10基因工程基因文庫的構(gòu)建課件

1、第六部分 基因文庫的構(gòu)建一、基因文庫的概述二、基因組DNA文庫的構(gòu)建三、cDNA文庫的構(gòu)建1、基因文庫(gene library)概念是指將某種生物的全部基因組的遺傳信息貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應(yīng)用它分離所需要的目的基因，這種保存基因遺傳信息的材料，就稱為基因文庫又稱DNA文庫?；蛭膸煊赏庠碊NA片段、載體和宿主細(xì)胞組成。一、基因文庫的概述2、基因文庫的分類基因組DNA：提取的染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達的調(diào)控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列，有關(guān)這類的信息就只能從染色體基因組DNA中獲得。cDNA：mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 。如果

2、研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列直接推導(dǎo)出來。基因組文庫（genomic library）含有全部基因。 cDNA文庫（cDNA library）含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因。 用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA。用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA。在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫。(1)基因組文庫(Genomic library

3、)是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落，這個群體就稱為該生物基因組文庫。目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因?；蚪M文庫根據(jù)DNA來源分為：核基因組文庫、葉綠體基因組文庫、線粒體基因組文庫?？寺⊥庠?DNA片段的切割主要采用機械斷裂或限制性部分酶解兩種方法，其基本原則：DNA 片段之間存在部分重疊序列。DNA 片段大小均一。(2) cDNA文庫 (cDNA library) ：是指將某種生物體某一發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形

4、成的克隆的集合。cDNA(complementary DNA，互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補DNA?；蚪M文庫與cDNA文庫的最大區(qū)別：基因組文庫含有而cDNA文庫不含有非轉(zhuǎn)錄的基因組序列。2022/7/3163、構(gòu)建基因文庫的基本方法將特定生物體的因組DNA或cDNA分解成適當(dāng)大小的DNA片段,然后分別與克隆載體連接成重組DNA分子。通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將帶有不同DNA片段的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，獲得一套包含特定生物體所有DNA序列的克隆。二、基因組文庫的構(gòu)建(一)基因組文庫的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫

5、、粘粒文庫、人工染色體文庫（細(xì)菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫等）。(二)基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )（三）基因組DNA文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因組DNA文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分 隔克隆?？寺∨c克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以 利于克隆排序?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選。(四)基因組文庫構(gòu)

6、建的一般步驟 載體的選擇和制備。 高純度、大分子量基因組 DNA 的提取。 基因組 DNA 的部分酶切與分級分離。 載體與DNA片段的連接。 轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。篩選鑒定基因組及保存。 載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)?；騦-DNA上述幾種載體的最大裝載量如下：用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌基因組DNA的制備為了最大限度保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組文

7、庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大（至少是插入片斷大小的35倍），文庫的重組率和完備性也就越高。用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100 kb左右如果先將細(xì)胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS蛋白酶K、RNaseA的緩沖液中浸泡，可獲得 100 kb大小的DNA片段。AAAA基因組DNA的切割用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)。保證DNA片段大小均一。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭。部分酶切法一般選用4堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如

8、：Sau3A或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！載體與DNA片段的連接在基因組文庫的構(gòu)建過程中，大量體系連接前先使用小體系連接來尋找最佳比例！方法一：粘末端連接方法二：人工接頭法轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的。進口感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)量穩(wěn)定的進口包裝蛋白?。ㄎ澹┗蚪M文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離。用堿性磷

9、酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團。在DNA片段的末端添加人工接頭 。（六）構(gòu)建基因組文庫應(yīng)注意的問題構(gòu)建一個文庫，插入DNA和載體DNA的質(zhì)量是成功與否的關(guān)鍵。基因組DNA應(yīng)當(dāng)非常純以適應(yīng)DNA的酶解，而且基因組DNA也應(yīng)足夠大（最好超過200kb）以獲得兩個末端的消化產(chǎn)物。 不論是載體DNA還是靶DNA不含外源片段是一個基本條件。污染少量探針順序或載體的基因組DNA將引起很大麻煩，這是因為在篩選過程中它們將被鑒定為所要的克隆。 部分消化產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是一組覆蓋整個基因組的隨機片段。識別4個堿基的限制酶要比識別6個堿基酶能產(chǎn)生更隨機的插入片段。部分消化所產(chǎn)生的片段應(yīng)能連接到設(shè)定的載體上。限制酶和

