化合物生物礦化的逆同位素標(biāo)記分析法

1、化合物生物礦化的逆同位素標(biāo)記分析法1 評(píng)估有機(jī)化合物的生物降解是地質(zhì)與環(huán)境科學(xué)中的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題。直接測(cè)定有機(jī)物降解消耗的方法顯然是不夠精確的，因此常采用同位素標(biāo)記的方法。有機(jī)物礦化的研究中，通常是用13C標(biāo)記底物，由直接測(cè)定礦化產(chǎn)生的13CO2，以確定有機(jī)物的降解過(guò)程和程度，然而一般講有機(jī)物標(biāo)記困難且成本昂貴，沉積物等介質(zhì)中的溶解有機(jī)物則根本無(wú)法標(biāo)記，為此這里提出一種化合物礦化的逆同位素標(biāo)記分析法。2 1.基本原理 化合物礦化的逆同位素標(biāo)記分析法的原理是，在分析介質(zhì)中加入13C-H2CO3標(biāo)記的溶解的無(wú)機(jī)碳庫(kù)（DIC=CO2（aq）+HCO3-+CO32-），則在封閉的培養(yǎng)系統(tǒng)中，有機(jī)物降解的

2、終端產(chǎn)物CO2將在氣相和液相分配，并稀釋標(biāo)記溶解無(wú)機(jī)碳庫(kù)的13C豐度，基于同位素稀釋質(zhì)量平衡原理可以求得礦化所產(chǎn)生的CO2，進(jìn)而得出有機(jī)物礦化過(guò)程，這是一種靈敏的、簡(jiǎn)單的和相對(duì)廉價(jià)的測(cè)定有機(jī)物礦化的方法。3圖. 化合物生物礦化的逆同位素標(biāo)記分析法4圖.連續(xù)流氣體測(cè)定Gasbench-IRMS系統(tǒng)52.一般流程 底物（無(wú)碳酸鹽）H213CO3+H2CO3(30mM，X13C10%-55%）厭氧培養(yǎng)磷酸法DIC樣品制備CG或gasbenchCG測(cè)定6 過(guò)程舉例 1）培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 于250ml血清瓶盛裝135ml無(wú)碳酸鹽緩沖的新鮮培養(yǎng)基，上蓋并用CO2/N2（20/80，v/v）沖洗，然后將NaH13C

3、O3和NaH12CO3 滅菌原液（各1M）由瓶口丁基橡膠塞注入，調(diào)節(jié)使介質(zhì)的碳酸鹽濃度為30mM，13C的比率為10%-50%，然后注入底物，并接種母體培養(yǎng)基，于300C黑暗中培養(yǎng)。7 2）樣品制備 對(duì)于GC-IRMS測(cè)量，從培養(yǎng)瓶中取出0.5ml的液體樣品，立即注入15ml預(yù)先盛有4.5ml無(wú)水H3PO4（1M）的血清瓶，用丁基橡膠塞密封，氦氣或氮?dú)鉀_刷玻管頂空，加熱板加熱使利用酸化反應(yīng)轉(zhuǎn)化DIC成為CO2，在CO2（g）-CO2（aq）平衡后，取部分頂空氣體進(jìn)行測(cè)定。DIC的濃度通過(guò)測(cè)定質(zhì)量44的峰有標(biāo)準(zhǔn)校正得到，13CDIC由以下計(jì)量關(guān)系式進(jìn)行計(jì)量。8圖.酸化樣品產(chǎn)生的CO2，用吸附除去

