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文檔簡介

1、第九章 微生物發(fā)酵技術(shù)第一節(jié) 微生物發(fā)酵概論第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵的工藝流程第三節(jié) 工業(yè)發(fā)酵的主要產(chǎn)品第1頁,共22頁。 發(fā)酵工程是一門具有悠久歷史,又融合了現(xiàn)代科學(xué)的技術(shù),是現(xiàn)代生物技術(shù)的組成部分。本章主要介紹發(fā)酵工程的基本內(nèi)容和基本原理,重點介紹了工業(yè)發(fā)酵的工藝流程,還介紹了典型產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)工藝,如青霉素,谷氨酸和維生素C的生產(chǎn)。第2頁,共22頁。第一節(jié) 微生物發(fā)酵概論1857年巴斯德提出著名發(fā)酵理論:“一 切發(fā)酵過程都是微生物作用的結(jié)果?!?1929年Flemming爵士發(fā)現(xiàn)了青霉素,增加一大類新產(chǎn)品-抗生素。20世紀(jì)40年代,以獲取細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物-抗生素為主要特征的抗生素工業(yè)成為微生物

2、發(fā)酵工業(yè)技術(shù)的支柱產(chǎn)業(yè)。20世紀(jì)50年代,氨基酸發(fā)酵工業(yè)又成為微生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的又一個成員,實現(xiàn)了對微生物的代謝進行人工調(diào)節(jié),這又使微生物技術(shù)進了一步。20世紀(jì)60年代,微生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)又增加了酶制劑工業(yè)這一成員。20世紀(jì)70年代,為了解決由于人迅速增長而帶來的糧食短缺問題,進行了非碳水化合物代替碳水化合物的發(fā)酵,如利用石油化工原料進行發(fā)酵生產(chǎn),培養(yǎng)單細(xì)胞蛋白,進行污水處理,能源開發(fā)等。80年代以來,隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展,可以按人類社會的需要,定向培養(yǎng)出有用的菌株,這為微生物發(fā)酵技術(shù)引入了遺傳工程的技術(shù),使微生物技術(shù)進入了一個新的階段。 目前,人們把利用微生物在有氧或無氧狀態(tài)下生命活動來制備微

3、生物菌體或其它代謝產(chǎn)物的過程統(tǒng)稱為發(fā)酵。 一、微生物發(fā)酵的概念及發(fā)展史第3頁,共22頁。1.微生物菌體發(fā)酵 是以獲得具有某種用途的菌體為目的的發(fā)酵。用于面包制作的酵母發(fā)酵及用于人類或動物食品的微生物菌體蛋白發(fā)酵是比較傳統(tǒng)的菌體發(fā)酵工業(yè)。新的菌體發(fā)酵可用來生產(chǎn)藥用真菌,如香菇菌、依賴蟲蛹而生存的冬蟲夏草菌、與天麻共存的密環(huán)菌等藥用菌。2.微生物酶發(fā)酵 酶普遍存在于動物、植物和微生物中。因為微生物種類多、產(chǎn)酶的品種多、生產(chǎn)容易和成本低等特點,所以目前工業(yè)應(yīng)用的酶大多來自微生物發(fā)酵。3.微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵 微生物代謝產(chǎn)物很多。在菌體對數(shù)生長期所產(chǎn)生的產(chǎn)物,如氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)和糖類等是菌體生長繁

4、殖所必需的,這些產(chǎn)物叫做初級代謝產(chǎn)物。在菌體生長靜止期,某些菌體能合成一些具有特定功能的產(chǎn)物,如抗生素、生物堿、植物生長因子等。這些產(chǎn)物與菌體生長繁殖無明顯關(guān)系,叫做次級代謝產(chǎn)物。 二、微生物發(fā)酵的類型第4頁,共22頁。4.微生物的轉(zhuǎn)化發(fā)酵 微生物的轉(zhuǎn)化是利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶,把一種化合物轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有經(jīng)濟價值的產(chǎn)物??蛇M行的轉(zhuǎn)化反應(yīng)包括:脫氫反應(yīng)、氧化反應(yīng)、脫水反應(yīng)、縮合反應(yīng)、氨化反應(yīng)、脫氨反應(yīng)等。 5.生物工程細(xì)胞的發(fā)酵 是指利用生物工程技術(shù)所獲得的細(xì)胞,如DNA重組的“工程菌”,細(xì)胞融合所得的“雜交”細(xì)胞等進行培養(yǎng)的新型發(fā)酵。此類發(fā)酵的產(chǎn)物多種多樣,如用基因工程菌生產(chǎn)胰島素

