GB 5413.20-2022 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準

犌犅５４１３．２０—２０２

食品安全國家標準

嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定

２０２０６３０發(fā)布 ２０２１２３０實施

發(fā)布

中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會國 家 市 場 監(jiān) 督 管 理 總 局

犌犅５４１３．２０—２０２

前 言

本標準代替ＧＢ５４１３．２０—２０１３《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》。本標準與ＧＢ５４１３．２０—２０１３相比，主要變化如下：

——刪除了第二法雷氏鹽分光光度法，增加了離子色譜法作為第二法；

——增加了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法作為第三法。

Ⅰ

食品安全國家標準

嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定

１范圍

本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定方法。本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定。

第一法 酶比色法

２原理

試樣經(jīng)酸水解，再經(jīng)酶作用后與顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與膽堿含量成正比，外標法定量。

３試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為ＧＢ／Ｔ６８２規(guī)定的三級水。

３．１試劑

３．１．１三羥甲基氨基甲烷［（ＣＨ２ＯＨ）３ＣＮＨ２］。

３．１．２苯酚（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）。３．１．３濃鹽酸（ＨＣｌ）。３．１．４氫氧化鈉（ＮａＯＨ）。

３．１．５膽堿氧化酶：≥１０Ｕ／ｍｇ，置于－２０℃保存。

３．１．６過氧化物酶：≥２５０Ｕ／ｍｇ，置于２℃～８℃保存。

３．１．７４氨基安替比林（Ｃ１Ｈ１３Ｎ３Ｏ）。

３．１．８磷脂酶Ｄ：≥６０Ｕ／ｍｇ，置于－２０℃保存。

３．２試劑配制

３．２．１鹽酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：量?。福担恚虧恹}酸注入約９０ｍＬ水中，稀釋至１００ｍＬ。

３．２．２鹽酸溶液（３ｍｏｌ／Ｌ）：量?。玻担埃恚虧恹}酸注入約６０ｍＬ水中，稀釋至１００ｍＬ。

３．２．３三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液（Ｔｒｉｓ）（０．０５ｍｏｌ／Ｌ）：準確稱?。叮埃担罚缛u甲基氨基甲烷溶于５０ｍＬ水中，用鹽酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）調(diào)ｐＨ至８．０±０．２，再用水定容至１００ｍＬ。此溶液在４℃冰箱中可保存１個月。

３．２．４顯色劑：?。保玻埃盏哪憠A氧化酶、２８０Ｕ的過氧化物酶、１０Ｕ的磷脂酶Ｄ、１５ｍｇ４氨基安替比

林和５０ｍｇ苯酚置于１０ｍＬ的容量瓶中，用０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ緩沖溶液溶解并定容。臨用現(xiàn)配。

３．２．５氫氧化鈉溶液（５０ｇ／Ｌ）：稱取５０ｇ氫氧化鈉，溶于水并稀釋至１００ｍＬ，采用塑料容器儲存。

１

３．３標準品

膽堿酒石酸氫鹽標準品（Ｃ９Ｈ１９ＮＯ７，相對分子質(zhì)量：２５３．２５，ＣＡＳ號：８７６７２）：純度≥９％，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)。

３．４標準溶液配制

３．４．１膽堿（以膽堿氫氧化物計，相對分子質(zhì)量１２１．１８）標準儲備溶液（２５０ｍｇ／Ｌ）：準確稱取在１０２℃±２℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽５２．５ｍｇ，用水溶解并轉(zhuǎn)移至１０ｍＬ容量瓶中定容，混勻。４℃以下避光保存，有效期３個月。

３．４．２膽堿標準工作溶液（２５０ｍｇ／Ｌ）：吸取１０．０ｍＬ膽堿標準儲備溶液于１０ｍＬ容量瓶中，用水定

容，混勻，４℃以下避光保存，有效期１個月。

３．５材料

３．５．１０．４５μｍ水性濾膜針頭濾器。

３．５．２注射器：５ｍＬ或相當者。

４儀器和設(shè)備

４．１分析天平：感量分別為０．１ｍｇ和０．０１ｇ。

４．２恒溫水浴裝置：溫度可控制在７０℃±２℃和３７℃±２℃。

４．３ｐＨ計：精度０．０１。

４．４分光光度計。

５分析步驟

５．１樣品前處理

５．１．１樣品預(yù)處理

準確稱取２０ｇ（精確至０．０１ｇ）混合均勻的液態(tài)試樣于１０ｍＬ錐形瓶中，加入３ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸溶液１０ｍＬ，加塞混勻。

