色譜儀兼容。不同的HPLC系統(tǒng)可能還需要其他一

3、些類型的配件）色譜柱（在我們的實(shí)驗(yàn)中，隨著時(shí)間的推移，這個(gè)貝克曼色譜柱顯示的結(jié)果具有重復(fù)性（包括保留期）3保護(hù)柱4.棕色試劑瓶（本章中所提到的HPLC配件如棕色小瓶，進(jìn)樣瓶，瓶帽與戴安終極版3000系列高效液相色譜儀兼容。不同的HPLC系統(tǒng)可能還需要其他一些類型的配件5自動(dòng)進(jìn)樣瓶（這個(gè)玻璃插入物通過一個(gè)彈簧塞進(jìn)瓶里，彈簧對(duì)接觸尖狀物起緩沖作用。一旦完成樣品的分析后，我們應(yīng)該好好保存彈簧便于以后組裝新的小瓶。）6帶有瓶蓋的PTFE/硅隔膜（這些瓶蓋和隔墊，可單獨(dú)購買，（capw/osepta,NationalScientific,cat.no.C4000-98BLK;septa,National

4、Scientific,cat.no.C4000-60）.）甲醇（HPLC級(jí)）。乙腈（HPLC級(jí)）。二氯甲烷（HPLC級(jí)）。2方法由于視黃醇的光敏性質(zhì)，所有以下實(shí)驗(yàn)程序應(yīng)該在黑暗中執(zhí)行。（從血清和組織萃取視黃醇必須在黑暗中迅速地進(jìn)行，所有的提取步驟應(yīng)在冰上或在冷室中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室窗戶應(yīng)覆蓋合適的材料，如鋁箔或厚重的窗簾（沒有窗戶的房間，是執(zhí)行此過程的理想場(chǎng)所）。人工照明應(yīng)在零售商店買黃色燈泡。另外，使用昏暗的燈光下，不要把樣品直接暴露在燈光下）21標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備制備標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液是將標(biāo)準(zhǔn)品溶解到適當(dāng)?shù)娜軇┲?，如下：乙醇溶解視黃醇及視黃醇酯;正己烷溶解維生素A棕櫚酸酯。2標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液應(yīng)該在棕色試劑瓶?jī)?nèi)

5、制備并保存在-20。C。（高度濃縮的類視黃醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液即使儲(chǔ)存在-20C也會(huì)隨時(shí)間降解。儲(chǔ)備液推薦的最佳濃度約為1毫克/毫升。30毫升為原液的建議體積。根據(jù)上述方案制備儲(chǔ)備液，在-20C下，可以保持?jǐn)?shù)月。）3稀釋每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液到約1納克/微升。（稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)液都應(yīng)保存在棕色小瓶。我們建議將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液分為小等分，每份3-4毫升?？梢酝ㄟ^在蓋上帽之前，用N2氣體沖洗小瓶的頂部空間使降解或化合物的損失最小化。在用HPLC分析等分的稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)試樣之前，要檢查其質(zhì)量）用分光光度計(jì)測(cè)量稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸光度為325納米（使用1厘米寬的石英比色杯（1毫升）根據(jù)OD值和具體的消光系數(shù)計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃

6、度（消光系數(shù)取決于該化合物和溶解的溶劑。視黃基醋酸酯溶解在乙醇中的消光系數(shù)是1550，視黃醇溶解在乙醇是1835，而維生素A棕櫚酸酯溶解在乙醇是975）。ODftaudardsolutionx6把稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液分裝在棕色小瓶中，并將它們儲(chǔ)藏在-20C下（稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)液都應(yīng)保存在棕色小瓶。我們建議將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液分為小等分，每份3-4毫升?？梢酝ㄟ^在蓋上帽之前，用N2氣體沖洗小瓶的頂部空間使降解或化合物的損失最小化。在用HPLC分析等分的稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)試樣之前，要檢查其質(zhì)量）2。校準(zhǔn)曲線的確定2.2.1。檢測(cè)限度1準(zhǔn)備一系列不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)液（視黃醇，視黃酯，以及維生素A棕櫚酸酯）。（檢出限取

