用ImagePro-Plus-分析免疫組化圖片

1、用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫組化圖片 1 1.免疫組化圖片分析原理根據(jù)染色染料顏色的深淺(光密度)及分布面積大小來確定目標蛋白的量。染色區(qū)域分布面積與目標蛋白量成正比。染色的顏色深淺(光密度)與目標蛋白量的定量關系符合朗伯-比爾定律，是對數(shù)關系。2 1.1光密度與灰度迷惑人的不同概念光密度：吸收光的物質的光學密度。（optical density,就是常說的OD值）光密度值是直接與染色物質的量相關的。灰度：灰是不夠黑，是反射亮度的單位。電子照片上像素的亮度稱為灰度。3 Gray: between white and blackExample: 1.The brigh

2、t value on display screen is gray value. 2.The dark value on a white paper is also the gray value.4 Optical Density:吸收光線的物質的光學密度.被測物質的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值與物質的量直接相關，灰度值與OD值成對數(shù)關系，符合朗伯-比爾定律。理論上OD值是從零到無窮大。實際應用中，OD值的范圍常用0 - 2.0或者0 - 3.0。5 用OD值是正確的分光光度計與酶標儀的測定值是OD值透射的顯微鏡圖象上的光強度要用OD值蛋白電泳條帶的

3、測量也是OD值。螢光顯微鏡及螢光分光光度計的測量值是螢光強度(Fluorescence intensity)用EB染色的DNA凝膠電泳條帶也是螢光強度，但處理方法與光密度相同，故也用OD值。這個OD與前面的OD又有不同的意義。它就是熒光的光密度。反映著熒光物質的多少。Western Blot條帶的測定也要使用OD值來進行定量.6 處理照片時用的卻是灰度各種圖象被拍攝成照片進行數(shù)字圖象處理時，是對照片的灰度進行測量和計算的。但最后得到的結果還是需要換算回OD值來表達。所以對免疫組化照片的分析結果應該是一個OD值，光密度。不應該是灰度。準確地說，是對免疫組化照片的特定染色區(qū)域的灰度進行分析從而測量

4、出組織切片的光密度值。7 用標準樣品才能把OD值與樣品量關聯(lián)到一起OD值是一個沒有單位的相對值。使用酶標儀或分光光度計時要作標準曲線。對電泳條帶進行定量分析時一樣要作標準曲線。電泳條帶照片的灰度值與樣品量的關系為指數(shù)函數(shù)。在把灰度值轉換成OD值時，用一個標準點進行定量分析是不準確的。多個標準點的標準曲線亦有很大誤差，因此只能說是半定量分析。在實際應用時,可以直接測量OD值,用以表達染色物質的相對的量.8 1.2定量分析的指標：IOD ( Integrated option density )與density將圖片上各點的光密度值累加起來，得到IOD。此值與目標物質的總量成正比。IOD值除以目標

5、分布區(qū)域的面積，得到平均density，此值反映了目標物質的單位面積濃度。對樣品照片進行數(shù)字圖像分析比較時，就是比較它們之間的平均光密度值的大小。9 1.3比較兩張照片的染色物質量的差別兩張照片染色深度一樣，染色面積大的質量大照片A照片B10 比較兩張照片的染色物質量的差別兩張照片染色區(qū)域面積相同，染色深的質量大照片A照片B11 這回該怎么看？A的顏色深，面積小。B的顏色淺，面積大。照片A照片B12 比較體積！面積光密度13 1.4 實際圖片的情況很復雜的。陽性樣品染色深，陰性樣品染色淺。14 直接比較整張圖片的IOD等于在比較整張圖片的mean density15 哪一個染色物更多？染色區(qū)域

6、顏色接近，染色面積有差異。16 使用不同的area會得到不同的結論要結合病理情況來判斷。IOD對整張圖片的面積作平均。IOD對特定組織區(qū)域面積作平均。IOD對顯色的組織區(qū)域作平均。17 對整張圖片區(qū)域進行平均的情況比較少18 右上角的空白應該扣除。19 也許應是這個特定的組織區(qū)域20 這個區(qū)域是染色的區(qū)域。往往在計算IOD時同時計算出來，但以此為平均面積往往并不正確。21 對單個細胞的分析比較單個細胞的IOD單個細胞的mean density22 邊界不清晰的貼壁細胞整張圖片IOD/細胞個數(shù)（照片中細胞數(shù)目不多，數(shù)起來不費事）23 細胞簇的分析測量整張圖片黃色區(qū)域IOD。再測量細胞分布的區(qū)域面

7、積 area。對染成藍色的細胞核計數(shù)，作為細胞數(shù)N。以 IOD /（N * area）作為統(tǒng)計指標。24 2.從圖片上分析光密度方法 的技術發(fā)展簡單測量整張照片的光密度值。在照片上隨機選取數(shù)個區(qū)域，測量其光密度值。計算其平均值作為整張照片的光密度值。在照片上準確選擇被染上染料的特定顏色的區(qū)域，計算這些區(qū)域的累積光密度值（IOD），進而計算統(tǒng)計區(qū)域的平均光密度值。25 2.1測定整張照片的光密度-圖象分析儀其測定原理有點象分光光度計，直接測定切片的整體光密度。可以根據(jù)照片上象素點的亮度來區(qū)分測定區(qū)域其缺陷是顯而易見的。復染上的其他顏色的染料也會產(chǎn)生光密度吸收，導致嚴重的干擾。26 2.2 抽樣測

