真菌學(xué)概述課件

1、第三篇 臨床真菌學(xué)第二十章真菌學(xué)概述和平醫(yī)院檢驗(yàn)科 弓艷娥CandidaAspergillusHi Bud! Hi pal!Opportunity knocks!Huh. You guys get all the attention FusariumFrom Donnelly JPThe main players真菌(fungus)是一種真核細(xì)胞型微生物，一類具有典型細(xì)胞核，有核膜和核仁，胞質(zhì)內(nèi)有完整的細(xì)胞器，無(wú)根、莖、葉，不含葉綠素，無(wú)光合色素，細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)和纖維素的單細(xì)胞或多細(xì)胞異養(yǎng)真核細(xì)胞型微生物。真菌廣泛分布于自然界，種類繁多，有10余萬(wàn)種。大多對(duì)人無(wú)害，有的甚至有益，如食用蕈類，有

2、的真菌用于生產(chǎn)抗生素和釀酒等。然而有些真菌也是造成動(dòng)植物病害的病原菌之一，其中與醫(yī)學(xué)有關(guān)的真大約有數(shù)百種，少數(shù)真菌可以引起人類感染性、中毒性及變態(tài)反應(yīng)性疾病（如曲霉菌屬、毛癬菌屬）。近年來(lái)，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和或應(yīng)用激素、抗癌藥物導(dǎo)致機(jī)體免疫低下等原因，而使機(jī)會(huì)致病真菌感染明顯增多（如曲霉菌、組織胞漿菌、卡氏肺胞菌、馬爾尼菲青霉菌）。真菌細(xì)菌細(xì)胞真核細(xì)胞原核細(xì)胞細(xì)胞核有，還有核仁、核膜擬核，無(wú)核仁、核膜細(xì)胞器有只有核糖體細(xì)胞壁無(wú)肽聚糖，由多糖（75%）與蛋白質(zhì)（25%）有肽聚糖對(duì)青霉素或頭孢菌素敏感不敏感敏感細(xì)胞膜含固醇不含固醇大小，復(fù)雜程度比細(xì)菌大幾倍至幾十倍，結(jié)構(gòu)復(fù)雜小，簡(jiǎn)單第一節(jié) 分

3、類真菌屬真菌界，真菌屬真核細(xì)胞型微生物。真菌的營(yíng)養(yǎng)方式是吸收，植物的營(yíng)養(yǎng)方式是光合作用。真菌分類的主要依據(jù)為：有性生殖的各種器官、無(wú)性菌絲、孢子及菌落的形態(tài)特征。真菌分類 粘菌門 鞭毛菌亞門真菌界 接合菌亞門* 真菌門 子囊菌亞門* 擔(dān)子菌亞門* 半知菌亞門*根據(jù)卡氏肺囊蟲囊蟲壁的超微結(jié)構(gòu)類似真菌細(xì)胞，將其稱為卡氏肺胞菌接合菌門子囊菌門擔(dān)子菌門壺菌門真菌分類接合菌亞門 分為2綱7目24科115屬，600余種。 屬條件致病菌，絕大多數(shù)為無(wú)隔、多核菌絲體，如毛霉菌、根霉菌等。子囊菌亞門： 6綱1959屬，15000余種。 主要特征:有性生殖產(chǎn)生子囊和子囊孢子 包括：青霉、曲霉、小孢子菌屬、毛癬菌屬

4、、組織胞漿菌等有性期、毛癬菌屬、酵母菌屬等。真菌分類擔(dān)子菌亞門 具有擔(dān)子和擔(dān)孢子，如食用菌蘑菇、靈芝以及致病性真菌新生隱球菌。半知菌亞門 3綱1825個(gè)屬，約15000種。 包括：酵母、隱球菌屬、念珠菌屬、紅酵母屬、絲孢酵母屬、皮膚癬菌、青霉、曲霉及部分雙相真菌等。第二節(jié) 真菌的基本特性單細(xì)胞真菌 圓形或卵圓形 酵母菌(yeast)多細(xì)胞真菌 菌絲和孢子 絲狀菌(filamentous fungus) 交織成團(tuán) 或霉菌(mold) 二相性(dimorphic)一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)單細(xì)胞真菌形態(tài)呈圓形或卵圓形，常見于酵母菌或類酵母菌，對(duì)人致病的主要有新生隱球菌和白假絲酵母菌。這類真菌以出芽方式繁殖，芽