4、CO2的高純氦氣清掃，出口針連接到銅管的開(kāi)口端侵入水中，以防止大氣中CO2倒流進(jìn)入樣品。9 3）測(cè)試系統(tǒng) ThermoFinnigan(不萊梅港市，德國(guó),Thermo Fisher Scientific)GasBench ，配置著CTC自動(dòng)進(jìn)樣器（CTC Analytics AG,Zwingen,Switzerland），和ConFlo接口和一個(gè)Delta質(zhì)譜儀（也是Thermo Fisher Scientific）在ETH蘇黎世（蘇黎世，瑞士）。10 3.計(jì)量關(guān)系 1）13CDIC測(cè)量計(jì)量公式 經(jīng)H3PO4酸化的溶解無(wú)機(jī)碳DIC轉(zhuǎn)化成CO2（g）和CO2（aq），由于CO2在氣液兩相中分配，

5、因此需將直接測(cè)量對(duì)象CO2（g）的13C，轉(zhuǎn)變成DIC的13C ，即13CDIC。相關(guān)計(jì)量公式推導(dǎo)如下： （1） 式中，Xg和（1-Xg）分別為 CO2（g）和CO2（aq）的摩爾分?jǐn)?shù)。11 CO2（g）和CO2（aq）之間的同位素分餾系數(shù)定義為 （2） 由亨利定律CO2（aq）=PCO2（g），有 （3）12 合并以上各式，最后有 （4）13 式中，是對(duì)CO2的亨利方程常數(shù)，在絕對(duì)溫度T=298.15K的純水系統(tǒng)為3.34510-4mol.m-3.pa-1 ，13Cg-aq為1.07，在其它情況下依賴于溶液中鹽的強(qiáng)度。由上式可見(jiàn)，修正關(guān)系還與Vg/Vl的比值以及絕對(duì)溫度T有關(guān)，通常因?yàn)槿鄙俸?/p>

6、13Cg-aq 的數(shù)據(jù)，以上關(guān)系常用溶解無(wú)機(jī)碳標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，只要保證樣品與標(biāo)準(zhǔn)的Vg/Vl 比值、鹽的強(qiáng)度和溫度相同，則（1+Vg/（VlRT）為常數(shù)，同時(shí)校正過(guò)程也包括了對(duì)測(cè)定過(guò)程可能同位素分餾的校證，雖然其變化幅度與降解過(guò)程本身引起的標(biāo)記同位素變化幅度往往可以忽略不計(jì)。14例題： 在T=298.15K下，將1mlH2O+0.1mlH2PO4水溶液，注入12ml密封玻璃管，即Vg=10.9ml，Vl=1.1ml，則15 2）礦化CO2的計(jì)量 由質(zhì)量和同位素守恒定律，有 （5） （6） 式中，CT表示試驗(yàn)結(jié)束時(shí)系統(tǒng)總的無(wú)機(jī)碳，CB為初始時(shí)的系統(tǒng)的背景總無(wú)機(jī)碳，CO2為有機(jī)化合物礦化所產(chǎn)生的

7、總二氧化氮，x是13C的同位素豐度，角標(biāo)T、B和P相應(yīng)系統(tǒng)總的、背景和礦化的。 16 又，背景值為初始時(shí)所測(cè)定的溶解無(wú)機(jī)碳與頂空氣相中的CO2之和。 （7） 合并以上各式，最終得到有機(jī)化合物礦化所產(chǎn)生的總二氧化碳為 （8） 其中，xp等于13C的自然豐度，為1.1%。17 3）無(wú)機(jī)碳平衡的計(jì)量 設(shè)培養(yǎng)容器V=250ml，頂空含有20%CO2，即CO2分壓0.2atm，對(duì)于t=250C，進(jìn)行DIC平衡及品種的計(jì)算，其平衡關(guān)系為 查表得t=250C時(shí),亨利常數(shù)為18 則 又設(shè)PH=7.3，因?yàn)?9%H2CO3以CO2（aq）的形式存在，因此19 由 有20 由 最終 ；21參考文獻(xiàn) 1.Monitoring Microbial Mineralization Using Reverse Stable Isotope Labeling Analysis by Mid-Infrared Laser Spectroscopy. Environmental Science & Technology, Environ. Sci. Technol.,2017,51(20), pp 1187611883 2.Improved method for isotopic and quan