微生物的分類命名及鑒定課件

1、鄭州牧專動(dòng)物醫(yī)藥系微生物教研室第七章 微生物的分類命名及鑒定主要內(nèi)容:細(xì)菌的分類與命名病毒的分類與命名細(xì)菌分離鑒定病毒分離鑒定(一) 分類地位 細(xì)菌過去歸屬植物界，自1974年以來，劃為原核微生物。細(xì)菌作為原核微生物，除了狹義的細(xì)菌外,還包括對(duì)動(dòng)物和人具有致病作用的衣原體、立克次體、霉形體、螺旋體、放線菌等，此外還涉及藍(lán)細(xì)菌、紫色光合細(xì)菌等。 一、細(xì)菌的分類與命名(二) 細(xì)菌分類單元 屬種菌株 是具有共性的若干種的組合，應(yīng)與其他屬有明顯的差異。不同屬之間的16SrRnA序列有較大的差異，但尚未提出差異的量化標(biāo)準(zhǔn)。 是微生物學(xué)分類的最基本單元，種可認(rèn)為是一群性質(zhì)相似的菌株，它與其他菌株群體有明顯

2、差異。凡是16SrRNA序列同源性大于97%的兩株細(xì)菌即可確定為同一種。 是不同來源的某一種細(xì)菌的純培養(yǎng)物。同一種細(xì)菌可以有許多菌株，其主要性狀應(yīng)完全相同，其次要性狀可稍有差異。 細(xì)菌分類單位和動(dòng)植物一樣,也有綱、目、科、屬、種，種是最基本的分類單元，其次是屬。(三) 細(xì)菌的分類方法 1、傳統(tǒng)分類法 該方法是采用傳統(tǒng)的雙歧法進(jìn)行分類，即主要依據(jù)形態(tài)特征，其次是生理生化特征，然后在細(xì)菌的各種性狀中，選擇一項(xiàng)或數(shù)項(xiàng)被認(rèn)為是最主要的基本性質(zhì)，作為分類指征，在最高一級(jí)的分類等階上將細(xì)菌分成若干類別；然后在這些類別中選擇數(shù)項(xiàng)次要性狀為指征，將細(xì)菌作次一等階分類，依此類推，一直劃分到種。 其特點(diǎn)是隨機(jī)的和

3、非系統(tǒng)的。2、數(shù)值分類法 又稱表現(xiàn)型分類法。其原理是將多種分類依據(jù)如形態(tài)、著色性、有無鞭毛和芽孢、生化反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)需要及致病性等全部等同編號(hào)，并將全部數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，進(jìn)行運(yùn)算和比較，從數(shù)字角度來計(jì)算細(xì)菌間的相似值，從而確定各種細(xì)菌間的親緣關(guān)系。即將擬分類的細(xì)菌按其性狀相似程度歸類定位。其特點(diǎn)是采用多項(xiàng)分類依據(jù)。3、分子生物學(xué)分類法 20世紀(jì)80年代以來，細(xì)菌分類學(xué)家已從遺傳角度探索細(xì)菌各類群間的親緣關(guān)系。目前，測(cè)定細(xì)菌中DNA分子中（G+C）mol%的已成為細(xì)菌分類鑒定的重要遺傳指標(biāo)。由于細(xì)菌DNA分子中G+C含量是不同的，測(cè)定四種堿基總含量的百分比，可了解DNA分子中的堿基組成情況。這種百分比

4、組成因菌種不同而有很大差異，根據(jù)這種差異的不同就可鑒定各種細(xì)菌種屬間的親緣關(guān)系。（四） 細(xì)菌的命名 細(xì)菌的命名依據(jù)“國際細(xì)菌命名法規(guī)”的規(guī)定，學(xué)名用拉丁文，遵循“雙名法”。所謂“雙命名法”就是每一種細(xì)菌的拉丁文名稱由屬名和種名兩部分構(gòu)成，屬名第一個(gè)字母必須大寫，其余均應(yīng)小寫，種名頭一個(gè)字母也用小寫。整個(gè)屬名及種名在出版物中應(yīng)排成斜體。雙命名法： 屬名 + 種名（命名人姓氏及年代）+改定人姓氏及年代拉丁化名詞第一字母大寫拉丁化形容詞或名詞所有格-不大寫例如： Sallmonella cholerae suis(smith)weldin 1927 屬名種名命名人姓氏及年代沙門氏菌屬霍亂二、病毒的分