準確稱取５ｇ（精確至０．０１ｇ）混合均勻的半固態(tài)或固態(tài)試樣于１０ｍＬ錐形瓶中，加入１ｍｏｌ／Ｌ的

鹽酸溶液３０ｍＬ，加塞混勻。

５．１．２水解

將裝有試樣的容器放在７０℃±２℃水浴中，放置３ｈ（每隔３０ｍｉｎ振搖一次），冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液（５０ｇ／Ｌ）調(diào)ｐＨ至３．５～４．０，轉(zhuǎn)入５０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。

５．１．３過濾

用濾紙過濾水解液，若濾液不澄清，用０．４５μｍ水性濾膜針頭濾器再次過濾。收集濾液待測。

５．２測定

５．２．１標準曲線的制作

分別吸取２．０ｍＬ、４．０ｍＬ、６．０ｍＬ、８．０ｍＬ、１０．０ｍＬ膽堿標準工作溶液（２５０ｍｇ／Ｌ）于１０ｍＬ

２

的容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，配制成濃度分別為５０．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ的標準系列工作溶液。準備６支比色管，一個比色管用作試劑空白（Ａ），加入１０μＬ水，另５支比色管對應(yīng)加入標準系列工作溶液各１０μＬ，再分別加入３．０ｍＬ顯色劑，混勻，把比色管置于３７℃±２℃水浴中保溫反應(yīng)１５ｍｉｎ。

５．２．２試樣準備

準備２支比色管（Ｂ，Ｃ），均加入待分析溶液１０μＬ，比色管Ｂ加入３．０ｍＬ水，比色管Ｃ加入３．０ｍＬ顯色劑，混勻，把比色管置于３７℃±２℃水浴中保溫反應(yīng)１５ｍｉｎ。

５．２．３比色測定

將標準系列工作溶液及試樣從水浴中取出，冷卻至室溫。在波長５０５ｎｍ處，用水作空白，用１ｃｍ微量比色皿測定吸光值。以膽堿標準溶液的濃度為橫坐標，以標準溶液的吸光值減去試劑空白（比色管Ａ）的吸光值為縱坐標，制作標準曲線。

６分析結(jié)果的表述

６．１凈吸光值的計算

通常配制的試劑會產(chǎn)生輕微顏色，且由于水解作用濾液也不是無色的，為了除去這些干擾因素，必須從總吸光值中減去各自的空白值（比色管Ａ和比色管Ｂ）。

試樣凈吸光值按式（１）計算：

式中：

犃——試樣凈吸光值；

犃ｔ——總吸光值（比色管Ｃ）；犃ｂ——試劑吸光值（比色管Ａ）；

犃ｅ——濾液吸光值（比色管Ｂ）。

犃＝犃ｔ－犃ｂ－犃ｅ （１）

犃ｂ和犃ｅ不應(yīng)大于總吸光值的２０％。

６．２膽堿含量的計算

試樣中的膽堿（以膽堿氫氧化物計）的含量按式（２）計算：

犡＝

犮×犞×犳×１０

犿×１００

…………（２）

式中：

犡——試樣中的膽堿（以膽堿氫氧化物計）含量，單位為毫克每百克（ｍｇ／１０ｇ）；犮——自標準曲線上查得凈吸光值對應(yīng)的膽堿的濃度，單位為毫克每升（ｍｇ／Ｌ）；犞——水解液被稀釋的體積（水解液定容體積，通常為５０ｍＬ），單位為毫升（ｍＬ）；犳——稀釋倍數(shù)；

１０——換算系數(shù)；

犿 ——試樣的質(zhì)量，單位為克（ｇ）；

１００——換算系數(shù)。

計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

３

７精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的１０％。

８其他

當固態(tài)或半固態(tài)試樣稱樣量為５ｇ時，方法的檢出限為１ｍｇ／１０ｇ，定量限為３ｍｇ／１０ｇ；當液態(tài)試樣稱樣量為２０ｇ時，方法的檢出限為０．３ｍｇ／１０ｇ，定量限為０．８ｍｇ／１０ｇ。