7、決于探測(cè)器和色譜柱的使用情況。濃度范圍的選擇應(yīng)根據(jù)所分析的組織的類視黃醇的含量。參見圖15.1a為檢測(cè)限曲線的一個(gè)典型的例子）將稀釋液注入到HPLC柱。（如何操作HPLC系統(tǒng)將取決于儀器的類型，此程序的介紹對(duì)實(shí)驗(yàn)并沒有什么作用。我們只建議監(jiān)測(cè)色譜柱的壓力和加樣前目標(biāo)波長(zhǎng)的基線。各稀釋樣在在HPLC中都設(shè)置三個(gè)平行對(duì)照。注射量根據(jù)HPLC系統(tǒng)和/或使用的協(xié)定而變化。這個(gè)協(xié)定是：標(biāo)準(zhǔn)的注射量為二十微升）3在UV吸光度為325nm處檢測(cè)出的峰信號(hào)值，獲得峰面積。形成以標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度為x軸和相應(yīng)的峰面積為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（如圖15.1a）2.2.2。標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)備兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，它們視黃醇-維生素A醋酸

8、酯和維生素A棕櫚酸酯-視黃酯的摩爾比不同，在HPLC中的棕色小瓶的含量如下：（在玻璃試管中加入適當(dāng)體積的不同類視黃醇化合物（根據(jù)摩爾比）之后，在緩和的N2氣流中干燥，然后重新懸浮于流動(dòng)相中。渦旋良好立即轉(zhuǎn)移到HPLC中棕色小瓶中。）視黃醇：視黃基醋酸酯（m:m）=0.1：1,0.25:1,0.5:1,1:1,2:1（視黃基醋酸酯濃度約為1毫微克/微升）維生素A棕櫚酸酯：視黃基醋酸酯（m:m）=0.1：1,0.25:1,0.5:1,1:1,2:1,3:1，4：1,5:1（視黃基醋酸濃度約為2毫微克/微升）2不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入的HPLC色譜柱。（如何操作HPLC系統(tǒng)將取決于儀器的類型，此程序的

9、介紹對(duì)實(shí)驗(yàn)并沒有什么作用。我們只建議監(jiān)測(cè)色譜柱的壓力和加樣前目標(biāo)波長(zhǎng)的基線。各稀釋樣在在HPLC中都設(shè)置三個(gè)平行對(duì)照。注射量根據(jù)HPLC系統(tǒng)和/或使用的協(xié)定而變化。這個(gè)協(xié)定是：標(biāo)準(zhǔn)的注射量為二十微升）3在UV吸光度為325nm處檢測(cè)出的峰信號(hào)值，獲得峰面積。以類維生素A混合物和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物的摩爾比為x軸，以相應(yīng)的峰面積為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（如圖15.1b）2.3。視黃醇的提取231血清中的提取添加100微升血清到玻璃試管中。加入25微升內(nèi)標(biāo)物視黃基醋酸酯，并添加乙醇，使用于提取的乙醇的總量和血清的總體積比值是1：1（例如，若用了150微升血清，那么在25pl的內(nèi)標(biāo)物中加入125pl乙醇）（內(nèi)標(biāo)物的

10、建議濃度為1毫微克/微升。請(qǐng)注意，內(nèi)標(biāo)物溶于乙醇中，因此計(jì)算提取所需的乙醇的總體積應(yīng)考慮在內(nèi)）對(duì)試管簡(jiǎn)單的渦旋式震蕩4添加4毫升正己烷（一旦正己烷被加入，維生素A是穩(wěn)定的。換句話說，提取過程必須迅速地進(jìn)行，直到加入己烷），渦旋30秒兩次（在此步驟中，應(yīng)緩慢增加渦流的速度，以避免溶劑溢出。手持玻璃管一邊。將手指放在該管的頂部可能導(dǎo)致雜質(zhì)污染樣品，混合時(shí)避免溶劑溢出）。5.以3000rpm在臺(tái)式離心機(jī)低速離心3分鐘。（在此離心之后，樣品將分為兩層：底層是水相，稍微混濁;頂部是含有類視黃酸的溶劑相的透明層。在這兩個(gè)層之間和7或在管底部的接口，白色或彩色的小指組織殘基允許存在）6通過使用玻璃巴斯德吸管