5、、干擾素等。第5頁,共22頁。優(yōu)良的微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵,微生物資源非常豐富,廣泛分布于土壤、水和空氣中,尤以土壤中為最多1.從微生物分類學(xué)的角度把所需菌種分為:細(xì)菌類如短桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌等;酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、漢遜酵母和假絲酵母等;霉菌如黃曲霉、紅曲霉、青霉菌和赤霉菌等;放線菌如各種抗生素,鏈、慶大等。2.作為工業(yè)微生物發(fā)酵使用的菌種,通常有以下特點:(1)具有穩(wěn)定的遺傳學(xué)特性。(2)微生物生長和產(chǎn)物的合成對于基質(zhì)沒有嚴(yán)格的要求。 (3)生長條件易于滿足。(4)具有較高的各種酶活力。(5)對于包含體,要求在細(xì)胞破碎是不易破碎,

6、而在目的產(chǎn)物的分離提出時,則易破碎。三、微生物發(fā)酵工業(yè)所用菌種第6頁,共22頁。1.微生物發(fā)酵過程是一個典型的化工過程。2.微生物發(fā)酵過程是一個典型的代謝控制發(fā)酵。3.微生物發(fā)酵工業(yè)又是一個有別于化工過程的一個工業(yè)。微生物發(fā)酵主要有以下幾個特征:(1)反應(yīng)條件溫和。通常由于微生物的生理特性,要求溫度為3040、pH值中性偏酸性如酵母、霉菌、放線菌的發(fā)酵和pH值中性偏堿性如細(xì)菌的發(fā)酵。(2)無菌發(fā)酵,整個反應(yīng)過程要求無菌。培養(yǎng)基無菌、空氣無菌、補料和取樣要求無菌操作、某些工程菌,其尾氣也要求進行無菌處理。(3)非連續(xù)性生產(chǎn)。微生物的生理特性決定了發(fā)酵過程的非連續(xù)性,大部分的工業(yè)發(fā)酵是以間歇操作為

7、基礎(chǔ)進行的,目前可以實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)的是啤酒的連續(xù)化生產(chǎn)。四、微生物發(fā)酵的基本特征第7頁,共22頁。第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵的工藝流程 生物發(fā)酵工藝多種多樣,但基本上包括菌種的選育、菌種培養(yǎng)基的配制、擴大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過程下游處理即分離提純等幾個過程。找到合適的菌種是發(fā)酵工程的前提。人們最初是從自然界尋找所需要的菌種,如谷氨酸發(fā)酵時常用菌有谷氨酸棒狀桿菌等。但這種方法得到的菌種,產(chǎn)量一般都比較低。20世紀(jì)40年代,微生物學(xué)家開始用紫外線、激光、化學(xué)誘變劑等處理菌種,使菌種產(chǎn)生突變,以篩選出符合要求的優(yōu)良菌種。隨著細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)的日益成熟,科學(xué)家開始構(gòu)建工程細(xì)胞或工程菌,用它們進行發(fā)酵,甚至能

8、生產(chǎn)出一般微生物所不能生產(chǎn)的產(chǎn)品。 一、菌種的選育第8頁,共22頁。在大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中,需要將選育出的優(yōu)良菌種經(jīng)過多次擴大培養(yǎng),讓它們達到一定數(shù)量以后,再進行接種。二、菌種培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基是選擇出的菌種生活的環(huán)境,對菌種有多方面的影響,所以至關(guān)重要。一般來說,培養(yǎng)基的配方要經(jīng)過反復(fù)的實驗才能確定。另外,發(fā)酵工程中所用的菌種多要求是純培養(yǎng)的,即整個發(fā)酵過程不能混有雜菌,否則將導(dǎo)致產(chǎn)量大大下降,甚至得不到產(chǎn)品。例如,如果青霉素生產(chǎn)過程中污染了雜菌,這些雜菌會分泌青霉素酶,將形成的青霉素分解掉。因此,培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌。三、擴大培養(yǎng)和接種第9頁,共22頁。發(fā)酵過程一般是在發(fā)酵罐

9、內(nèi)進行的,發(fā)酵罐是一種圓柱形的容器,容量從幾升到幾百萬升,罐上除有通氣、攪拌、接種、加料、冷卻等裝置外,還有對溫度、pH、通氣量與轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件進行檢測和控制的裝置。 發(fā)酵過程中環(huán)境條件的變化,不僅會影響菌種的生長繁殖,而且會影響菌種代謝產(chǎn)物的形成。為了使發(fā)酵過程能順利進行,要隨時取樣,檢測培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)目、產(chǎn)物濃度,同時還要及時為發(fā)酵菌提供必需的營養(yǎng),并嚴(yán)格控制溫度、pH、溶氧、通氣量與轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件。四、發(fā)酵過程 第10頁,共22頁。發(fā)酵結(jié)束后,要對發(fā)酵液或生物細(xì)胞進行分離和提取精制,將發(fā)酵產(chǎn)物制成合乎要求的產(chǎn)品。對發(fā)酵產(chǎn)品的要求不同,分離提純的方法也相應(yīng)有些區(qū)別。利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的產(chǎn)品