第二法 離子色譜法

９原理

試樣經(jīng)酸水解，固相萃取柱凈化后離子色譜分離，電導(dǎo)檢測器檢測，外標法定量。

１０試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為ＧＢ／Ｔ６８２規(guī)定的一級水。

１０．１試劑

１０．１．１濃鹽酸（ＨＣｌ）。

１０．１．２甲烷磺酸（ＣＨ４Ｏ３Ｓ）：色譜純。

１０．２試劑配制

１０．２．１鹽酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：量?。福担恚虧恹}酸注入約９０ｍＬ水中，稀釋至１００ｍＬ。１０．２．２鹽酸溶液（１．７ｍｏｌ／Ｌ）：量取１４５ｍＬ濃鹽酸注入約８０ｍＬ水中，稀釋至１００ｍＬ。１０．２．３甲烷磺酸溶液（６ｍｍｏｌ／Ｌ）：吸取０．３９０ｍＬ甲烷磺酸并稀釋至１００ｍＬ。

１０．２．４甲烷磺酸溶液（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）：吸取０．９７４ｍＬ甲烷磺酸并稀釋至１００ｍＬ。

１０．２．５甲烷磺酸溶液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）：吸取１．６２ｍＬ甲烷磺酸并稀釋至１００ｍＬ。

１０．３標準品

膽堿酒石酸氫鹽標準品（Ｃ９Ｈ１９ＮＯ７，相對分子質(zhì)量：２５３．２５，ＣＡＳ號：８７６７２）：純度≥９％，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)。

１０．４標準溶液配制

１０．４．１膽堿（以膽堿氫氧化物計，相對分子質(zhì)量１２１．１８）標準儲備液（２５０ｍｇ／Ｌ）：準確稱取在１０２℃±２℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽５２．５ｍｇ，用水溶解并轉(zhuǎn)移至１０ｍＬ容量瓶中定容，混勻。４℃以下避光保存，有效期３個月。

１０．４．２膽堿標準工作液（１０ｍｇ／Ｌ）：吸?。玻埃恚躺鲜瞿憠A標準儲備液于５０ｍＬ容量瓶中，用

１５ｍｍｏｌ／Ｌ的甲烷磺酸溶液定容，混勻，４℃以下避光保存，有效期１個月。

１０．４．３膽堿標準系列工作液：分別吸取上述膽堿標準工作液０．２０ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．０ｍＬ、２．５０ｍＬ、

４

５．０ｍＬ于一組１０ｍＬ容量瓶中，用１５ｍｍｏｌ／Ｌ的甲烷磺酸溶液定容混勻，配得膽堿濃度為

０．２０ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ的標準系列工作液。臨用現(xiàn)配。

１０．５材料

１０．５．１０．４５μｍ水性濾膜針頭濾器。

１０．５．２凈化柱：Ｃ１８固相萃取小柱１．０ｍＬ或相當者。

１０．５．３注射器：５ｍＬ或相當者。

１ 儀器和設(shè)備

１．１離子色譜儀（ＩＣ）：配電導(dǎo)檢測器。

１．２分析天平：感量分別為０．１ｍｇ和０．０１ｇ。

１．３電熱恒溫水浴裝置：溫度可控制在７０℃±２℃。

１．４渦旋混合器。

１２分析步驟１２．１樣品前處理１２．１．１試樣提取

１２．１．１．１液態(tài)試樣

準確稱?。保埃纾ň_至０．０１ｇ）混合均勻的液體試樣于５０ｍＬ比色管中，加入１．７ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸溶液１５ｍＬ，加蓋，混勻后放入７０℃±２℃水浴中水解３ｈ（每３０ｍｉｎ搖一次）。將水解液冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至５０ｍＬ容量瓶并用水定容至刻度，混勻待用。