5、類與命名 （二）動(dòng)物病毒分類的依據(jù)1、病毒顆粒的特性 病毒的核酸類型和股數(shù)，即指DNA和RNA病毒是雙鏈核酸還是單鏈核酸；分子G+C克分子%；有無囊膜，有囊膜結(jié)構(gòu)的病毒對(duì)乙醚等有機(jī)溶劑的敏感性；形態(tài)學(xué)區(qū)別，即形狀、大小及殼粒的結(jié)構(gòu)、排列和組成；病毒有無血凝素等表面結(jié)構(gòu)。2、復(fù)制 指病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的部位；能否形成包涵體和包涵體出現(xiàn)的部位；病毒的釋放方式等。3、生物學(xué)方面 包括：宿主的范圍和病毒的傳播途徑等。（一）動(dòng)物病毒分類的發(fā)展 病毒的分類與命名經(jīng)歷過幾個(gè)階段，到目前為止仍未有成熟的分類系統(tǒng)。由于病毒是專性細(xì)胞內(nèi)寄生生物，所以最早是以病毒與宿主的相互關(guān)系來進(jìn)行分類與命名的。 病毒的分類的

6、系統(tǒng)是由科、屬、種組成，有的還分亞科、亞屬等級(jí)別。根據(jù)核酸的種類和股數(shù)以及囊膜的有無三個(gè)特性，首先把病毒分為七大類，再進(jìn)一步分為54個(gè)科或組，109個(gè)屬。動(dòng)物病毒分布于17科中。三、細(xì)菌的分離鑒定 細(xì)菌的鑒定，一般是先通過形態(tài)、結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)特性、理化性質(zhì)、生化特性、抵抗力等定種，通過血清學(xué)方法定型。（一）細(xì)菌的分離鑒定的一般程序 形態(tài)學(xué)檢查生化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)特性觀察血清學(xué)檢查根據(jù)臨診病史、癥狀、剖檢特點(diǎn)及樣品種類直接鏡檢情況選擇和接種適宜培養(yǎng)基分離細(xì)菌污染病料接種動(dòng)物待其死亡觀察細(xì)菌培養(yǎng)特性，挑取單個(gè)菌落一部鏡檢，其余轉(zhuǎn)接種于固體培養(yǎng)基作純培養(yǎng)菌種鑒定藥敏試驗(yàn)病原學(xué)檢查報(bào)告鑒定結(jié)果細(xì)菌分離鑒定的一般程

7、序（二）細(xì)菌的分離與鑒定 1、病料的采集 正確采集病料是細(xì)菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)。采集病料時(shí)力求在瀕死時(shí)或死后數(shù)小時(shí)內(nèi)無菌或盡量減少雜菌污染進(jìn)行采集。通常可根據(jù)所懷疑病的類型和特性來決定采取哪些器官或組織的病料。一般要求采取病原微生物含量多、病變明顯的部位，同時(shí)易于采取，易于保存和運(yùn)送。如果缺乏臨診資料，剖檢時(shí)又難于分析診斷可能屬何種病時(shí)，應(yīng)比較全面地取材，例如血液、肝、脾、肺、腎、腦和淋巴結(jié)等，同時(shí)要注意帶有病變的部分，如懷疑炭疽,則非必要時(shí)不準(zhǔn)作尸體剖檢。 在作細(xì)菌個(gè)體形態(tài)學(xué)檢查時(shí)，要根據(jù)被檢菌的種類和檢查項(xiàng)目，選用相應(yīng)的染色方法，例如，做革蘭氏染色檢查時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的陳舊細(xì)菌，可能由陽性變

