《細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)》課件細(xì)胞培養(yǎng)

1、原代培養(yǎng)步驟胎大鼠浸75%酒精置大平皿內(nèi)消毒背部皮膚取腎臟放小平皿內(nèi)PBS洗2次剪碎后移入4ml離心管PBS洗2次（洗到組織塊發(fā)白，洗去血細(xì)胞）靜置10分鐘棄上清加消化液1ml手握消化10分鐘靜置棄上清加培養(yǎng)液2ml吹打混勻 移入培養(yǎng)皿二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng) 結(jié) 果ERaMTA1DAPIMerge胎鼠腎臟原代培養(yǎng)72 h 傳代培養(yǎng)步驟 HeLa細(xì)胞棄上清加1-2ml消化液 倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間連接打開 棄上清，加10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液 分裝2個培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)皿），放二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng) 無菌操作中的注意事項1.操作前認(rèn)真洗手并用75%乙醇消毒2.操作前20-30分鐘啟動超凈

2、臺紫外消毒燈。3.操作時，嚴(yán)禁說話，嚴(yán)禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等。4.培養(yǎng)瓶要在超凈臺內(nèi)才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內(nèi)完成。5.操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。無菌操作中的注意事項6.使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將尖端在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體。7.整個無菌操作過程都應(yīng)該在酒精燈的周圍進行。8.禁止雙手交叉取物。 9.手臂禁止從開口的瓶口上方經(jīng)過。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1.了解凍存與復(fù)蘇的原理2.熟悉細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的方法步驟實驗?zāi)康?緩慢凍

3、存與快速復(fù)蘇 當(dāng)細(xì)胞冷到0以下，可以產(chǎn)生以下變化，細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，加入保護劑后細(xì)胞內(nèi)的水分在凍結(jié)前滲出到細(xì)胞外，避免冰晶損傷。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇的原則 在細(xì)胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。 常用低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑。 凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基和10%DMSO（或10%甘油）低溫保護劑的應(yīng)用的 1.選對數(shù)生長期細(xì)胞，凍存細(xì)胞前24小時換液，按傳代方式制成細(xì)胞懸液。2.收集細(xì)胞，1000rpm，離心5分鐘，去上清。3.加凍存液1-1.5ml，輕輕吹打使細(xì)胞混懸，移入凍存管，擰緊蓋4.標(biāo)記

4、好名稱、日期。5.放入細(xì)胞凍存器里，置-80冰箱，長期保存在液氮中。細(xì)胞凍存 4.標(biāo)記好名稱、日期。5.放入細(xì)胞凍存盒里，置-80冰箱，長期保存在液氮中。細(xì)胞凍存 1.從液氮中取出凍存管，迅速投入37-42水浴中，使其融化。2.在超凈工作臺內(nèi)，吸出細(xì)胞懸液裝入培養(yǎng)瓶中，并以10稀釋，放CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液。細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計數(shù)1.了解培養(yǎng)中的動物細(xì)胞的一般形態(tài)和生長狀態(tài)2.掌握細(xì)胞計數(shù)的基本方法實驗?zāi)康?（一）.貼壁生長型細(xì)胞 必須貼服在培養(yǎng)支持物上才能生長的細(xì)胞，從 形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型和成纖維細(xì)胞型。（二）.懸浮生長型細(xì)胞 不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長

5、。培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型 貼壁型細(xì)胞ERaMTA1DAPIMerge上皮細(xì)胞型細(xì)胞成纖維細(xì)胞型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞（HL-60）ERaMTA1DAPIMerge ERaMTA1DAPIMerge細(xì)胞生長狀態(tài)良好：細(xì)胞質(zhì)均勻透明，顆粒少，沒空泡培養(yǎng)液清澈透明，看不到懸浮的細(xì)胞和碎片 細(xì)胞污染1.準(zhǔn)備計數(shù)板 將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上備用。 細(xì)胞計數(shù)步驟2.制備細(xì)胞懸液 以傳代的方式制備細(xì)胞懸液3.染色 取細(xì)胞懸液0.5ml,加入0.3%臺盼蘭0.5ml，混合 后染色3分鐘。4.滴加懸液 將染色后的細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣。 細(xì)胞計數(shù)步驟5.計數(shù) 10倍物鏡下觀察，計算計