１２．１．１．２半固態(tài)或固態(tài)試樣

準確稱?。玻担纾ň_至０．０１ｇ）半固態(tài)或固體試樣于５０ｍＬ比色管中，加入１ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸溶液２５ｍＬ，加蓋，渦旋至試樣溶液中無結(jié)塊，混勻后放入７０℃±２℃水浴中水解３ｈ（每３０ｍｉｎ搖一次）。將水解液冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至５０ｍＬ容量瓶并用水定容至刻度，混勻待用。

１２．１．２試樣凈化

Ｃ１８固相萃取小柱（１．０ｍＬ）使用前依次用１０ｍＬ甲醇、１５ｍＬ水通過，靜置活化３０ｍｉｎ。用水稀釋提取溶液５０倍（可根據(jù)試樣中膽堿的濃度適當?shù)恼{(diào)整稀釋倍數(shù)，不得少于１０倍），取稀釋后的溶液約１５ｍＬ過０．４５μｍ水性濾膜和Ｃ１８固相萃取小柱（１．０ｍＬ），棄去前３ｍＬ，收集后面洗脫液待測。

１２．２儀器參考條件

ａ）離子色譜柱參數(shù)：裝有羧基的高容量陽離子交換柱，如ＩｏｎＰａｃＣＳ１２Ａ４ｍｍ×２５０ｍｍ（帶ＩｏｎＰａｃＣＧ１２Ａ型保護柱４ｍｍ×５０ｍｍ）或ＩｏｎＰａｃＣＳ１９４ｍｍ×２５０ｍｍ（帶ＩｏｎＰａｃＣＧ１９型保護柱４ｍｍ×５０ｍｍ），或等效色譜柱。

ｂ）ＩｏｎＰａｃＣＳ１２Ａ等度淋洗：１５ｍｍｏｌ／Ｌ甲烷磺酸溶液等度淋洗，采集時間２５ｍｉｎ。

ＩｏｎＰａｃＣＳ１９等度淋洗：６ｍｍｏｌ／Ｌ甲烷磺酸溶液等度淋洗，采集時間２５ｍｉｎ。

５

ｃ）流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。

ｄ）電導(dǎo)檢測器：配抑制器或等效抑制裝置。

ｅ）進樣量：１０μＬ。

１２．３標準曲線的制作

將標準系列工作液分別注入離子色譜儀，測定相應(yīng)的電導(dǎo)率峰面積或峰高。以標準系列工作液的濃度為橫坐標，以電導(dǎo)率峰面積或峰高為縱坐標，繪制標準曲線。

膽堿標準溶液的離子色譜圖參見附錄Ａ。

１２．４試樣溶液的測定

將試樣溶液注入離子色譜儀中，得到相應(yīng)的電導(dǎo)率峰面積或峰高，根據(jù)標準曲線得到待測溶液中膽堿的濃度。

１２．５空白試驗

不稱取試樣，按照１２．１的步驟做空白試驗。應(yīng)確認不含有干擾待測組分的物質(zhì)。

１３分析結(jié)果的表述

犡＝

試樣中膽堿（以膽堿氫氧化物計）的含量按式（３）計算：

式中：

犮×犞×犳×１０犿×１００

…………（３）

犡 ——試樣中膽堿的含量，單位為毫克每百克（ｍｇ／１０ｇ）；

犮 ——由標準曲線得到的試樣溶液中膽堿（以膽堿氫氧化物計）的濃度，單位為毫克每升（ｍｇ／Ｌ）；

犞 ——定容的體積，單位為毫升（ｍＬ）；

犳 ——稀釋倍數(shù)；

１０——換算系數(shù)；

犿 ——試樣的取樣量，單位為克（ｇ）；

１００——換算系數(shù)。

計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

１４精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的１０％。

１５其他

當固態(tài)或半固態(tài)試樣稱樣量為２．５ｇ時，方法的檢出限為２ｍｇ／１０ｇ，定量限為６ｍｇ／１０ｇ；當液態(tài)試樣稱樣量為１０ｇ時，方法的檢出限為０．５ｍｇ／１０ｇ，定量限為２ｍｇ／１０ｇ。

６

１６原理

第三法 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

試樣經(jīng)酸水解后調(diào)節(jié)ｐＨ并過濾，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定和確認，同位素內(nèi)標法定量。