8、為陰性。作細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性檢查時(shí)，液體培養(yǎng)基的幼嫩培養(yǎng)物（幾小時(shí)到十幾小時(shí)）最為適宜。作炭疽莢膜染色時(shí)，因炭疽桿菌在一般培養(yǎng)基上不形成莢膜，而在動(dòng)物體內(nèi)形成明顯的莢膜，因此，應(yīng)先接種小鼠，取死亡動(dòng)物的病料作涂片標(biāo)本鏡檢。作鞭毛染色時(shí)，以液體培養(yǎng)基為宜。芽孢的形成，因細(xì)菌種類不同，往往對(duì)培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基、空氣和培養(yǎng)時(shí)間等而異，但一般均要求較長(zhǎng)時(shí)間。鏡檢時(shí)除注意其基本形態(tài)結(jié)構(gòu)和大?。ㄒ脺y(cè)微計(jì)測(cè)量）外，還應(yīng)注意其排列狀態(tài)、菌端形狀、有無兩極染色、有無形成芽孢和莢膜等。必要時(shí)可用電鏡觀察其微細(xì)結(jié)構(gòu)。 發(fā)病動(dòng)物心血、膿汁、浸出液、肝、脾、淋巴結(jié)、腎等均可直接鏡檢，常用革蘭氏、瑞氏及姬姆薩氏染色法。對(duì)于懷疑分

9、枝桿菌和布氏桿菌的病料涂片可用抗酸性和布氏桿菌鑒別染色法。一些具有特殊形態(tài)或染色特性的細(xì)菌，如葡萄球菌、鏈球菌、巴氏桿菌等，?？赏ㄟ^染色鏡檢作初步判斷，并選擇培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。2、染色鏡檢3、分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性檢查 細(xì)菌在自然界中分布廣、種類多，而被檢材料又常有種以上的細(xì)菌，為了對(duì)特定的菌進(jìn)行研究或鑒定，必須從混雜的材料中分離所需的細(xì)菌。 培養(yǎng)的細(xì)菌應(yīng)每天觀察細(xì)菌有無生長(zhǎng)，一周內(nèi)無細(xì)菌生長(zhǎng)（少數(shù)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌除外）即可報(bào)告細(xì)菌培養(yǎng)陰性或分離失敗。如有細(xì)菌生長(zhǎng)，應(yīng)仔細(xì)觀察細(xì)菌在固體、液體、半固體、鑒別培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。在固體培養(yǎng)基上要觀察菌落形態(tài)、大小、顏色是否均勻一致，表面是光滑濕潤(rùn)，還是干燥

10、無光或呈皺紋狀，邊緣是整齊還是不規(guī)則，菌落是隆起、扁平，還是乳頭樣，是透明、半透明或不透明。在液體培養(yǎng)基中，要觀察培養(yǎng)基是否呈均勻混濁，管底有無沉淀，液面有無菌膜，是否產(chǎn)氣等。在半固體培養(yǎng)基上應(yīng)觀察細(xì)菌是否沿著接種線生長(zhǎng)，是呈毛刷樣生長(zhǎng)還是均勻生長(zhǎng)，上下生長(zhǎng)是否一致。在鑒別培養(yǎng)基上，應(yīng)觀察其生長(zhǎng)情況是否與預(yù)期的相一致，在血瓊脂培養(yǎng)基上還要觀察是否溶血及溶血圈的特點(diǎn)，在某些培養(yǎng)基上還要注意是否有臭味等。同時(shí)挑選單個(gè)疑似菌落的一部染色鏡檢，其余做純培養(yǎng)接種。4、生化特性檢查 各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)各不相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力各異，因而在代謝過程中所產(chǎn)生的合成或分解產(chǎn)物也不同。應(yīng)用生物化學(xué)方法檢測(cè)