5、生孢子成熟后脫落成獨(dú)立個(gè)體。多細(xì)胞真菌形態(tài)多細(xì)胞絲狀真菌能長(zhǎng)出菌絲，菌絲延伸分枝，有的菌絲上長(zhǎng)出孢子。各種絲狀菌長(zhǎng)出的菌絲和孢子形態(tài)不同，是鑒別真菌的重要標(biāo)志。1.菌絲 hypha有隔菌絲 多數(shù)致病性真菌無(wú)隔菌絲在環(huán)境適宜情況下由孢子長(zhǎng)出芽管，逐漸延長(zhǎng)呈絲狀，稱菌絲 菌絲形態(tài)(螺旋狀、球拍狀、結(jié)節(jié)狀、鹿角狀、梳狀等)有助于鑒別 營(yíng)養(yǎng)菌絲氣生菌絲 生殖菌絲按生物 學(xué)功能有性孢子:同一菌體或不同菌體上的2個(gè)細(xì)胞融合經(jīng)減數(shù)分裂形成 無(wú)性孢子:菌絲上的細(xì)胞分化或出芽生成 病原性真菌大多形成無(wú)性孢子 分生孢子葉狀孢子孢子囊孢子大分生孢子 大小、細(xì)胞數(shù)和顏色是鑒定的重要依據(jù) 小分生孢子 真菌都能產(chǎn)生芽生孢

6、子 假菌絲 厚膜孢子 關(guān)節(jié)孢子 多細(xì)胞真菌形態(tài)sporehypha大分生孢子芽生孢子 假菌絲厚膜孢子關(guān)節(jié)孢子孢子囊孢子真菌孢子和細(xì)菌芽胞的區(qū)別真菌繁殖結(jié)構(gòu)真菌孢子細(xì)菌芽胞抵抗力不強(qiáng)，加熱60-70短時(shí)間即可死亡強(qiáng)，有的可耐100數(shù)小時(shí)數(shù)目一條菌絲可產(chǎn)生多個(gè)孢子一個(gè)菌體只形成一個(gè)芽胞作用為繁殖方式之一不是繁殖方式形狀形狀多種多樣圓形或橢圓形二、真菌的培養(yǎng)特性特點(diǎn)：低營(yíng)養(yǎng)、低PH(4.0-6.0)、高濕度和氧、溫度（淺部感染真菌22-28，深部感染真菌37）。培養(yǎng)基：沙保(Sabouraud)培養(yǎng)基（常加氯霉素和放線菌酮）菌落：?jiǎn)渭?xì)胞-酵母型菌落、類酵母型菌落（假菌絲） 多細(xì)胞-絲狀菌落 菌落形態(tài)

7、也是鑒別真菌的重要依據(jù) 酵母型菌落 是單細(xì)胞真菌的菌落形式，菌落光滑濕潤(rùn)，柔軟而致密。形態(tài)與一般細(xì)菌菌落相似，如隱球菌即屬之。有部分單細(xì)胞真菌在出芽繁殖后，芽管延長(zhǎng)不與母細(xì)胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向下生長(zhǎng)，伸入培養(yǎng)基中，這種菌落稱為類酵母菌落，如假絲酵母菌。C. albicans菌落(類酵母型)真菌在出芽繁殖后，芽管延長(zhǎng)不與母細(xì)胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向下生長(zhǎng)，伸入培養(yǎng)基中，這種菌落稱為類酵母菌落。2.霉菌型菌落（絲狀菌落）是多細(xì)胞真菌的菌落形式，由許多管狀分支的菌絲體構(gòu)成。菌落成棉絮狀、絨毛狀或粉末狀，菌落正背兩面呈現(xiàn)不同的顏色。菌落的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和顏色常作為鑒定真菌的參考。真

8、菌有從中心向四周等距離生長(zhǎng)形成圓形菌落的傾向，所以臨床體癬、股癬、疊瓦癬等皮損表現(xiàn)為環(huán)形或多環(huán)形。 曲霉屬霉菌型菌落青霉菌落霉菌型菌落雙相真菌凡在組織內(nèi)和在特殊培養(yǎng)基上37培養(yǎng)時(shí)呈酵母相，而在普通培養(yǎng)基上和室溫培養(yǎng)時(shí)呈菌絲相的一類真菌，統(tǒng)稱為雙相真菌（dimorphic fungi）。酵母相也稱為組織相，是主要的致病相。臨床上重要的傳統(tǒng)雙相真菌包括：孢子絲菌、粗球孢子菌、組織胞漿菌、皮炎芽生菌、副球孢子菌等。近年發(fā)現(xiàn)的馬爾尼菲青霉等。近年來(lái)，有學(xué)者將雙相真菌的概念擴(kuò)大，認(rèn)為凡是具有兩種表型的真菌均稱為雙相真菌。如白念珠菌，在YPD培養(yǎng)基上，表現(xiàn)為酵母相；而在Lee培養(yǎng)基上則呈菌絲相。雙相真菌特