１７試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為ＧＢ／Ｔ６８２規(guī)定的一級水。

１７．１試劑

１７．１．１甲酸（ＨＣＯＯＨ）：色譜純。

１７．１．２乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色譜純。

１７．１．３甲酸銨（ＨＣＯＯＮＨ４）：純度≥９．９％。

１７．１．４濃鹽酸（ＨＣｌ）。

１７．１．５氫氧化鈉（ＮａＯＨ）：純度≥９．９％。

１７．２試劑配制

１７．２．１甲酸銨水溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）：稱?。埃叮常纾ň_至０．０１ｇ）甲酸銨，用水溶解后，用甲酸調(diào)節(jié)ｐＨ至５．０±０．１，轉(zhuǎn)移至１００ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。

１７．２．２鹽酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：量?。福担恚虧恹}酸注入約９０ｍＬ水中，稀釋至１００ｍＬ。

１７．２．３氫氧化鈉溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：稱?。玻埃纾ň_至０．０１ｇ）氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至５０ｍＬ。

１７．２．４乙腈水溶液（８０％）：?。福埃恚桃译?，用水稀釋至１０ｍＬ。

１７．３標準品

１７．３．１膽堿酒石酸氫鹽標準品（Ｃ９Ｈ１９ＮＯ７，相對分子質(zhì)量：２５３．２５，ＣＡＳ號：８７６７２）：純度≥９％，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)。

１７．３．２穩(wěn)定同位素內(nèi)標：氯化膽堿犱４（Ｃ５Ｈ１０ＮＯＤ４Ｃｌ，相對分子質(zhì)量：１４３．６５，ＣＡＳ號：２８５９７９７０６）：純度≥９．８％，或相當者。

１７．４標準溶液配制

１７．４．１膽堿（以膽堿氫氧化物計，相對分子質(zhì)量１２１．１８）標準儲備液（１０ｍｇ／Ｌ）：準確稱取在１０２℃±２℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽２０．９０ｍｇ，用８０％的乙腈水溶液溶解并定容至１０ｍＬ。搖勻后將溶液轉(zhuǎn)移至棕色玻璃瓶中，４℃以下避光保存，有效期１個月。

１７．４．２膽堿標準工作液（１．０ｍｇ／Ｌ）：吸?。保埃恚躺鲜瞿憠A標準儲備液于１０ｍＬ容量瓶中，用

１０ｍｍｏｌ／Ｌ的甲酸銨水溶液定容，混勻。臨用現(xiàn)配。

１７．４．３膽堿犱４內(nèi)標儲備液（１００ｍｇ／Ｌ）：準確稱?。保常常恚缏然憠A犱４，用８０％乙腈水溶液溶解并轉(zhuǎn)移至１０ｍＬ棕色容量瓶中定容，混勻，４℃避光保存，有效期３個月。

１７．４．４膽堿犱４內(nèi)標工作液（１．０ｍｇ／Ｌ）：吸取０．１０ｍＬ上述膽堿犱４內(nèi)標儲備液于１０ｍＬ容量瓶中，

用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的甲酸銨水溶液定容，混勻，４℃以下避光保存，有效期１個月。

１７．４．５標準系列工作液：分別準確吸取上述膽堿標準工作液０．１０ｍＬ、０．２０ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．０ｍＬ、

７

１．５０ｍＬ、２．０ｍＬ至１０ｍＬ容量瓶中，各加入５０μＬ膽堿犱４內(nèi)標工作液，用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的甲酸銨水溶液定容混勻，該標準系列的膽堿濃度分別為０．０１０ｍｇ／Ｌ、０．０２０ｍｇ／Ｌ、０．０５０ｍｇ／Ｌ、０．１０ｍｇ／Ｌ、０．１５０ｍｇ／Ｌ、０．２０ｍｇ／Ｌ。臨用現(xiàn)配。

１７．５材料

１７．５．１０．２μｍ水性濾膜針頭濾器。

１７．５．２注射器：５ｍＬ或相當者。

１８儀器和設(shè)備

１８．１液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ＥＳＩ）。１８．２分析天平：感量分別為０．０１ｍｇ和０．０１ｇ。１８．３恒溫水浴裝置：溫度可控制在７０℃±２℃。１８．４ｐＨ計：精度０．０１。