11、細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，有助于細(xì)菌種、屬鑒定。這種利用生化方法來鑒別細(xì)菌的試驗(yàn)，統(tǒng)稱為細(xì)菌的生化試驗(yàn)或生化反應(yīng)，是識(shí)別細(xì)菌的重要方法之一。應(yīng)用生物化學(xué)的方法來檢測(cè)這些物質(zhì)的存在與否，有助于細(xì)菌的鑒別診斷。5、細(xì)菌血清型鑒定及血清學(xué)試驗(yàn) 細(xì)菌抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，有存在于細(xì)胞壁的菌體抗原（O抗原）。有運(yùn)動(dòng)性的細(xì)菌在菌體抗原之外還有鞭毛抗原（H抗原），它具有不同的種、型特異性。包圍于細(xì)胞壁外面的抗原稱表面抗原，它包括種、型特異性很強(qiáng)的莢膜抗原（如炭疽桿菌）以及Vi抗原（沙門桿菌）和K抗原（大腸桿菌）。此外還有存在于某些革蘭氏陰性桿菌表面的菌毛抗原。從抗原的特異性程度可區(qū)分為：存在于屬間細(xì)菌所共有的共同抗原，這

12、種抗原的存在，只能表明其屬性；另一類抗原為特異性抗原，只存在于特定的種、型，是最后確定細(xì)菌種、型的重要依據(jù)。 血清型鑒定是微生物鑒定的特異方法。首先要求鑒定的細(xì)菌必須純凈，不能混有其他種細(xì)菌，而且要新鮮，細(xì)菌要在適宜的條件下培養(yǎng)，盡量減少傳代，以防發(fā)生變異。其次是要有特異性強(qiáng)和效價(jià)高的已知標(biāo)準(zhǔn)免疫血清（包括單克隆抗體）和標(biāo)準(zhǔn)菌株。有些種類細(xì)菌，如大腸桿菌和沙門桿菌不僅種、型繁多，而且抗原構(gòu)造復(fù)雜，應(yīng)購置專門的分型血清以備應(yīng)用。最后是根據(jù)其菌體構(gòu)造和抗原成分以及實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備技術(shù)條件，選擇相應(yīng)的一種或幾種血清學(xué)試驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定。6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢查法和毒力測(cè)定 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的用途很廣，在臨床細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中，

13、主要用以分離和鑒定病原菌、檢測(cè)細(xì)菌毒力、制備免疫血清以及菌苗等生物制品的安全、毒性試驗(yàn)等。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小白鼠、豚鼠、家兔、綿羊和雞等。細(xì)菌的毒力測(cè)定，在微生物實(shí)驗(yàn)研究中特別重要，尤其在疫苗效價(jià)、血清效價(jià)測(cè)定、細(xì)菌毒素的測(cè)定等，都必須預(yù)先將實(shí)驗(yàn)用的細(xì)菌（或毒素）的毒力加以測(cè)定。測(cè)定微生物毒力大小選擇易感動(dòng)物來進(jìn)行。通常表示微生物毒力大小的單位有最小致死量（MLD）和半數(shù)致死量（LD50）兩種。7、分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及在臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用，為微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)細(xì)菌的快速鑒定，尤其是對(duì)難分離細(xì)菌的快速鑒定，提供了有利條件。目前在細(xì)菌鑒定中應(yīng)用的分子生物

14、學(xué)技術(shù)主要有核酸探針和核酸擴(kuò)增技術(shù)等。 （1）核酸探針技術(shù) 應(yīng)用核酸探針技術(shù)檢測(cè)病原微生物核酸是臨床診斷學(xué)的重大發(fā)展，其原理是用帶有酶、化學(xué)熒光物、放射性元素或生物素標(biāo)記的已知序列特定DNA片段（稱為探針），在一定條件下，按堿基互補(bǔ)原則通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)，從而鑒定標(biāo)本中有無相應(yīng)的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探針技術(shù)有固相雜交（斑點(diǎn)雜交、原位雜交、Southern印跡、Northern印跡等）和液相雜交技術(shù)。核酸探針適用于直接檢出臨床標(biāo)本中的病原微生物，不受非病原微生物的影響，因此對(duì)某些尚不能分離培養(yǎng)或很難分離培養(yǎng)的微生物的檢測(cè)具有重要的意義。隨著探針標(biāo)記的不斷改進(jìn)，檢測(cè)試劑盒商品化，