10、部分消化過程應(yīng)事先檢查。一些批次的酶質(zhì)量不夠高而導(dǎo)致產(chǎn)生的DNA片段末端不能有效地連接。如果預(yù)期結(jié)果沒有出現(xiàn)，檢查限制酶和DNA濃度及純度。在考慮把噬菌體臂和插入DNA片段連接過程中有兩個重要參數(shù)：噬菌臂和潛在插入片段的比例、基因組DNA的濃度和純度。大約10pg噬菌臂和4gDNA能產(chǎn)生有效地包裝。對一個典型的基因組要產(chǎn)生一個可表達文庫，重組子數(shù)一般要大于11066l06。 包裝抽提物的包裝效率貯存于液氮中可保持1年多。而在-70中只能保存幾星期，而且包裝效率還會降低。由于包裝抽提物的質(zhì)量是一個關(guān)鍵性因素，商業(yè)性包裝抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。這種包裝提取

11、物質(zhì)量高，且在體外包裝噬菌體DNA和插入片段過程能產(chǎn)生大量的噬菌斑。（七)原核生物基因組文庫的構(gòu)建1、原核生物基因組的提取染色體DNA質(zhì)粒DNA要求：制備的DNA的長度為100-200kb。防止在制備過程中的機械斷裂。2、酶切片段與載體連接酶切片段及分離、純化基因組的不完全酶切根據(jù)實驗需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶 四個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/256 六個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/1024分離目的酶切片段大小的確定 克隆單個基因： 10 kb 克隆基因族： 20kbDNA不完全酶切條件的確定 確定限制酶用量，改變酶切時間 固定酶切時間，改變限制酶的用量DNA的不完全酶切酶切片段回

12、收低熔點瓊脂糖回收目的片段試劑盒回收目的片段酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇：質(zhì)粒載體可承載15kb DNA左右片段 載體可承載25kb DNA左右片段Cosmid 載體可承載45kb DNA左右片段3、重組DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞常見的宿主細(xì)胞：DH5、HB101、JM101、JM109重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1）轉(zhuǎn)化法(transformation)2）轉(zhuǎn)染法(transfection)3）轉(zhuǎn)導(dǎo)法(transduction)4、基因組DNA文庫克隆子保存與篩選基因組DNA文庫的保存文庫在液體培養(yǎng)基中擴增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股?/p>

13、素培養(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-80儲存（加終濃度為25%的甘油）。缺點：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致文庫中某些特定的序列過多或過少。保存單個克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-80保存。缺點：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大。基因組文庫的篩選表型篩選法：表達性狀易于鑒別，如互補篩選。抗性篩選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐。 二氨嘧啶降解，而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長。分子雜交法：利用分子探針對文庫進行篩選。免疫篩選法：利用多肽等作為抗原進行原位雜交 篩選。PCR篩選法：根據(jù)保

14、守序列合成引物,擴增特異性 片段。從基因文庫中迅速準(zhǔn)確地鎖定目的基因至關(guān)重要，其成敗與所掌握的有關(guān)目的基因的背景知識密切相關(guān)。目的基因的背景知識包括：目的基因的部分或全部堿基序列已知。目的基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或功能已知。目的基因與某些生物表型的相關(guān)性已知。(八)用噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的步驟準(zhǔn)備載體DNA(如置換型噬菌體載體)，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化并分離得到載體的左右兩臂。純化真核細(xì)胞高分子質(zhì)量DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶部分消化。分離適當(dāng)大小的基因組DNA片段(20-24kb)。連接載體與外源DNA。連接產(chǎn)物體外包裝及感染?；蚪M文庫的擴增?；蚪M文庫限制性內(nèi)切酶基因組DNA基

15、因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝三、cDNA文庫構(gòu)建真核生物基因組大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有大量的非編碼區(qū)、內(nèi)含子和重復(fù)序列等，直接利用基因文庫很難分離得到目的基因。即使分離到DNA片段，也要同cDNA序列進行比較。 mRNA是基因轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，且只在特定組織器官和發(fā)育時期表達。因此，從cDNA克隆文庫分離基因更具優(yōu)勢。此外，mRNA決定了功能蛋白質(zhì)的初始肽鏈的翻譯，可以用來研究蛋白質(zhì)的功能。(一)cDNA文庫的特征從cDNA文庫獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA,它不含真核基因的間隔序列及調(diào)控區(qū), 只反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)，并不是真正意義上的基因。cDNA文庫僅包含某種組織或細(xì)胞正在表達的基因。基

