實(shí)用HPLC方法的建立施超歐

1、實(shí)用HPLC方法的建立2003.03.301目錄1 前言2 HPLC方法建立的步驟2.1 了解樣品的有關(guān)情況2.2 明確分析目的2.3 樣品的預(yù)處理與檢測(cè)2.4 HPLC分析模式的選擇2.5 色譜條件2.6 方法的優(yōu)化，及色譜現(xiàn)象的解析和處理2.7 定性和定量方法的建立及論證23 色譜條件的選擇3.1 流動(dòng)相的選擇3.2 檢測(cè)器的選擇3.3 樣品的溶解及預(yù)處理3.4 樣品的進(jìn)樣量3.5色譜柱的選擇及保護(hù)與再生3.6 泵的選擇3.7 色譜工作站4 分析方法建立的實(shí)例4.1 等度分析4.2 梯度方法的建立4.3 色譜柱及pH的影響35 色譜分析中各種圖譜現(xiàn)象的判斷5.1 基線噪音的產(chǎn)生和處理5.2

2、 基線漂移(上漂和下漂)5.3 倒峰的產(chǎn)生和消除5.4 鬼峰的產(chǎn)生和消除5.5 峰前移和退后的判斷5.6 前沿峰和拖尾峰的判斷5.7色譜雙峰的判斷5.8 色譜峰變胖的判斷和處理41 前言HPLC作為色譜的一個(gè)重要分支，在色譜分析中占有重要的地位，將逐步取代氣相色譜成為最重要的色譜分析手段。HPLC技術(shù)的發(fā)展和科技的進(jìn)步，使得HPLC廣泛應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域。HPLC實(shí)驗(yàn)技術(shù)是一個(gè)實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的操作技能，現(xiàn)行的各類書籍并不能包羅一切知識(shí)，實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)非常重要。HPLC技能是一個(gè)綜合性的技能，需日積月累，厚積薄發(fā)，非一日之功。 出的來，跑的快，分的開52 HPLC方法建立的步驟62.1 了解樣品的有關(guān)情況首先

3、應(yīng)對(duì)樣品有足夠的了解，并明確分析目的（同一樣品，不同的測(cè)試要求，其方法也可能不一致）。樣品的重要性質(zhì)包括：所含化合物的數(shù)目；化學(xué)結(jié)構(gòu)（官能團(tuán)）；分子量；pKa值；UV光譜圖；被測(cè)組分在樣品中的濃度范圍；樣品的溶解度、沸點(diǎn)及其穩(wěn)定性；可能存在的干擾物質(zhì)及樣品的復(fù)雜程度等。71 分析大分子、小分子還是生物分子一般常規(guī)的HPLC分析分子量2000以下，大分子一般采用凝膠色譜、生物大分子采用不能變性的色譜體系。2 樣品是混合物、天然物質(zhì)還是基本是單一物質(zhì)。如果是天然物質(zhì)，一般分離完全采用梯度體系?；旌衔镏惺欠裼薪Y(jié)構(gòu)類似的異構(gòu)體，組分復(fù)雜的還是采用梯度，是否是系列反應(yīng)的產(chǎn)物。3 測(cè)定是主成分、還是少量成

4、分或痕量成分。主含量的測(cè)定一般比較容易；但少量要考慮分離完全的問題；痕量成分則要考慮檢測(cè)器的類型，采用何種提取方法和檢測(cè)的靈敏度等。84 分離化合物是極性，弱極性、非極性還是離子化合物、兩性化合物。非極性化合物以正相體系較多，如果溶于反相體系的溶劑，可采用反相體系。弱極性、極性化合物采用反相較為方便，可在流動(dòng)相中添加改性劑，調(diào)節(jié)合適的pH。離子化合物可以采用反相，調(diào)節(jié)pH；或者添加離子對(duì)試劑；也可采用離子交換。兩性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的則考慮離子交換；也可考慮衍生后測(cè)定。對(duì)于極性的糖類物質(zhì)，可用NH2柱，有條件的用聚合物的糖柱。多糖類的則要采用凝膠系統(tǒng)。大分子的極性化合