8、量光密度在彩色電子圖片上選取目標顏色區(qū)域，抽樣測量這些小區(qū)域的灰度值，取其平均值作為比較染色深淺的指標。隨機選取幾個區(qū)域但是能作到“隨機”嗎？27 2.3 ImagePro plus(IPP)的獨特優(yōu)勢。準確地按照一個顏色標準來選取一個AOI (area of interesting ) 。測量這個區(qū)域的光密度參數(shù)。28 使用IPP比前兩種方法更好。在查到文獻中使用的圖象分析方法是前兩種的時候，完全可以用IPP的分析測量來代替。結果更加準確。不必照搬文獻上所述的方法。隨著計算機技術的發(fā)展，以后也許還會有更好的圖象分析方法及圖象分析程序的。29 3.用IPP分析免疫組化圖片過程選取圖片上具有染料

9、色調的區(qū)域（AOI，area of interesting）。測量該區(qū)域的IOD。選擇并測量有效統(tǒng)計區(qū)域的面積計算選擇區(qū)域內的光密度平均值IOD/area（density mean）計算同一實驗組切片各照片的平均及標準差。用統(tǒng)計學方法分析各實驗組的平均density mean之間是否有顯著性差異。30 3.1用于免疫組化半定量分析的照片拍攝與普通顯微鏡照片不同，用于免疫組化分析的顯微鏡照片有其特殊的拍攝要求。31 顯微鏡光源正確調整顯微鏡光源為日光色溫的白色光。此時是加藍色濾光片，燈絲電壓為10V左右。一般的顯微鏡上都會有指示的。此時的鏡下視野會感覺明亮得有點刺眼。不能通過調整光圈的方法減低亮

10、度，這會影響到圖象的清晰度。光圈與聚光鏡要按照柯勒方法調整以保證照片的清晰.不能加過大的灰度鏡減低亮度。用25%的灰度濾光片還行。6%的灰度濾光片會導致色彩失真。如果照明光源不白，有偏色，將直接影響到照片色彩，從而使得測量結果不準確。32 固定顯微鏡的工作條件不僅是光源亮度，除了更換樣品時調節(jié)載物臺位置，其他部件一律固定下來。特別是不要來回切換使用不同放大倍數(shù)的物鏡。使用一個物鏡拍攝所有的照片后，再切換到另一個物鏡上拍攝照片。為保證顯微鏡光源的穩(wěn)定一致，所有照片應該一次拍攝完成。不能分數(shù)次拍攝。若能給顯微鏡加上穩(wěn)壓電源就更好了。這能保證顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定。33 應該使用手動控制曝光的相機對每

11、張照片要使用相同的曝光時間，而不是由相機自動控制曝光。染色深的陽性樣品就應該拍攝得較暗。染色淺的陰性對照樣品則應該拍攝得較明亮。34 控制相機曝光時間要把相機曝光時間控制到使視野中空白的地方呈現(xiàn)純亮的白色。拍攝出的照片上，沒有組織的空白處的背景灰度值應達到230左右?？梢允褂脠D象分析軟件測量一下空白處的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易產(chǎn)生色彩的偏離，會影響到圖像分析數(shù)值的偏差。把空白灰度值調到230相當于在分光光度計上調節(jié)100%透射。35 背景的影響左圖：暗且偏藍的背景嚴重降低了黃色的IOD值。而且影響到了陽性區(qū)域的色調。36 較暗的背景值對分析測量的影響顯著性差異無顯著性差異37

12、扣背景后依然沒有顯著性差異注意誤差線，依然沒有顯著性差異38 避免使用相機的自動白平衡自動白平衡功能是相機根據(jù)照片總體色彩情況自動對每張照片進行各自不同的白平衡校正。這會嚴重影響分析測量的準確性。顯微鏡照片用一兩種染料染色，照片的色彩就應該是不平衡的，不能校正。由于免疫組化照片上黃色染色多,自動白平衡會將圖片色調向藍色調整,導致色彩的失真.39 最好使用專業(yè)CCD拍攝民用數(shù)碼相機適用于拍攝日常生活中的照片，其自動曝光、自動白平衡功能會有效改善照片的直觀效果。但對于顯微鏡照片，這些功能卻會改變照片的原始面貌，嚴重影響照片的分析測量結果。要想關閉這些功能，往往要進行很復雜的設置。不使用自動白平衡校