１８．５超聲波清洗器。

１９分析步驟

１９．１樣品前處理

１９．１．１液態(tài)或半固態(tài)試樣

準確稱?。玻担纭保埃纾ň_至０．０１ｇ）試樣，用溫水溶解后，轉(zhuǎn)移至２５ｍＬ容量瓶中，冷卻至室溫后，用水定容，混勻。吸取１ｍＬ樣液于５０ｍＬ比色管中，備用。

１９．１．２固態(tài)試樣

準確稱?。保纭担纾ň_至０．０１ｇ）試樣，用溫水溶解后，轉(zhuǎn)移至１０ｍＬ容量瓶中，冷卻至室溫后，

用水定容，混勻。吸?。保恚虡右河冢担埃恚瘫壬苤?，備用。

１９．１．３試樣提取

在上述比色管中，加１００ｍｇ／Ｌ的膽堿犱４內(nèi)標儲備液５０μＬ后，加入１ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸溶液１０ｍＬ，小心搖晃均勻，超聲振蕩５ｍｉｎ。樣液在７０℃±２℃水浴中加熱３ｈ（每隔３０ｍｉｎ搖勻一次），冷卻至室溫后用１ｍｏｌ／Ｌ的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ｐＨ至５．０～５．３，轉(zhuǎn)移至１０ｍＬ容量瓶，用水定容，混勻。然后用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的甲酸銨水溶液稀釋１０倍后，經(jīng)０．２μｍ水性濾膜過濾至進樣瓶中，待測。

１９．２儀器參考條件

１９．２．１液相色譜參考條件

ａ）色譜柱：Ａｍｉｄｅ色譜柱（１．７μｍ，２．１ｍｍ×１０ｍｍ），或相當者。ｂ）流動相Ａ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸銨水溶液；流動相Ｂ：乙腈。

ｃ）流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ。

ｄ）柱溫：４０℃。

ｅ）進樣體積：２μＬ。

８

ｆ）梯度洗脫條件見表１。

表１梯度洗脫條件

時間／ｍｉｎ

流動相Ａ／％

流動相Ｂ／％

０～１．０

１０

９０

１．０～３．０

４０

６０

３．０～４．０

４０

６０

４．０～５．０

１０

９０

５．０～８．０

１０

９０

１９．２．２質(zhì)譜參考條件

ａ）電離模式：ＥＳＩ＋。

ｂ）檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（ＭＲＭ）。

ｃ）毛細管電壓：３．１ｋＶ。ｄ）離子源溫度：１５０℃。ｅ）輔助氣溫度：３５０℃。ｆ）輔助氣流量：６０Ｌ／ｈ。

ｇ）錐孔吹掃氣流量：１５０Ｌ／ｈ。

ｈ）ＬＭ２射頻透鏡電壓：２．７５Ｖ。ｉ）ＨＭ２射頻透鏡電壓：１４．９Ｖ。其他主要質(zhì)譜參數(shù)條件參見表２。

表２主要質(zhì)譜參數(shù)

化合物

母離子（犿／狕）

錐孔電壓／Ｖ

子離子（犿／狕）

碰撞能量／ｅＶ

膽堿

１０４．０

２５

６０．０／４５．０

１５

氯化膽堿犱４

１０８．０

２５

６０．０／４９．０

１５

注：為定量子離子。

１９．３標準曲線的制作

按膽堿標準系列工作液濃度由低到高分別注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，以膽堿濃度為橫坐標，以膽堿與氯化膽堿犱４內(nèi)標峰面積比（犃膽堿／犃氯化膽堿犱４）和氯化膽堿犱４質(zhì)量濃度的乘積為縱坐標，繪制膽堿的標準曲線。

１９．４試樣溶液的測定

１９．４．１定性測定

試樣溶液中膽堿和氯化膽堿犱４的響應(yīng)值均應(yīng)在檢測的線性范圍之內(nèi)。試樣溶液中的離子相對豐度與標準溶液的離子相對豐度比應(yīng)符合表３的要求。膽堿標準溶液質(zhì)譜掃描圖及標準溶液、內(nèi)標多反

應(yīng)監(jiān)測（ＭＲＭ）圖參見附錄Ｂ。

９

表３試樣溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍

相對豐度／％

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