用ImagePro-Plus-分析免疫組化圖片

1、用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫組化圖片 1 1.免疫組化圖片分析原理根據(jù)染色染料顏色的深淺(光密度)及分布面積大小來確定目標(biāo)蛋白的量。染色區(qū)域分布面積與目標(biāo)蛋白量成正比。染色的顏色深淺(光密度)與目標(biāo)蛋白量的定量關(guān)系符合朗伯-比爾定律，是對(duì)數(shù)關(guān)系。2 1.1光密度與灰度迷惑人的不同概念光密度：吸收光的物質(zhì)的光學(xué)密度。（optical density,就是常說的OD值）光密度值是直接與染色物質(zhì)的量相關(guān)的。灰度：灰是不夠黑，是反射亮度的單位。電子照片上像素的亮度稱為灰度。3 Gray: between white and blackExample: 1.The brigh

2、t value on display screen is gray value. 2.The dark value on a white paper is also the gray value.4 Optical Density:吸收光線的物質(zhì)的光學(xué)密度.被測物質(zhì)的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值與物質(zhì)的量直接相關(guān)，灰度值與OD值成對(duì)數(shù)關(guān)系，符合朗伯-比爾定律。理論上OD值是從零到無窮大。實(shí)際應(yīng)用中，OD值的范圍常用0 - 2.0或者0 - 3.0。5 用OD值是正確的分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀的測定值是OD值透射的顯微鏡圖象上的光強(qiáng)度要用OD值蛋白電泳條帶的

3、測量也是OD值。螢光顯微鏡及螢光分光光度計(jì)的測量值是螢光強(qiáng)度(Fluorescence intensity)用EB染色的DNA凝膠電泳條帶也是螢光強(qiáng)度，但處理方法與光密度相同，故也用OD值。這個(gè)OD與前面的OD又有不同的意義。它就是熒光的光密度。反映著熒光物質(zhì)的多少。Western Blot條帶的測定也要使用OD值來進(jìn)行定量.6 處理照片時(shí)用的卻是灰度各種圖象被拍攝成照片進(jìn)行數(shù)字圖象處理時(shí)，是對(duì)照片的灰度進(jìn)行測量和計(jì)算的。但最后得到的結(jié)果還是需要換算回OD值來表達(dá)。所以對(duì)免疫組化照片的分析結(jié)果應(yīng)該是一個(gè)OD值，光密度。不應(yīng)該是灰度。準(zhǔn)確地說，是對(duì)免疫組化照片的特定染色區(qū)域的灰度進(jìn)行分析從而測量

4、出組織切片的光密度值。7 用標(biāo)準(zhǔn)樣品才能把OD值與樣品量關(guān)聯(lián)到一起OD值是一個(gè)沒有單位的相對(duì)值。使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)時(shí)要作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)電泳條帶進(jìn)行定量分析時(shí)一樣要作標(biāo)準(zhǔn)曲線。電泳條帶照片的灰度值與樣品量的關(guān)系為指數(shù)函數(shù)。在把灰度值轉(zhuǎn)換成OD值時(shí)，用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行定量分析是不準(zhǔn)確的。多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線亦有很大誤差，因此只能說是半定量分析。在實(shí)際應(yīng)用時(shí),可以直接測量OD值,用以表達(dá)染色物質(zhì)的相對(duì)的量.8 1.2定量分析的指標(biāo)：IOD ( Integrated option density )與density將圖片上各點(diǎn)的光密度值累加起來，得到IOD。此值與目標(biāo)物質(zhì)的總量成正比。IOD值除以目標(biāo)

5、分布區(qū)域的面積，得到平均density，此值反映了目標(biāo)物質(zhì)的單位面積濃度。對(duì)樣品照片進(jìn)行數(shù)字圖像分析比較時(shí)，就是比較它們之間的平均光密度值的大小。9 1.3比較兩張照片的染色物質(zhì)量的差別兩張照片染色深度一樣，染色面積大的質(zhì)量大照片A照片B10 比較兩張照片的染色物質(zhì)量的差別兩張照片染色區(qū)域面積相同，染色深的質(zhì)量大照片A照片B11 這回該怎么看？A的顏色深，面積小。B的顏色淺，面積大。照片A照片B12 比較體積！面積光密度13 1.4 實(shí)際圖片的情況很復(fù)雜的。陽性樣品染色深，陰性樣品染色淺。14 直接比較整張圖片的IOD等于在比較整張圖片的mean density15 哪一個(gè)染色物更多？染色區(qū)域