13、正，但可以使用手動的白平衡校正背景色彩。對所有照片進行統(tǒng)一的背景色彩校正。使得照片中空白的背景呈白色。40 應當把照片存為無損壓縮格式TIFF特別是對于染色較淺的圖片，保存為jpeg格式后會損失亮度細節(jié)，導致測量誤差增大。要注意相機上直接保存為jpeg的圖片就沒必要轉成TIFF了.注意那些馬賽克41 總結拍攝注意事項：調整顯微鏡光源亮度，足夠白，足夠亮。調整相機曝光時間，使背景呈現(xiàn)白色?；叶戎底詈媚苓_到230以上。確認相機未使用自動白平衡功能。但可以使用手動校正白平衡功能校正背景色彩為純白色。使用同樣的顯微鏡工作條件與相機工作條件一次拍攝完所有照片。保存照片為TIFF格式。42 3.2用Ima

14、ge-pro plus分析免疫組化圖片與photoshop不同，image-pro plus是一個圖片分析測量軟件。IPP的功能不是用來美化圖片，如果照片效果不好或分析結果不理想，要從切片處理與拍攝過程上找原因，而不應試圖通過對圖片的修飾與處理來解決問題。通過IPP的分析測量只應當準確地反映圖片本身的真實測量數(shù)據(jù)。43 3.2.1開始使用IPPIPP的程序界面是典型的windows風格。它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。進入IPP后的第一件事就是打開一幅待分析的圖片。44 45 將分析圖片信息保存到數(shù)據(jù)庫中在程序中保存分析圖片過程信息是保存實驗原始數(shù)據(jù)的基本原則，必須遵守。

15、將圖片信息及圖片分析過程及分析的信息存入IPP程序數(shù)據(jù)庫是一種保存實驗原始數(shù)據(jù)的操作。要注意對同一張圖片進行同樣的操作，由于一些手動的操作無法準確地重復，所以會出現(xiàn)兩次同樣的測量得到有差異的結果的情況。這也是保存測量結果的理由之一。46 3.2.2.設置并保存測量條件設置光密度校正設置測量項目.設置分色選擇參數(shù)47 3.2.2.1光密度校正方法48 49 50 51 校正光密度步驟小結.1.調出intensity carliberation窗口,點New按紐建立一個新的校正.2.選擇std option density,此時可見到反向的校正曲線.3.選擇背景空白值對應的灰度.相當于分光光度計中

16、的調整100%透射.4.選擇此校正為system carliberation,使之能應用于所有照片.52 3.2.2.2選擇測量參數(shù)需要測量選擇區(qū)域的面積(area)與累積光密度(IOD).在測量選項中也有平均光密度這一項,但它不適用于當前的測量,不能選用.選擇面積時一般要設置一個過濾值,忽略掉面積過小的點,一般可設置為最小20象素.還要設置一下測量的顯示選項(option),一般是選擇顯示選擇區(qū)域填充紅色.還有一些其他的設置.53 選擇測量參數(shù)在分析免疫組化圖象時,一般是測量選定的具有特定顏色的區(qū)域的面積與累積光密度(IOD)對免疫組化的顯微照片,一般應分析它的平均光密度.即時IOD/are

17、a.根據(jù)圖象的特點,要分別測量選擇區(qū)域的IOD及area.對不同的組織照片，要使用不同的測量指標來進行比較。54 在count/size里進行這些設置55 調出的select Measurements,56 Option設置窗口57 保存設置:file save settings58 3.2.2.3選取特定顏色所在的區(qū)域一般免疫組化樣品中黃色的地方為陽性染色區(qū)域。在測量時應當測量這些黃色（棕黃色）區(qū)域的光密度值。不測量其他顏色部分的。因此首要的任務就是把這些黃色的區(qū)域挑選出來。IPP是利用圖片上象素點的顏色分類來選取測量區(qū)域的。其選擇工具irregular AOI與segmentation是I

18、PP最有特色，最有效的工具。59 用IPP選取特定顏色區(qū)域的工具選擇特定顏色的區(qū)域是IPP最有特色的功能，按照特定的顏色特征選取圖象中的特定區(qū)域，并計算這些區(qū)域的面積等幾何尺寸與光密度數(shù)據(jù)，就是IPP分析圖像工作的中心任務。Irregular AOI:適用于選擇有明顯顏色邊界的單個顏色區(qū)域。Segmentation：適用于選取整張圖片中具有特定顏色的所有區(qū)域。測量免疫組化圖片一般使用這個工具。60 在count/size窗口中點select color,就調出了這個segmentation工具.61 點Histogram Based,還要選HIS.62 在彈出的警告上點“是”。63 H：0-3

19、0，S：0-255，I：0-23064 設置好的選色條件也要保存的。65 測量光密度時，要測量灰度圖片彩色圖象上象點的強度是由紅藍綠三色混合而成，如果直接在彩色圖上測量光密度，會有一個系統(tǒng)誤差。所以正規(guī)的測量需要把圖象中選取的區(qū)域外部分涂白，然后轉換圖象為灰度圖片，再測量光密度。66 選擇Transparent on White，只顯示選擇到的區(qū)域。再點create preview image復制出一張。67 將復制的圖片轉換成灰度圖片。68 對此圖片再作一次選色，這次只需選擇一個強度了。I：0-23069 70 還要保存一次灰度選色設置。71 3.2.2.4 好啦，點count進行測量。72