16、因總量少，顯然比基因組DNA文庫小得多，很容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達基因。cDNA文庫是有時效性的，文庫構(gòu)建時的信息供體是某一時空條件下的細(xì)胞總mRNA，它是在轉(zhuǎn)錄水平上反映該生物在某一特定發(fā)育時期，某一特定組織(或器官)在某種環(huán)境條件下的基因表達情況并不能包括該生物有機體的全部基因，不同物種、不同組織的cDNA文庫不同。(二)cDNA文庫的用途cDNA文庫可作為研究功能基因組學(xué)的基本手段。cDNA便于克隆和大量表達,因此可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因,并直接用于該目的基因的表達。cDNA文庫也可用于保護瀕危珍稀生物資源，提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針，可用于分離全長基因，

17、進而開展基因功能的研究。cDNA在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達狀態(tài)及表達基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，在個體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有廣泛的應(yīng)用價值。(三)cDNA文庫構(gòu)建的步驟細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離第一鏈cDNA合成第二鏈cDNA合成雙鏈cDNA的分級分離雙鏈cDNA克隆進質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖重組體的篩選與鑒定1、細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離mRNA的來源:選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。mRNA的制備:動物細(xì)胞或植物細(xì)胞mRNA的制備mRNA完整性的檢測哺乳動物mRNA長度

18、為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間。mRNA的提取全長mRNA具有一個polyA的3末端，可以被用于mRNA的分離?？梢杂霉丫劾w維素柱，選擇性地吸附mRNA。2、第一鏈cDNA的合成oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈 缺點：因為逆轉(zhuǎn)錄酶無法到達mRNA分子的5末端，必須從3末端開始合成cDNA。對于大分子量的較長的mRNA分子無法達到5末端。cDNA第一鏈的合成 隨機引物引導(dǎo)的cDNA合成法 ：根據(jù)許多可能的序列，合

19、成出6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，而不僅僅從3末端的oligo(dT)引物一處開始。比較容易合成特長的mRNA分子的5端序列隨機引物 cDNA 合成的方法不適合構(gòu)建cDNA 文庫，一般用于克隆特定 mRNA的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。3、第二鏈cDNA的合成cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補雙鏈cDNA的過程。cDNA第二鏈的合成的方法大致4種：自身引導(dǎo)合成法、置換合成法、引導(dǎo)合成法、引物銜接頭合成法。自身引

20、導(dǎo)合成法：獲得的單鏈cDNA3端會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以此作為第二鏈合成的引物，在Klenow酶或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點： S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時，會導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA 5端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。 S1核酸酶的純度不夠時，會偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。自身合成法：獲得的雙鏈cDNA5端會有幾對堿基缺失。置換合成法：cDNA 第一鏈合成反應(yīng)的產(chǎn)物 cDNAmRNA不經(jīng)變性直接與 RNA酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶混合，此時 RNA 酶 H 在雜合雙鏈的 mRNA 鏈上產(chǎn)生缺口（內(nèi)切作用）并形成部分 cDNA 單鏈區(qū)（外切作用）DNA 聚合酶則以殘存的

21、 mRNA作為引物合成 cDNA 第二鏈，最后用 T4DNA連接酶修復(fù)缺口。用這種方法獲得的 cDNA雙鏈分子含有殘留的一小段 RNA，但這并不影響后續(xù)的克隆操作。優(yōu)點：cDNA雙鏈合成效率高，操作簡捷無需對第一鏈合成產(chǎn)物進行額外的變性處理，更重要的是避免了 cDNA 雙鏈分子末端的缺損。置換合成法引物合成法：在第一鏈合成完畢后，變性殘留的 mRNA，用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶在 cDNA 游離的 3羥基上添加同聚物（dC）末端，然后將之與人工合成的 oligodG退火，形成引物結(jié)構(gòu)，在 Klenow 酶的作用下合成第二條 cDNA 鏈。引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列引物-銜

22、接頭法4、雙鏈cDNA的分級分離mRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開來。優(yōu)點：避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解增加了獲得全長cDNA克隆的概率。獲得更準(zhǔn)確的分級分離效果（分子量）。5、雙鏈cDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對雙鏈cDNA的末端進行加工是十分必要的。方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端。末端轉(zhuǎn)移酶可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補的尾部。6、利用PCR技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫能夠從極其有限的起始材料中構(gòu)建cDNA文庫。以總RNA為模板合成cDNA，無需mRNA的純化，不僅簡化操作，而且避免了低豐度信息分子的丟失。能夠提高cDNA文庫的完整性，獲得那些低水平表達的基因的cDNA克隆。此法對植物基因功能的研究，如對某種外界因素作用后或不