6、顏色接近，染色面積有差異。16 使用不同的area會(huì)得到不同的結(jié)論要結(jié)合病理情況來判斷。IOD對(duì)整張圖片的面積作平均。IOD對(duì)特定組織區(qū)域面積作平均。IOD對(duì)顯色的組織區(qū)域作平均。17 對(duì)整張圖片區(qū)域進(jìn)行平均的情況比較少18 右上角的空白應(yīng)該扣除。19 也許應(yīng)是這個(gè)特定的組織區(qū)域20 這個(gè)區(qū)域是染色的區(qū)域。往往在計(jì)算IOD時(shí)同時(shí)計(jì)算出來，但以此為平均面積往往并不正確。21 對(duì)單個(gè)細(xì)胞的分析比較單個(gè)細(xì)胞的IOD單個(gè)細(xì)胞的mean density22 邊界不清晰的貼壁細(xì)胞整張圖片IOD/細(xì)胞個(gè)數(shù)（照片中細(xì)胞數(shù)目不多，數(shù)起來不費(fèi)事）23 細(xì)胞簇的分析測量整張圖片黃色區(qū)域IOD。再測量細(xì)胞分布的區(qū)域面

7、積 area。對(duì)染成藍(lán)色的細(xì)胞核計(jì)數(shù)，作為細(xì)胞數(shù)N。以 IOD /（N * area）作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。24 2.從圖片上分析光密度方法 的技術(shù)發(fā)展簡單測量整張照片的光密度值。在照片上隨機(jī)選取數(shù)個(gè)區(qū)域，測量其光密度值。計(jì)算其平均值作為整張照片的光密度值。在照片上準(zhǔn)確選擇被染上染料的特定顏色的區(qū)域，計(jì)算這些區(qū)域的累積光密度值（IOD），進(jìn)而計(jì)算統(tǒng)計(jì)區(qū)域的平均光密度值。25 2.1測定整張照片的光密度-圖象分析儀其測定原理有點(diǎn)象分光光度計(jì)，直接測定切片的整體光密度?？梢愿鶕?jù)照片上象素點(diǎn)的亮度來區(qū)分測定區(qū)域其缺陷是顯而易見的。復(fù)染上的其他顏色的染料也會(huì)產(chǎn)生光密度吸收，導(dǎo)致嚴(yán)重的干擾。26 2.2 抽樣測

8、量光密度在彩色電子圖片上選取目標(biāo)顏色區(qū)域，抽樣測量這些小區(qū)域的灰度值，取其平均值作為比較染色深淺的指標(biāo)。隨機(jī)選取幾個(gè)區(qū)域但是能作到“隨機(jī)”嗎？27 2.3 ImagePro plus(IPP)的獨(dú)特優(yōu)勢。準(zhǔn)確地按照一個(gè)顏色標(biāo)準(zhǔn)來選取一個(gè)AOI (area of interesting ) 。測量這個(gè)區(qū)域的光密度參數(shù)。28 使用IPP比前兩種方法更好。在查到文獻(xiàn)中使用的圖象分析方法是前兩種的時(shí)候，完全可以用IPP的分析測量來代替。結(jié)果更加準(zhǔn)確。不必照搬文獻(xiàn)上所述的方法。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，以后也許還會(huì)有更好的圖象分析方法及圖象分析程序的。29 3.用IPP分析免疫組化圖片過程選取圖片上具有染料

9、色調(diào)的區(qū)域（AOI，area of interesting）。測量該區(qū)域的IOD。選擇并測量有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積計(jì)算選擇區(qū)域內(nèi)的光密度平均值IOD/area（density mean）計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)組切片各照片的平均及標(biāo)準(zhǔn)差。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各實(shí)驗(yàn)組的平均density mean之間是否有顯著性差異。30 3.1用于免疫組化半定量分析的照片拍攝與普通顯微鏡照片不同，用于免疫組化分析的顯微鏡照片有其特殊的拍攝要求。31 顯微鏡光源正確調(diào)整顯微鏡光源為日光色溫的白色光。此時(shí)是加藍(lán)色濾光片，燈絲電壓為10V左右。一般的顯微鏡上都會(huì)有指示的。此時(shí)的鏡下視野會(huì)感覺明亮得有點(diǎn)刺眼。不能通過調(diào)整光圈的方法減低亮

10、度，這會(huì)影響到圖象的清晰度。光圈與聚光鏡要按照柯勒方法調(diào)整以保證照片的清晰.不能加過大的灰度鏡減低亮度。用25%的灰度濾光片還行。6%的灰度濾光片會(huì)導(dǎo)致色彩失真。如果照明光源不白，有偏色，將直接影響到照片色彩，從而使得測量結(jié)果不準(zhǔn)確。32 固定顯微鏡的工作條件不僅是光源亮度，除了更換樣品時(shí)調(diào)節(jié)載物臺(tái)位置，其他部件一律固定下來。特別是不要來回切換使用不同放大倍數(shù)的物鏡。使用一個(gè)物鏡拍攝所有的照片后，再切換到另一個(gè)物鏡上拍攝照片。為保證顯微鏡光源的穩(wěn)定一致，所有照片應(yīng)該一次拍攝完成。不能分?jǐn)?shù)次拍攝。若能給顯微鏡加上穩(wěn)壓電源就更好了。這能保證顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定。33 應(yīng)該使用手動(dòng)控制曝光的相機(jī)對(duì)每