9、 征菌絲相和酵母相能相互轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分、二氧化碳和氧的濃度變化有關(guān)。雙相真菌既能引起皮膚感染又能引起內(nèi)臟器官的感染。鑒 定雙相真菌的鑒定主要依賴于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。真菌的繁殖方式有性繁殖無(wú)性繁殖 出芽繁殖：為酵母菌的主要繁殖方式。 分裂繁殖：以二分裂法進(jìn)行繁殖，可見于某些雙相真菌在體內(nèi)的繁殖。 芽管繁殖：真菌孢子萌發(fā)芽管，芽管延長(zhǎng)后形成菌絲。 生隔繁殖：分生孢子在分生孢子梗某一段落形成一橫隔，原生質(zhì)濃縮后形成一個(gè)新的孢子，該孢子又可再獨(dú)立進(jìn)行繁殖。致病性病原性真菌感染：主要為外源性真菌感染。條件致病性真菌感染：主要為內(nèi)源性真菌感染。真菌變態(tài)反應(yīng)性疾病真菌性中毒真菌與腫瘤抵抗力對(duì)干

10、燥、日光、紫外線及一般消毒劑抵抗力強(qiáng)對(duì)熱敏感，601小時(shí)菌絲、孢子均被殺死對(duì)細(xì)菌抗生素不敏感對(duì)二性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑敏感 臨床標(biāo)本的采集及檢驗(yàn)程序 淺部感染真菌的檢查可用70%乙醇棉球擦拭局部后取皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等標(biāo)本。深部感染真菌的檢查可根據(jù)病情取痰、血液、腦脊液等標(biāo)本。標(biāo)本類型： 皮膚的角質(zhì)性物質(zhì)：皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等。 分泌物和排泄物：痰、生殖道分泌物、尿液等。 血液和體液：血液、腦脊液、胸水、腹水、淋巴穿刺液、膿液及滲出液等。注意事項(xiàng)：若為淺部真菌感染，應(yīng)刮片取病變部位邊緣的痂鱗屑。余同細(xì)菌感染標(biāo)本采集事項(xiàng)。 真菌檢驗(yàn)各種真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)有其

11、一定的特殊性，一般可以通過(guò)直接鏡檢和培養(yǎng)進(jìn)行鑒定，但具體方法應(yīng)根據(jù)標(biāo)本種類和檢查目的而異。一、標(biāo)本的直接檢查顯微鏡檢查抗原檢測(cè)顯微鏡檢查皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等標(biāo)本置玻片上，滴加10%KOH少許，以蓋玻片覆蓋后在火焰上微微加溫，使被檢組織中的角質(zhì)軟化。輕壓蓋玻片，使標(biāo)本變薄透明，然后在低倍或高倍鏡下檢查。若見菌絲或孢子，即可初步診斷患有真菌癬，但一般不能確定其菌種。皮膚癬標(biāo)本檢查常用濕標(biāo)本，不加染色。假絲酵母菌感染則取材涂片，行革蘭染色;隱球菌感染取腦脊液離心。沉淀物用墨汁作負(fù)染色后鏡檢。結(jié)果的判斷：直接檢查陽(yáng)性有意義，陰性不能排除感染。但陰道、痰等分離出假絲酵母菌、曲霉等條件致病菌需多次陽(yáng)