15、操作更簡(jiǎn)便易行。 （2）核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增（又稱PCR）技術(shù)是體外酶促合成DNA片段的新方法，其原理類似于DNA的體內(nèi)半保留復(fù)制。主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成。臨床實(shí)驗(yàn)室常用PCR技術(shù)來檢測(cè)標(biāo)本中某些微生物，尤其是對(duì)難以培養(yǎng)微生物的檢測(cè)。其他用于檢測(cè)微生物的PCR技術(shù)還有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和隨機(jī)引物PCR等。8、自動(dòng)化技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用 微生物鑒定的自動(dòng)化技術(shù)近十幾年得到了快速發(fā)展。數(shù)碼分類技術(shù)集數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)、信息及自動(dòng)化分析為一體，采用商品化和標(biāo)準(zhǔn)化的配套鑒定和抗菌藥物敏感試驗(yàn)卡或條板，可快速準(zhǔn)確地對(duì)臨床數(shù)百種常見分離菌進(jìn)行自動(dòng)分析鑒

16、定和藥敏試驗(yàn)。目前自動(dòng)化微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)已在世界范圍內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用。（）微生物數(shù)碼鑒定法 （）自動(dòng)化的微生物鑒定和藥敏試驗(yàn)分析系統(tǒng) 四、病毒的分離鑒定（一）病毒分離鑒定的一般程序 病毒的分離與鑒定是病毒性疾病檢疫、診斷和流行病學(xué)調(diào)查的重要方法之一，其主要目的是對(duì)患病的個(gè)體或群體進(jìn)行科學(xué)的診斷，以便及時(shí)處理；對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢疫，確定是否帶有某種病毒；對(duì)病毒引起的疾病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、追蹤調(diào)查或回顧性調(diào)查；對(duì)未知新病毒進(jìn)行鑒定等。 病料的采集與處理接 種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)雞胚接種細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)癥狀病變或死亡細(xì)胞病變鑒定病毒種型（血清學(xué)方法）病毒分離鑒定的一般程序（二）病毒分離與鑒定1、病料的采集與

17、送檢 病毒性傳染病一般在發(fā)病初期和急性階段比較容易分離出病毒，因此，采取病料的時(shí)機(jī)必須適當(dāng)。常用于病毒分離的病料有血液、糞便、滲出液、腦脊液、水泡液、活檢組織或尸檢組織等。根據(jù)病毒的性質(zhì)采取不同病料。 進(jìn)行畜禽病毒性傳染病的實(shí)驗(yàn)室診斷時(shí)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： （1）采集適宜的病料 這一點(diǎn)與病毒的分離成敗關(guān)系很大。一般應(yīng)采集病畜禽體內(nèi)含病毒最多的器官或組織。例如上呼吸道疾病應(yīng)采取鼻分泌物，而腦炎則采取腦組織。 （2） 注意采集病料的時(shí)間 以癥狀剛出現(xiàn)時(shí)最佳。檢查抗體時(shí)，則應(yīng)采取畜禽發(fā)病初期和恢復(fù)期的血清，以便了解抗體滴度的消長(zhǎng)程度。 （3）保存與運(yùn)送 病毒對(duì)外界因素特別是熱很敏感。因此，必須將病料放

18、在滅菌的保存液中（一般用50甘油磷酸鹽緩沖液），液體病料可加適量的抗生素以防污染。盛有病料的器皿應(yīng)封口，再放入冰瓶?jī)?nèi)（內(nèi)放冰塊和食鹽或干冰和酒精），在此低溫條件下保存和送檢病料。 （4）防止病料污染采集病料時(shí)，必須無菌操作。為防止液體病料被污染，有的可在其中加入適量的青霉素和鏈霉素或其他抗生素，如慶大霉素；若防止霉菌污染，還可加制霉菌素、二性霉素B等。供抗體檢測(cè)的血清可加入防腐劑。2、病毒的分離培養(yǎng) 病毒缺乏完整的酶系統(tǒng)，又無核糖體等細(xì)胞器，所以不能在無生命的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖。因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、雞胚以及體外培養(yǎng)的器官和細(xì)胞就成為人工增殖病毒的基本工具。而病毒的大量培養(yǎng)又是病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究及制備疫苗