5、物、離子化合物，往往采用特定的色譜柱，多為聚合物柱子。手性化合物，則要用手性流動(dòng)性或者采用手性柱。95 樣品的溶解度、沸點(diǎn)樣品在不同溶劑中的溶解度，對(duì)色譜條件的選擇非常重要，測(cè)定其溶解的性能，則可以判斷其化合物可能的類型。非極性樣品不溶于水，但溶于有機(jī)溶劑。如果只能溶于非極性溶劑，一般建議做正相。溶于極性溶劑，以反相為上策。極性和離子化合物一般都溶于水，但在不同pH下區(qū)別可能很大。極性化合物在水和極性溶劑中都有一定的溶解度。從溶解度可以判斷出采用何種體系為佳。易揮發(fā)性的低沸點(diǎn)的物質(zhì)在ELSD中難以檢測(cè)。有存在特例。106 樣品的穩(wěn)定性如果樣品存在水解、光解、醇解、氧化、分解則測(cè)定時(shí)需注意。對(duì)光

6、敏感物質(zhì)，用棕色瓶，避光保存，不宜存放，隨配隨做。易水解的物質(zhì)、要選擇合適的溶解溶劑。有些樣品可能存在醇解，流動(dòng)相不能用甲醇，而要用乙腈。易氧化的物質(zhì)，溶解時(shí)可考慮加抗氧劑，調(diào)節(jié)pH，如PAP的測(cè)定。胺類化合物。產(chǎn)品不穩(wěn)定的化合物，分析越快越好。117 化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)（官能團(tuán)）常見的基本結(jié)構(gòu)是苯環(huán)、雜環(huán)、多環(huán)芳烴?；鶊F(tuán)有COOH、OH、NH2、SO3H、Cl（Br）、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。親水性的基團(tuán)在反相中出峰時(shí)間前移，疏水性的基團(tuán)出峰后移。從存在的結(jié)構(gòu)可以判斷出其在溶劑中的溶解度。8 化合物的pK 值知道pK值，有助于方法的建立，尤其流動(dòng)相pH

7、的選擇。pK的差異是官能團(tuán)造成的。129 UV光譜圖知道其吸收波長的曲線有助于檢測(cè)，如果有DAD則關(guān)系不大。多組分的樣品，宜多選幾個(gè)波長。同一樣品在不同的流動(dòng)相及pH最大波長可能不一致。有雙鍵共軛的結(jié)構(gòu)紫外吸收較大，單鍵的則在低紫外區(qū)有一定的吸收10 樣品的復(fù)雜層度梯度方法分析預(yù)處理,分成幾個(gè)部分分析痕量物質(zhì)的富集總之，充分了解了被分離樣品的性質(zhì)，將可能提供一個(gè)參考的分析條件，縮短分析時(shí)間和分析難度。132.2 明確分析目的1 定量分析？檢出某種物質(zhì)？未知物的確定？純化制備？光譜鑒定？2 是否將所有組分分開，定性？一種條件有困難？分組分析？3 定量分析的準(zhǔn)確度和精密度？（主成分在12）4 不同

8、樣品基質(zhì)對(duì)分離的影響（如原料藥、粗品、精品、殘留、環(huán)境樣品等）5 分析的工作量，少數(shù)還是大量？時(shí)間和效率與分離的選擇。6 實(shí)驗(yàn)室的條件，如HPLC儀器的配置和檔次；色譜柱系統(tǒng)；是否有恒溫；是否可以做梯度；分析成本；實(shí)驗(yàn)室人員的操作技能；方法的移植等等。142.3 樣品的預(yù)處理與檢測(cè)樣品來源的形式1 可直接進(jìn)樣的溶液（注意是否與流動(dòng)相匹配）2 需稀釋、pH緩沖、加內(nèi)標(biāo)或其它操作3 固體樣品選擇合適的溶劑4 需提取分離的樣品5 預(yù)處理，除去干擾物尤其對(duì)儀器和柱子有損害的物質(zhì)。總之，將樣品溶于合適的溶液；或者用合適的溶液提取出來、或者分離處理對(duì)測(cè)定有干擾的物質(zhì)，在處理中應(yīng)注意被測(cè)組分的穩(wěn)定性和提取率

9、。152.4 HPLC分析模式按照樣品的特性分為以下二類：A 一般樣品（ 強(qiáng)有機(jī)溶劑) 通常最有效。低 pH 流動(dòng)相, 如 0.1% TFA or 0.01M H3PO4, 也是有效的。升高溫度（60-80）39色譜柱的修復(fù)和再生 -化學(xué)變化 IIExample: 4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 Flow rate: 1 mL / min; Temp: 80 A: 0.1% TFA in water B: 0.1% TFA in acetonitrile 100% A for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100