10、有菌種代謝產(chǎn)物和菌種本身(如酵母菌和細(xì)菌)兩大類,如果產(chǎn)品是菌種,分離方法一般是通過過濾、沉淀從培養(yǎng)液中分離出;如果產(chǎn)品是代謝產(chǎn)物,則采用蒸餾、萃取、離子交換等方法提取。分離提純后的產(chǎn)品,還要經(jīng)過質(zhì)量檢查合格后,才能成為正式產(chǎn)品。 五、分離提純 第11頁,共22頁。工藝流程第12頁,共22頁。第三節(jié) 工業(yè)發(fā)酵的主要產(chǎn)品一、抗生素發(fā)酵生產(chǎn) 抗生素是生物體在生命活動中產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物。這類有機物質(zhì)能在低濃度下抑制或殺滅活細(xì)胞,這種作用又有很強的選擇性??股刂饕梦⑸锇l(fā)酵法生產(chǎn),少數(shù)抗生素也可用化學(xué)方法合成,人們還對天然得到的抗牛素進行生化或化學(xué)改造,使其具有更優(yōu)越的性能,這樣得到的抗生素

11、叫半合成抗生素,其數(shù)目已達到兩萬多種??股夭粌H廣泛用于臨床醫(yī)療,而且已經(jīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧及環(huán)保等領(lǐng)域。 青霉素是最早發(fā)現(xiàn)并用于臨床的種抗生素,1928年為英國人A . Fleming發(fā)現(xiàn),40年代投入工業(yè)生產(chǎn)。在二戰(zhàn)期間立刻大顯身手,它能有效控制傷口的細(xì)菌感染,挽救了數(shù)百萬戰(zhàn)爭中受傷者的性命。我們就以青霉素為例簡單介紹抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)過程。第13頁,共22頁。 (一)青霉素發(fā)酵生產(chǎn)菌株 最初由弗萊明分離的點青霉,只能產(chǎn)生2 Uml的青霉素。目前全世界用于生產(chǎn)青霉素的高產(chǎn)菌株,大都由菌株Wis Q l76(一種產(chǎn)黃青霉)經(jīng)不同改良途徑得到。70年代前育種采用誘變和隨機篩選方法,后來由于原生質(zhì)體融

12、合技術(shù)、基因克隆技術(shù)等現(xiàn)代育種技術(shù)的應(yīng)用,青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)水平已達85 000Uml以上。青霉素生產(chǎn)菌株一般在真空冷凍干燥狀態(tài)下保存其分生孢子,也可以用甘油或乳糖溶劑作懸浮劑,在70度冰箱或液氮中保存孢子懸浮液和營養(yǎng)菌絲體。第14頁,共22頁。(二)青霉素發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基1、碳源目前普遍采用淀粉經(jīng)酶水解的葡萄糖糖化液進行流加。 2、氮源可選用玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩質(zhì)粉,并補加無機氮源。 3、前體苯乙酸或苯乙酰胺,由于它們對青霉菌有一定毒性,故一次加入量不能大于01,并采用多次加入方式。 4、無機鹽 包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類,鐵離子對青霉菌有毒害作用,應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵波中鐵含量在3

13、0ugml以下。第15頁,共22頁。(三)青霉素發(fā)酵工藝1.種子制備 種子制備階段以生產(chǎn)豐富的孢子(斜面和大米孢子培養(yǎng))或大量健壯的菌絲體(種子罐)為目的。 2.發(fā)酵培養(yǎng) 影響青霉素發(fā)酵產(chǎn)率的因素有環(huán)境因素,如pH值、溫度、溶氧飽合度、碳氮組份含量等;有生理變量因素,包括菌絲濃度、菌絲生長速度、菌絲形態(tài)等,對它們都要進行嚴(yán)格控制。3.發(fā)酵后處理(1)過濾:采用鼓式真空過濾器,過濾前加去乳化劑并降溫(2)提煉用溶媒萃取法。將發(fā)酵濾液酸化至pH 2,加1/3體積的醋酸丁酯,混合后以碟片式離心機分離,得一次BA提取液。然后以1.3 % 1.9 %NaHCO3在pH 6.8 7.1條件下將青霉素從BA