19、和特異性診斷制劑的先決條件。病毒培養(yǎng)最早應(yīng)用的方法是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和雞胚，但由于50年代細(xì)胞培養(yǎng)的廣泛應(yīng)用，前兩種方法已居于次要位置，但在免疫血清的制備、病毒的致病性、免疫性、發(fā)病機(jī)制及藥物效檢等方面仍使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和雞胚，在禽類病毒病、流感和副流感等研究方面，雞胚（禽胚）仍具有重要的應(yīng)用價(jià)值。（1）動(dòng)物接種 動(dòng)物接種是長(zhǎng)期以來分離和增殖病毒、制造病毒抗原和疫苗以及病毒病實(shí)驗(yàn)室研究的常用材料和工具。常用的動(dòng)物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、家兔，有時(shí)也用猴、猿、猩猩等。接種時(shí)要根據(jù)病毒對(duì)動(dòng)物、組織細(xì)胞等嗜性不同而選擇特定的部位，如鼻腔、皮內(nèi)、皮下、腹腔、腦內(nèi)、靜脈等。接種后逐日觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病情況，如有

20、死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作病毒鑒定。但是一般的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常帶有病毒，給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來混淆，并給疫苗生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的潛在危險(xiǎn)?，F(xiàn)有條件的實(shí)驗(yàn)室一般使用無菌動(dòng)物（GF）、已知?jiǎng)游铮℅N）和無特定病原動(dòng)物（SPF）。（2）雞（禽）胚培養(yǎng) 許多人和動(dòng)物的病毒，特別是禽類的病毒都能在雞（禽）胚上生長(zhǎng)繁殖，因此雞（禽）胚培養(yǎng)是常用的病毒分離培養(yǎng)方法之一。用于這些病毒的分離鑒定、制備抗原、疫苗生產(chǎn)以及研究病毒性質(zhì)等方面。此外衣原體、立克次體也可用雞（禽）胚進(jìn)行分離培養(yǎng)。 根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞（禽）胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi)，接種后逐日觀察雞（禽）胚，

21、如有病毒增殖，則雞（禽）胚發(fā)生異常變化，并收獲病毒液。 優(yōu)點(diǎn)：胚胎的組織分化程度低，可選擇不同日齡和接種途徑。病毒易于增殖，感染病毒的組織和液體中含有大量病毒，易采集和處理，而且來源充足，設(shè)備和操作簡(jiǎn)便易行。 缺點(diǎn)：有可能污染細(xì)菌（沙門氏菌等）和病毒，尤其是垂直傳遞的病毒，如禽白細(xì)胞增生病病毒、NDV、禽腦脊髓炎病毒等。而且，胚胎中的卵黃抗體會(huì)影響同種病毒的增殖。 接種方法卵黃囊胚體羊膜囊絨毛尿囊腔氣室雞胚結(jié)構(gòu)模式圖A 絨毛尿囊膜接種 主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離、增殖。因它們?cè)陔u胚絨毛尿囊膜上形成痘斑或病斑。一般用10-12日齡的雞胚。B 尿囊腔接種 主要用于正粘病毒和副粘病毒（如禽流感病

22、毒和NDV）的分離和增殖，也是制備馬腦炎病毒疫苗常用的接種途徑。一般選用9-11日齡雞胚。C 卵黃囊接種 主要用于蟲媒病毒等。為6-8日齡雞胚。 卵黃囊接種 尿囊腔接種 D 羊膜腔接種 主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖，為11-12日齡雞胚。羊膜腔接種 （3）組織培養(yǎng) 組織培養(yǎng)是分離培養(yǎng)病毒及進(jìn)行病毒實(shí)驗(yàn)研究簡(jiǎn)便而有效的工具和手段。近年來,許多新的動(dòng)物病毒就是通過組織培養(yǎng)方法而發(fā)現(xiàn)的,組織培養(yǎng)也用于生產(chǎn)病毒抗原及制備病毒疫苗。 組織塊培養(yǎng) 就是將動(dòng)物組織切成小塊在固定或懸浮狀態(tài)下培養(yǎng)。是最早的組織培養(yǎng)方法。 器官培養(yǎng) 取器官薄片（如一小段器官或一小塊鼻粘摸）進(jìn)行培養(yǎng)，如某些呼吸道病毒就是