10、% B for 30 min., Return to 100% A in 5 min.Repeat 3 times。6M鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白質(zhì)的沉積。XDB, 有機(jī)聚合物等填料可使用高pH 水溶液 /有機(jī)溶液，如： 0.01M NaOH 50% 異丙醇 /水溶液，硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時(shí)間 (15-30 min)。403.56 色譜柱使用的幾個(gè)注意點(diǎn)使用保護(hù)柱樣品和流動(dòng)相過濾柱子反做(當(dāng)正做實(shí)在不行時(shí))當(dāng)柱壓明顯升高時(shí)，對(duì)柱頭塞板清洗及更換部分填料。少使用離子對(duì)試劑色譜柱避免強(qiáng)酸強(qiáng)堿接觸，選擇合適保存條件。分析時(shí)，避免長時(shí)間色譜柱進(jìn)大量氣泡，長時(shí)間不用，經(jīng)常保存流動(dòng)相過

11、，防止柱子干掉。413.6 泵的選擇泵可分為單泵、雙泵和四元泵。方法建立建議用雙泵或四元泵。泵也可分為高壓混合和低壓混合。四元泵是低壓混合。高壓混合不易出氣泡，低壓混合應(yīng)嚴(yán)格脫氣，最好用在線脫氣機(jī)。為避免氣泡產(chǎn)生，可在柱后接反壓柱。分析完后，避免鹽類在管路中過夜。泵的運(yùn)行壓力建議不超過極限值的5060。423.7 色譜工作站如有可能，建議采用原裝色譜工作站。有的單位因經(jīng)費(fèi)緊張，采用國產(chǎn)工作站，這也可以的。國內(nèi)工作站種類很多，但技術(shù)支持都比較弱。研究、方法開發(fā)的單位還是采用原裝工作站比較好，并注意及時(shí)升級(jí)。434 分析方法建立的實(shí)例4.1 等度分析色譜柱：C18，4mm30mm流動(dòng)相：乙腈/水，

12、不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：2ml/min樣品： 對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)44改變?nèi)萘恳蜃?K45改變選擇性a通過改變流動(dòng)相改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱464.2 梯度方法的建立梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式柱需再生定量分析的重復(fù)性較低分析時(shí)間長47梯度的洗脫方式高壓梯度及低壓梯度48梯度洗脫的可變參數(shù)A及B(可能還有C和D液)的成分和化學(xué)特性梯度的陡度梯度的變化形狀

13、49如不用梯度：分離不理想50梯度條件的優(yōu)化51梯度曲線的變化凹線52梯度曲線的變化凸線53梯度平衡時(shí)間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)54梯度平衡時(shí)間的影響（二）平衡時(shí)間6分鐘平衡時(shí)間7分鐘平衡時(shí)間8分鐘平衡時(shí)間9分鐘平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足。55有機(jī)污染物的影響（一）50ml超純水的有機(jī)物污染狀態(tài)56有機(jī)污染物的影響（二）“三蒸水”有大量的有機(jī)污染物不適合梯度分析57有機(jī)污染物的影響（三）典型的“實(shí)驗(yàn)室水”有大量的有機(jī)污染物不適合高靈敏度梯度分析58梯度方法開

14、發(fā)實(shí)例 - 第一步開發(fā)一個(gè)有9個(gè)烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的條件下(0-100% 水-乙腈)，分離不理想。整個(gè)色譜峰組保留時(shí)間太長，分離度也不好59梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第二步為使色譜峰前移，提高起始時(shí)乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個(gè)化合物出了10個(gè)色譜峰，說明有雜質(zhì)存在，很可能是流動(dòng)相水中的。60梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第三步 從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測(cè)靈敏度下，共有兩個(gè)雜質(zhì)峰。說明流動(dòng)相水中的雜質(zhì)在此條件下可能會(huì)對(duì)檢測(cè)有影響。61梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第四步 空白梯度圖同樣品的色譜圖進(jìn)行對(duì)照后，我們看到雜質(zhì)（共兩個(gè)峰）中的第

15、一個(gè)小峰對(duì)第8個(gè)色譜峰有干擾，會(huì)使其定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確。62梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第五步 根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號(hào)峰提前(曲線5，50-100%B)，但是小峰仍沒有分出來。63梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第六步 根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號(hào)峰提前，改用50-95%B見到好的現(xiàn)象。64梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第七步最后用50-90%B，曲線4，得到好的結(jié)果。654.3 色譜柱及pH的影響尿嘧啶3-丁基吡啶4-苯基丁胺4-苯基丁酸苯酚丙基苯1,4-二羥基蒽醌N,N-二乙基間甲苯酰胺丁基苯* 4-Phenylbuty