12、性才有意義。組織中發(fā)現(xiàn)分隔分枝的菌絲多為曲霉;粗大、不分隔或不分枝的菌絲多為毛霉。假絲酵母菌出現(xiàn)假菌絲代表活動(dòng)性，有意義。皮膚癬菌菌絲肥大粗長(zhǎng)，提示處于活躍狀態(tài)。酵母型和二相型真菌在組織內(nèi)常表現(xiàn)為孢子。 1010%KOH 壓片：淺部真菌感染，敏感性更高抗原檢測(cè)近年來(lái)有許多方法用于檢測(cè)深部感染真菌的抗體，作輔助診斷莢膜組織胞漿菌、念珠菌、曲霉菌。但系統(tǒng)性感染患者常因免疫功能降低不出現(xiàn)抗體；而且許多真菌間抗原性有交叉反應(yīng)；有的產(chǎn)生抗體后維持時(shí)間較長(zhǎng)，正常人群中有一定比例的陽(yáng)性率，則必須結(jié)合臨床情況分析結(jié)果才能作出恰當(dāng)?shù)脑\斷。由于上述檢測(cè)抗體受到許多因素的限制，及深部真菌感染時(shí)，早期培養(yǎng)陽(yáng)性率甚低，

13、晚期則多于失去治療時(shí)機(jī)，因此用免疫學(xué)方法從血清或其他部位檢測(cè)真菌抗原，對(duì)早期診斷具有重要意義。如乳膠凝集法檢測(cè)新型隱球菌病患者的莢膜多糖抗原，ELISA法檢測(cè)白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫熒光法檢測(cè)孢子絲菌病患者的可溶性抗原等，均為早期，快速、特異的診斷方法。血清學(xué)試驗(yàn)（1）測(cè)抗原 胞壁1,3-D-葡聚糖（G試驗(yàn)），表面抗原甘露聚糖（LA試驗(yàn)），熱不穩(wěn)定蛋白（LA試驗(yàn)），胞漿蛋白烯醇化酶（ELISA和WB），Mr 65000蛋白（抑制ELISA）等。（2）測(cè)抗體 烯醇化酶（P47）抗體（ELISA），白念珠菌芽管抗體（CAGTA）間接免疫熒光法。（3） GM試驗(yàn)臨床意義：早期診斷侵襲性曲

14、霉菌感染檢測(cè)物質(zhì)：半乳甘露聚糖（Galactomannan）試驗(yàn)原理：雙抗夾心法酶聯(lián)吸附試驗(yàn)標(biāo)本：血清、肺泡灌洗液、腦脊液二、分離培養(yǎng)直接鏡檢不能確診時(shí)應(yīng)作真菌培養(yǎng)。皮膚、毛發(fā)、甲屑標(biāo)本經(jīng)70%乙醇或2%石炭酸浸泡23min殺死雜菌，無(wú)菌鹽水洗凈后接種于含放線菌酮和氯霉素的沙保培養(yǎng)基上，2528數(shù)日至數(shù)周，觀察菌落特征。必要時(shí)做小培養(yǎng)，于鏡下觀察菌絲、孢子特征進(jìn)行鑒定。陰道、口腔粘膜材料可用棉拭子直接在血平板上分離。若為血液需先增菌，腦脊液則取沉淀物接種于血平板上37培養(yǎng)。若疑為假絲酵母菌取菌落研種于0.5ml血清試管內(nèi)，371h后涂片革蘭染色。見有假絲酵母菌細(xì)胞長(zhǎng)出芽管即可初步鑒定為假絲酵母

15、珠菌。培養(yǎng)基的選擇1、葡萄糖蛋白胨瓊脂:也叫Sabourand (沙保羅或沙氏)瓊脂。它適合于多種霉菌的生長(zhǎng)。2、血瓊脂培養(yǎng)基：適合于假絲酵母菌3、DTM：含蛋白胨、葡萄糖、酚紅、放線菌酮、慶大霉素、四環(huán)素等。它用于分離皮膚真菌。4、左旋多巴-枸櫞酸鐵=咖啡酸培養(yǎng)基：用于新生隱球菌的分離。5、酵母浸膏磷酸鹽瓊脂：分離莢膜組織胞漿菌和皮炎芽和菌。二、分離培養(yǎng)培養(yǎng)方法:玻片培養(yǎng)法(小培養(yǎng));平皿培養(yǎng)法;大試管培養(yǎng)法二、分離培養(yǎng)培養(yǎng)溫度： 2528和3537 菌落直接觀察 觀察菌落的生長(zhǎng)情況是鑒別真菌的主要方法之一。觀察菌落時(shí)注意菌落性質(zhì)菌落大小菌落顏色菌落是否下沉，是否使培養(yǎng)基開裂。菌落涂片觀察：