11、，轉(zhuǎn)移上層相到含有500微升H2O中的一個(gè)新的玻璃試管中。7對(duì)新的試管渦旋震蕩8重復(fù)步驟8并將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有玻璃巴斯德吸管的新的玻璃試管中。（在此離心之后，樣品將分為兩層：底層含有水，頂層含有溶劑。兩層都清楚，無殘留物。小心轉(zhuǎn)移上層而不要觸及下層）。9在緩慢流動(dòng)的N2中干燥上層液，通過Evap-O-Rac系統(tǒng)排放（科爾-帕默）。10把樣品溶解在50微升流動(dòng)相中（這一步，應(yīng)迅速進(jìn)行，以避免樣品蒸發(fā)。提前組裝好HPLC小瓶（內(nèi)置小瓶，瓶蓋應(yīng)使用隔膜等）。除了血清，大部分組織可輕易地再懸浮在流動(dòng)相中。如果不是在這樣的情況下，樣品將出現(xiàn)渾濁，那就不應(yīng)該注入HPLC柱。例如，脂肪組織，應(yīng)重新懸浮在

12、一種替代的溶劑中，如苯，流動(dòng)相：苯（3:2，V:V）洗脫，乙腈），并轉(zhuǎn)移到小瓶中便于注入HPLC柱。2.3.2。組織中的提取1提取所需組織的重量將取決于其類視黃醇含量。為了說明步驟，我們將著重?cái)⑹龈蝺?nèi)視黃醇的提取，推薦使用100毫克肝（對(duì)于脂肪，組織的提取量應(yīng)小于50毫克。對(duì)于在14.5DPC（約200毫克）的胚胎，我們建議使用全胚胎和成人前列腺的整個(gè)器官（約40-50毫克）將100毫克肝放入含有2毫升PBS的聚丙烯管中。（不同體積的PBS應(yīng)選擇均化程度不同的組織，因?yàn)檫@些組織的類視黃醇含量不同。例如，1mlPBS,建議均化14.5DPC胚胎；mlPBS,50毫克脂肪組織；1毫升PBS,成人前

13、列腺）3以中等速度10秒勻漿。（為了避免同質(zhì)化步驟中的污染物，記得用干凈的PBS仔細(xì)沖洗每個(gè)樣品之間的探頭）4轉(zhuǎn)移2001的勻漿放入玻璃試管中。（肝臟是具有高濃度類視黃酸的組織。因此，我們建議，只有提取十分之一勻漿。然而，提取的最優(yōu)的勻漿體積可能會(huì)有所不同，這取決于所述的類視黃醇含量組織。例如，從胚胎中進(jìn)行類視黃醇的提取的情況下，建議使用進(jìn)行萃取勻漿（1毫升）的全部（或一半）體積。我們也建議使用勻漿的全部體積來執(zhí)行從脂肪（2毫升）或從前列腺（1毫升）中萃?。┘尤?00微升內(nèi)標(biāo)醋酸視黃醇和100pl乙醇。（內(nèi)標(biāo)物的建議濃度為1毫微克/微升。請(qǐng)注意，內(nèi)標(biāo)物溶于乙醇中，因此計(jì)算提取所需的乙醇的總體積

14、應(yīng)考慮在內(nèi)）對(duì)試管簡(jiǎn)單的渦旋式震蕩按照提取的血清的第四步描述的步驟（所以不推薦從提前存儲(chǔ)在-20C下組織勻漿中提取類視黃醇，因?yàn)轭愐朁S醇可能發(fā)生降解。新鮮烹制的組織勻漿是首選）24。高效液相色譜法（HPLC）分析（當(dāng)組裝注射進(jìn)HPLC色譜柱的樣品時(shí)，我們推薦設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照（只用流動(dòng)相），每隔5-6樣品清理一次色譜柱中潛在的雜質(zhì)）241。根據(jù)下面的表格準(zhǔn)備流動(dòng)相：（通過使用PVDF過濾膜用玻璃過濾器過濾流動(dòng)相直到真空為止。此步驟有助于混合不同的溶劑和消除潛在的雜質(zhì)。此外，流動(dòng)相應(yīng)置于超聲發(fā)生器進(jìn)行30分鐘的脫氣處理）乙腈70%甲醇15%二氯甲烷15%242。色譜條件色譜柱BeckmanUltrasphereC18（5微米），4.6毫米x250毫米保護(hù)柱C18（7微米），15mmx3.2毫米流速1.8毫升/分鐘運(yùn)行時(shí)間35分鐘注射量20微升PDA檢測(cè)波長(zhǎng)325納米2.4.3。確定類視黃醇的濃度-集成峰信號(hào)值在UV吸光度為325nm處檢測(cè)，不同的視黃醇在色譜分離和鑒定時(shí)獲得峰面積。呈現(xiàn)在HPLC峰值下視黃醇復(fù)合物的量將根據(jù)其峰下的面積來確定，使用如上所述生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。一個(gè)典型的肝臟類維