16、lamine was not used for testing at pH 2.5* 4-Phenylbutyric acid was not used for testing at pH 766苯基a芘1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘菲3,4-c并菲67HPLC 條件- 試驗(yàn) 1流動(dòng)相：乙腈：20mM 磷酸鉀緩沖液 pH 2.5 (65:35)流速:1.0mL/min柱溫: 30C紫外檢測(cè)器:254nm進(jìn)樣量:10L樣品(mg/mL):尿嘧啶(0.025), 3-丁基吡啶 (0.067),苯酚 (0.90), 4-苯基丁酸 (2.1),N,N-二乙基間甲苯酰胺 (0.66), 1,4

17、二羥基蒽醌(0.20), 丙基苯 (5.0), 丁基苯 (6.7) 用流動(dòng)相溶解68HPLC 條件- 試驗(yàn) 2流動(dòng)相:乙腈:20mM 磷酸鹽緩沖液,pH 7.0 (65:35)流速:1.0mL/min柱溫: 30C紫外檢測(cè)器: 254nm進(jìn)樣體積:10L樣品 (mg/mL):尿嘧啶(0.05), 3-丁基吡啶(0.02), 苯酚(1.0), 4-苯基丁胺(4.0),N,N-二乙基間甲苯酰胺(1.0), 1,4-二羥基蒽醌 (0.20), 丙基苯 (4.0),丁基苯(4.0) 用流動(dòng)相溶解69流動(dòng)相:乙腈:H2O (85:15)流動(dòng)相:2.0mL/min柱溫: 25C紫外檢測(cè)器:254nm進(jìn)樣體

18、積: 10L樣品:苯a芘,1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘, 菲3,4-c并菲,丙酮HPLC 條件 試驗(yàn)370Column:Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mm1a堿滅活1b非堿滅活1. 尿嘧啶2. 3-丁基吡啶3. 苯酚4. 4-苯基丁酸5. N,N-二乙基間甲苯酰胺 (DEET)6. 1,4二羥基蒽醌7. 丙基苯8. 丁基苯Column: Adsorbosphere C18, 5m, 150 x 4.6mm pH 2.5 的色譜圖712a堿滅活2b非堿滅活pH 7 的色譜圖Column:Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mmColumn: Ad

19、sorbosphere C18, 5m, 150 x 4.6mm1. 尿嘧啶2. 苯酚3. 4-苯基丁胺4. N,N-二乙基間甲苯酰胺5. 3-丁基吡啶6. 1,4二羥基蒽醌7. 丙基苯8. 丁基苯72pH2.573pH7.0741. 丙酮2. 苯a芘 3. 菲3,4-c并菲 4. 1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘3aPlatinum C18, 5m, 150 x 4.6mm3bNucleosil C18 AB, 5m, 150 x 4.6mm3cInertsil ODS-2, 5m, 150 x 4.5mm755 色譜分析中各種圖譜現(xiàn)象的判斷5.1 基線噪音的產(chǎn)生和處理可能產(chǎn)生的原因

20、及處理辦法1 流動(dòng)池臟，用極性試劑清洗。當(dāng)有填料進(jìn)入，拆開流通池。2 檢測(cè)器燈有問題，如能量偏低，更換氘燈。3 周期性的波動(dòng)，則起源于泵的脈沖，檢修泵或更換墊片等。4 溫度對(duì)檢測(cè)器的影響，控制溫度。5 氣泡經(jīng)過檢測(cè)器，用大流量沖洗。6 可能難出峰的樣品連續(xù)不斷出來，用強(qiáng)極性流動(dòng)相沖柱。7 流動(dòng)相本底高，如水的純度不夠，換超純水。或試劑純度不夠， 換色譜純的試劑。8 注意數(shù)據(jù)采樣和連接問題。Time (min.)765.2 基線漂移（上漂和下漂）1 柱中的流動(dòng)相沒有平衡，延長平衡時(shí)間，尤其在流動(dòng)相中添加了有紫外吸收的添加劑。2 在梯度洗脫中，基線上漂是正常的，在空白梯度中有可能是柱子中有雜質(zhì)洗出