23、應(yīng)用器官培養(yǎng)才分離出來的。（4）細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)在病毒學(xué)方面的研究最為廣泛，除用作病毒的病原分離外，還可研究病毒的繁殖過程及其細(xì)胞的敏感性和傳染性（細(xì)胞的病理變化及包涵體的形成）。觀察病毒傳染時(shí)細(xì)胞新陳代謝的改變，探討抗體與抗病毒物質(zhì)對(duì)病毒的作用方式與機(jī)制，以及研究病毒干擾現(xiàn)象的本質(zhì)和變異的規(guī)律性，可用于病毒的分離鑒定、抗原的制備及疫苗、干擾素的生產(chǎn)、病毒性疾病診斷和流行病學(xué)調(diào)查等。近年來，也用于繁殖病毒載體以用于基因治療。3、病毒的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定-電鏡技術(shù) 包涵體檢查 生物學(xué)特性鑒定病毒理化特性的測(cè)定 血清學(xué)鑒定 分子生物學(xué)方法鑒定 細(xì)胞病變效應(yīng) 血吸附和血凝作用 干擾作用 核酸類型的鑒定

24、 顆粒大小的測(cè)定 對(duì)酸的敏感性對(duì)脂溶劑的敏感性免疫熒光抗體技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 金標(biāo)抗體技術(shù) 核酸分子雜交技術(shù) PCR技術(shù) 核酸序列分析技術(shù)血凝抑制試驗(yàn)等 可直接取病料或感染培養(yǎng)物作成電鏡標(biāo)本后染色用電子顯微鏡進(jìn)行檢查，電子顯微鏡檢查不僅可以看到病毒粒子的存在，而且可以根據(jù)病毒粒子的形態(tài)及其在細(xì)胞內(nèi)的位置，而大致判定其屬于哪一個(gè)病毒科(屬)。常用電鏡技術(shù)有負(fù)染法和超薄切片法。電子顯微鏡檢查是快速可靠的方法。 電鏡技術(shù)是檢測(cè)不能在體外培養(yǎng)的病毒的主要手段，也是病毒分類的重要手段。如輪狀病毒、星狀病毒、嵌杯狀病毒、甲型肝炎病毒等都是用電鏡最先發(fā)現(xiàn)的。因此，在診斷病毒學(xué)方面，應(yīng)用電鏡

25、技術(shù)將能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的病毒和病毒病。（1）形態(tài)學(xué)檢查-電鏡技術(shù) 在某種意義上說，包涵體是某些病毒對(duì)一定的機(jī)體或細(xì)胞的病理學(xué)特征，這種特征具有一定的種屬性。在不同的病毒感染中往往具有獨(dú)自的形態(tài)、染色特性和存在部位。有些病毒病出現(xiàn)包涵體，從包涵體的檢出可以幫助診斷疾病。病理組織或滲出液作成涂片檢查包涵體時(shí)，常用蘇木精伊紅染色法，也可用姬姆薩、MM氏等其他染色法。包涵體多數(shù)呈嗜酸性，也有嗜堿性者，但是不能過分強(qiáng)調(diào)這種染色特征，因?yàn)榘w的不同發(fā)育階段對(duì)pH值的反應(yīng)有差異。（2）檢查包涵體 還可通過鑒定病毒的生物學(xué)特性來鑒定病毒。 細(xì)胞病變作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病

26、毒在細(xì)胞內(nèi)增殖引起細(xì)胞退形性變化，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測(cè)性診斷。免疫熒光（IF）法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點(diǎn)狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。 紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（Hemadsorption phenomenon） 流感病毒和某些副黏病毒感染細(xì)胞后2448小時(shí)，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動(dòng)物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng)的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還