16、絲狀菌菌落用乳酸酚棉蘭染色鏡檢。1.在玻片滴上棉蘭2.制作膠帶粘菌小旗3. 膠帶黏面輕壓菌苔粘菌4.在膠帶與棉棒交接處滴數(shù)滴75%酒精絲狀真菌鑒定重要步驟乳酸酚棉蘭壓片5.翻轉(zhuǎn)棉棒有菌面貼在撥片336.膠膜上再滴棉蘭7.再加上蓋玻片絲狀真菌鑒定重要步驟乳酸酚棉蘭壓片8.用手壓實(shí)蓋玻片34三、生化試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)：利用真菌對(duì)各種糖的分解能力及代謝產(chǎn)物不同，借以鑒別。試驗(yàn)方法同細(xì)菌試驗(yàn)，主要用于檢驗(yàn)深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。常用的有單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖），雙糖（麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖），三糖（蜜三糖），多糖（淀粉）；醇類有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇等。同化碳源試驗(yàn)：將1ml含菌生

17、理鹽水與已融化的固體同化碳源培養(yǎng)基（45）混合，然后在培養(yǎng)基上分別加入各種糖少許，置25或37孵育后觀察結(jié)果。若24h后無(wú)變化可重復(fù)加糖少許。如能同化，在加入糖的周圍有生長(zhǎng)圈，否則無(wú)生長(zhǎng)。固體平板培養(yǎng)基適用于生長(zhǎng)快的真菌，而液體培養(yǎng)基則適合于生長(zhǎng)慢的真菌。三、生化試驗(yàn) 同化氮源試驗(yàn)或利用硝酸甲試：方法同同化碳源試驗(yàn)，但需無(wú)氮源的培養(yǎng)基，不加糖，加入硝酸甲。 其它：另外還有牛乳分解試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)等，操作方法同細(xì)菌鑒定。四、動(dòng)物試驗(yàn)主要用于分離、鑒定致病菌。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小鼠、豚鼠和家兔等。應(yīng)按實(shí)驗(yàn)要求，選用一定的體重和年齡，具有高度易感性的健康動(dòng)物。接種途徑有皮內(nèi)、皮下、腹腔、肌肉

18、、靜脈、腦內(nèi)和灌胃等。接種后應(yīng)仔細(xì)觀察動(dòng)物的食量、精神狀態(tài)和局部變化，有時(shí)尚要測(cè)定體重、體溫和血液等指標(biāo)。若死亡應(yīng)立即解剖，檢查病變，或進(jìn)一步作分離培養(yǎng)，證實(shí)由何病菌所致。五、核酸檢測(cè)（一）DNA中G+C mol%含量測(cè)定 （二）電泳核型（EK）分析 （三）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析 （一）DNA中G+C mol%含量測(cè)定是最早用于真菌分類學(xué)研究的分子生物學(xué)技術(shù)。目前在酵母菌的應(yīng)用較為成功。即利用真菌DNA中核酸序列的同源性及基因大小相似性的遺傳特征，測(cè)定DNA中的堿基含量（G+C mol%含量）作為真菌分類鑒定的重要遺傳指標(biāo)之一。因?yàn)槊糠N真菌都有固定的G+C mol%范圍且較為穩(wěn)定

19、，不同生物種的G+C 含量是不同的，生物種之間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，其G+C 含量差別就越大，反之亦然，因而可作為真菌的分類學(xué)指標(biāo)。 （二）電泳核型（EK）分析電泳核型是指細(xì)胞中的染色體在一定電場(chǎng)作用下在固體包埋物中的排列情況，反映了染色體的大小、數(shù)目和形狀的差異。它是通過(guò)脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）完成的，能分辨50 kb至 10 Mb范圍內(nèi)的DNA分子，基本滿足酵母菌和絲狀真菌的要求。對(duì)病原體而言，EK分析特別適用于低等真核微生物或原蟲，它無(wú)需用RE消化和探針雜交，就可方便地從EK的差異區(qū)別不同的菌種。EK分析帶型清晰易辨、分辨力較強(qiáng)，電泳條件穩(wěn)定時(shí)結(jié)果重復(fù)性好。但EK受電泳條件影響較大，影響不同實(shí)驗(yàn)室間的可比性，而且相同大小兩條不同染色體往往因遷移率相近呈現(xiàn)為同一條帶，影響分辨力。此外它需要昂貴的儀器，DNA的制備及PFGE過(guò)程也均較費(fèi)時(shí)。（三）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD） RAPD分析是一種利用隨機(jī)合成的單個(gè)寡核苷酸引物通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增靶細(xì)胞DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，分析DNA片段大小