21、。其次是流動(dòng)相中有干擾物。換流動(dòng)相。3 溫度不穩(wěn)定（示差檢測(cè)器），控溫。4 在等度分析中，樣品緩慢洗出，改變淋洗液強(qiáng)度或用梯度分析。5 樣品進(jìn)入檢測(cè)器，吸附在池中，可能每進(jìn)樣一次，本底一次比一次高，很少見。775.3 倒峰的產(chǎn)生和消除1 柱切換的脈沖效應(yīng)，一般不是很明顯，必要時(shí)考慮換閥。2 在低波長分析時(shí)，流動(dòng)相本底比較高時(shí)，而樣品用本底低的流動(dòng)相溶解，肯定出現(xiàn)倒峰，其程度同進(jìn)樣量和本底差有關(guān)。解決辦法，用流動(dòng)相溶解樣品，減少進(jìn)樣量，消除倒峰的影響。高波長時(shí),影響比較小。3 如果倒峰不影響峰的分離，對(duì)外標(biāo)法定量不影響。但影響面積歸一化法。4 樣品中有比流動(dòng)相本底低的物質(zhì)存在，如無機(jī)鹽等，將出倒

22、峰。這種情況下，倒峰的位置不一定在死體積位置出現(xiàn)（大多數(shù)在死體積位置出現(xiàn)）。785.4 鬼峰的產(chǎn)生和消除 1 樣品分析時(shí)峰沒出完，在下一針或下下一針出現(xiàn)，判斷辦法，延長分析時(shí)間，計(jì)算可能出現(xiàn)的保留時(shí)間。然后調(diào)整流動(dòng)相。 2 連續(xù)進(jìn)樣，在某個(gè)位置出現(xiàn)忽高忽低的峰，最可能是進(jìn)樣針污染，清洗進(jìn)樣針，注意黑垢的干擾，有些樣品易殘留在針管里。可重新取樣分析。 3 定量管污染，處理方法同上。 4 在死體積位置出現(xiàn)的小峰，可能是柱切換造成的。 5 流動(dòng)相與樣品溶劑不一致，也會(huì)出現(xiàn)鬼峰，尤其在低波長時(shí)，出現(xiàn)位置在死體積的地方。 6 氣泡，如果有小氣泡通過流通池，也出現(xiàn)隨機(jī)的假峰，大氣泡存在，其出現(xiàn)的峰往往直上

23、直下，脫氣解決。 7 樣品發(fā)生變化反應(yīng)，重新取樣快速分析。795.5 峰前移或退后的判斷1 有規(guī)律的變化一般可能是流動(dòng)相沒平衡，如低濃度的緩沖液或離子對(duì)試劑，樣品對(duì)pH變化極敏感。2 溫度變化，當(dāng)天氣變化快，分析時(shí)間長，比較明顯，用柱溫箱，空調(diào)解決此類問題。3 流動(dòng)相揮發(fā)，尤其用揮發(fā)性的酸時(shí)，時(shí)間長了酸度會(huì)發(fā)生變化，流動(dòng)相新鮮配置。4 儀器尤其泵的運(yùn)行時(shí)間長后，重現(xiàn)性不好，儀器老化，在梯度分析時(shí)尤其明顯，也可能流速不穩(wěn)，或有氣泡。5 在分析某樣品后，柱子可能發(fā)生改性，再次分析重現(xiàn)性變差，清洗或再生柱子。6 進(jìn)樣濃度不一，溶劑不一，也會(huì)造成保留時(shí)間不一致。805.6 前沿峰和拖尾峰的判斷和處理5

24、.6.1 前沿峰的產(chǎn)生和處理（對(duì)稱性小于0.9)1 色譜柱漏穿，柱效明顯偏低，柱壓偏低，如所有峰都出現(xiàn)，換柱。2 樣品溶劑極性遠(yuǎn)大于流動(dòng)相，局部改變了流動(dòng)相平衡體系，辦法是減少進(jìn)樣量，更換樣品溶劑。3 分離不完全，有大量峰重疊，（如系列物），辦法，改變流動(dòng)相，采用梯度洗脫。815.6.2 拖尾峰的判斷和處理（對(duì)稱性大于1.2）1 色譜柱柱頭塌陷，有死體積，柱效明顯下降，所有峰都如此，換柱。2 色譜柱填料流失，例如C18在堿性流動(dòng)相中，一般是使用較長時(shí)間后造成的，換柱。3 用C18柱分析堿性化合物，可用BDS柱或未端封尾柱，或在流動(dòng)相中添加減尾劑（三乙胺等）。4 過載或超載，有可能在檢測(cè)器上由于靈敏度差，響應(yīng)小，辦法