11、張照片要使用相同的曝光時(shí)間，而不是由相機(jī)自動(dòng)控制曝光。染色深的陽性樣品就應(yīng)該拍攝得較暗。染色淺的陰性對(duì)照樣品則應(yīng)該拍攝得較明亮。34 控制相機(jī)曝光時(shí)間要把相機(jī)曝光時(shí)間控制到使視野中空白的地方呈現(xiàn)純亮的白色。拍攝出的照片上，沒有組織的空白處的背景灰度值應(yīng)達(dá)到230左右。可以使用圖象分析軟件測量一下空白處的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易產(chǎn)生色彩的偏離，會(huì)影響到圖像分析數(shù)值的偏差。把空白灰度值調(diào)到230相當(dāng)于在分光光度計(jì)上調(diào)節(jié)100%透射。35 背景的影響左圖：暗且偏藍(lán)的背景嚴(yán)重降低了黃色的IOD值。而且影響到了陽性區(qū)域的色調(diào)。36 較暗的背景值對(duì)分析測量的影響顯著性差異無顯著性差異37

12、扣背景后依然沒有顯著性差異注意誤差線，依然沒有顯著性差異38 避免使用相機(jī)的自動(dòng)白平衡自動(dòng)白平衡功能是相機(jī)根據(jù)照片總體色彩情況自動(dòng)對(duì)每張照片進(jìn)行各自不同的白平衡校正。這會(huì)嚴(yán)重影響分析測量的準(zhǔn)確性。顯微鏡照片用一兩種染料染色，照片的色彩就應(yīng)該是不平衡的，不能校正。由于免疫組化照片上黃色染色多,自動(dòng)白平衡會(huì)將圖片色調(diào)向藍(lán)色調(diào)整,導(dǎo)致色彩的失真.39 最好使用專業(yè)CCD拍攝民用數(shù)碼相機(jī)適用于拍攝日常生活中的照片，其自動(dòng)曝光、自動(dòng)白平衡功能會(huì)有效改善照片的直觀效果。但對(duì)于顯微鏡照片，這些功能卻會(huì)改變照片的原始面貌，嚴(yán)重影響照片的分析測量結(jié)果。要想關(guān)閉這些功能，往往要進(jìn)行很復(fù)雜的設(shè)置。不使用自動(dòng)白平衡校

13、正，但可以使用手動(dòng)的白平衡校正背景色彩。對(duì)所有照片進(jìn)行統(tǒng)一的背景色彩校正。使得照片中空白的背景呈白色。40 應(yīng)當(dāng)把照片存為無損壓縮格式TIFF特別是對(duì)于染色較淺的圖片，保存為jpeg格式后會(huì)損失亮度細(xì)節(jié)，導(dǎo)致測量誤差增大。要注意相機(jī)上直接保存為jpeg的圖片就沒必要轉(zhuǎn)成TIFF了.注意那些馬賽克41 總結(jié)拍攝注意事項(xiàng)：調(diào)整顯微鏡光源亮度，足夠白，足夠亮。調(diào)整相機(jī)曝光時(shí)間，使背景呈現(xiàn)白色?；叶戎底詈媚苓_(dá)到230以上。確認(rèn)相機(jī)未使用自動(dòng)白平衡功能。但可以使用手動(dòng)校正白平衡功能校正背景色彩為純白色。使用同樣的顯微鏡工作條件與相機(jī)工作條件一次拍攝完所有照片。保存照片為TIFF格式。42 3.2用Ima

14、ge-pro plus分析免疫組化圖片與photoshop不同，image-pro plus是一個(gè)圖片分析測量軟件。IPP的功能不是用來美化圖片，如果照片效果不好或分析結(jié)果不理想，要從切片處理與拍攝過程上找原因，而不應(yīng)試圖通過對(duì)圖片的修飾與處理來解決問題。通過IPP的分析測量只應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確地反映圖片本身的真實(shí)測量數(shù)據(jù)。43 3.2.1開始使用IPPIPP的程序界面是典型的windows風(fēng)格。它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。進(jìn)入IPP后的第一件事就是打開一幅待分析的圖片。44 45 將分析圖片信息保存到數(shù)據(jù)庫中在程序中保存分析圖片過程信息是保存實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的基本原則，必須遵守。