14、中提取到緩沖液中。再調(diào)pH至2.0,將青霉素從緩沖液再次轉(zhuǎn)入到BA中,方法同上,二次BA提取液。第16頁,共22頁。(3)脫色 在二次B A提取液中加活性炭150 一300g10億單位,脫色、過濾。(4)結(jié)晶 用丁醇共沸結(jié)晶法。將二次BA萃取以0.5 mol/L NaOH 液萃取,調(diào)pH至6.4 6.8,得青霉素鈉鹽水濃縮液。加34倍體積的丁醇,在1626,510 mmHg下真空蒸餾,將水與丁醇共沸物蒸出,并隨時補加丁醇。當(dāng)濃縮到原來水濃縮體積,蒸出餾分中含水達2 4 時,即停止蒸餾。 青霉素鈉鹽結(jié)晶析出,過濾,將晶體洗滌后進行干燥得成品??稍?0,20mmHg真空中烘16 h,然后磨粉、裝桶

15、。第17頁,共22頁。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,是人體及動物的重要營養(yǎng)物質(zhì)。谷氨酸是一種重要的氨基酸。我們就以谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)為例簡單介紹一下氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)。(一)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種 谷氨酸酵生產(chǎn)菌種主要有棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬的細(xì)菌。除節(jié)桿菌外,其他三屬中有許多菌種適用于糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵。這些細(xì)菌都是需氧微生物,都需要以生物素為生長因子。我國谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)所用菌種有北京棒狀桿菌AS1299、鈍齒棒狀桿菌AS1542、HU7251及7338、B9等。這些菌株的斜面培養(yǎng)一般采用由蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉等組成,pH為7.0 7.2的瓊脂培養(yǎng)基,32 培養(yǎng)24 h,冰箱

16、保存?zhèn)溆?。二、氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)第18頁,共22頁。(二)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的原料制備 谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)以淀粉水解糖為原料。淀粉水解糖的制備一般有酸水解法和酶水解法兩種。國內(nèi)常用的是淀粉酸水解工藝 。(三)菌種擴大培養(yǎng)(1)一級種子培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)基,由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳等組成,pH為6.5 6.8;三角瓶內(nèi)32 振蕩培養(yǎng)12h,貯于4 冰箱備用。(2)二級種子培養(yǎng)培養(yǎng)基除用水解糖代替葡萄糖外,其他與一級種子培養(yǎng)基相仿。種子罐內(nèi)32 通氣攪拌培養(yǎng)7 10 h,即可移種或冷卻至10 備用。第19頁,共22頁。(四)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn) 發(fā)酵初期,菌體生長遲滯,約2 4 h后

17、即進入對數(shù)生長期,代謝旺盛,糖耗快,這時必須流加尿素以供給氮源并調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH 值至7.5 8.0,同時保持溫度為30 32 。本階段主要是菌體生長,幾乎不產(chǎn)酸,菌體內(nèi)生物素含量由豐富轉(zhuǎn)為貧乏,時間約12 h。隨后轉(zhuǎn)入谷氨酸合成階段,此時菌體濃度基本不變,糖與尿素分解后產(chǎn)生的- 酮戊二酸和氨主要用來合成谷氨酸。這一階段應(yīng)及時流加尿素以提供氨及維持谷氨酸合成最適pH 7.2 7.4,需大量通氣,并將溫度提高到谷氨酸合成最適溫度34 37 。發(fā)酵后期,菌體衰老,糖耗慢,殘?zhí)堑?,需減少流加尿素量。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)耗盡,谷氨酸濃度不再增加時,及時放罐,發(fā)酵周期約為30 h。第20頁,共22頁。(五)谷氨酸提取 谷氨酸提取有等電點法、離子交換法、金屬鹽沉淀法、鹽酸鹽法和電滲析法,以及將上述方法結(jié)合使用的方法。國內(nèi)多采用的是等電點法。 三、維生素發(fā)酵生產(chǎn)維生素C又稱抗壞血酸(ascorbicacid),能參與人體內(nèi)多種代謝過程,使組織產(chǎn)生膠原質(zhì),影響毛細(xì)血管的滲透性及血漿的凝固,刺激人體造血功能,增強機體的免疫力。另外,由于它具有較強的還原能力,可作為抗氧化劑,已在醫(yī)藥、食品工業(yè)等方面獲得廣泛應(yīng)用。我國利用一種微生物將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L古龍酸,再經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)維生素C,稱為兩步發(fā)酵工藝。此法使產(chǎn)品產(chǎn)量得到大幅度提高,限于篇幅,僅簡單介紹如下:第21頁,共22頁。 第一步發(fā)

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