15、將圖片信息及圖片分析過程及分析的信息存入IPP程序數(shù)據(jù)庫是一種保存實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的操作。要注意對(duì)同一張圖片進(jìn)行同樣的操作，由于一些手動(dòng)的操作無法準(zhǔn)確地重復(fù)，所以會(huì)出現(xiàn)兩次同樣的測量得到有差異的結(jié)果的情況。這也是保存測量結(jié)果的理由之一。46 3.2.2.設(shè)置并保存測量條件設(shè)置光密度校正設(shè)置測量項(xiàng)目.設(shè)置分色選擇參數(shù)47 3.2.2.1光密度校正方法48 49 50 51 校正光密度步驟小結(jié).1.調(diào)出intensity carliberation窗口,點(diǎn)New按紐建立一個(gè)新的校正.2.選擇std option density,此時(shí)可見到反向的校正曲線.3.選擇背景空白值對(duì)應(yīng)的灰度.相當(dāng)于分光光度計(jì)中

16、的調(diào)整100%透射.4.選擇此校正為system carliberation,使之能應(yīng)用于所有照片.52 3.2.2.2選擇測量參數(shù)需要測量選擇區(qū)域的面積(area)與累積光密度(IOD).在測量選項(xiàng)中也有平均光密度這一項(xiàng),但它不適用于當(dāng)前的測量,不能選用.選擇面積時(shí)一般要設(shè)置一個(gè)過濾值,忽略掉面積過小的點(diǎn),一般可設(shè)置為最小20象素.還要設(shè)置一下測量的顯示選項(xiàng)(option),一般是選擇顯示選擇區(qū)域填充紅色.還有一些其他的設(shè)置.53 選擇測量參數(shù)在分析免疫組化圖象時(shí),一般是測量選定的具有特定顏色的區(qū)域的面積與累積光密度(IOD)對(duì)免疫組化的顯微照片,一般應(yīng)分析它的平均光密度.即時(shí)IOD/are

17、a.根據(jù)圖象的特點(diǎn),要分別測量選擇區(qū)域的IOD及area.對(duì)不同的組織照片，要使用不同的測量指標(biāo)來進(jìn)行比較。54 在count/size里進(jìn)行這些設(shè)置55 調(diào)出的select Measurements,56 Option設(shè)置窗口57 保存設(shè)置:file save settings58 3.2.2.3選取特定顏色所在的區(qū)域一般免疫組化樣品中黃色的地方為陽性染色區(qū)域。在測量時(shí)應(yīng)當(dāng)測量這些黃色（棕黃色）區(qū)域的光密度值。不測量其他顏色部分的。因此首要的任務(wù)就是把這些黃色的區(qū)域挑選出來。IPP是利用圖片上象素點(diǎn)的顏色分類來選取測量區(qū)域的。其選擇工具irregular AOI與segmentation是I

18、PP最有特色，最有效的工具。59 用IPP選取特定顏色區(qū)域的工具選擇特定顏色的區(qū)域是IPP最有特色的功能，按照特定的顏色特征選取圖象中的特定區(qū)域，并計(jì)算這些區(qū)域的面積等幾何尺寸與光密度數(shù)據(jù)，就是IPP分析圖像工作的中心任務(wù)。Irregular AOI:適用于選擇有明顯顏色邊界的單個(gè)顏色區(qū)域。Segmentation：適用于選取整張圖片中具有特定顏色的所有區(qū)域。測量免疫組化圖片一般使用這個(gè)工具。60 在count/size窗口中點(diǎn)select color,就調(diào)出了這個(gè)segmentation工具.61 點(diǎn)Histogram Based,還要選HIS.62 在彈出的警告上點(diǎn)“是”。63 H：0-3

19、0，S：0-255，I：0-23064 設(shè)置好的選色條件也要保存的。65 測量光密度時(shí)，要測量灰度圖片彩色圖象上象點(diǎn)的強(qiáng)度是由紅藍(lán)綠三色混合而成，如果直接在彩色圖上測量光密度，會(huì)有一個(gè)系統(tǒng)誤差。所以正規(guī)的測量需要把圖象中選取的區(qū)域外部分涂白，然后轉(zhuǎn)換圖象為灰度圖片，再測量光密度。66 選擇Transparent on White，只顯示選擇到的區(qū)域。再點(diǎn)create preview image復(fù)制出一張。67 將復(fù)制的圖片轉(zhuǎn)換成灰度圖片。68 對(duì)此圖片再作一次選色，這次只需選擇一個(gè)強(qiáng)度了。I：0-23069 70 還要保存一次灰度選色設(shè)置。71 3.2.2.4 好啦，點(diǎn)count進(jìn)行測量。72