熒光定量PCR技術(shù)專題

1、TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD熒光定量PCR技術(shù)專題市場部 江 波 2021年3月廣州內(nèi)容概要 熒光定量PCR的原理 熒光定量PCR的標(biāo)記方法 熒光定量PCR解析方法 SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南實(shí)時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反響中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī) PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反響的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反響實(shí)時檢測熒光定量PCR原理定義 擴(kuò)增曲線 熒光閾值 Ct值熒光定量PCR原理常用名詞

2、概念Cycle循環(huán)數(shù)Rn熒光強(qiáng)度BaselineLogliner phaseLogliner phase熒光基團(tuán)熒光檢測元件熒光定量PCR原理擴(kuò)增曲線Cycle循環(huán)數(shù)Rn熒光強(qiáng)度BaselineLogliner phaseLogliner phase 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號baseline 熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段 真正的信號:熒光信號超過域值Threshold熒光定量PCR原理熒光域值Ct值的定義： PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Cyc

3、le循環(huán)數(shù)Rn熒光強(qiáng)度Ct value 熒光定量PCR原理Ct值Cycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentration 模板DNA量越多，熒光到達(dá)域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。 Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理Ct值與模板起始量的關(guān)系線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)No template control確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率E35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增35 Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)r2：大于熒光定量PCR反響性確實(shí)認(rèn) 定性分析研究

4、：雜合或純合子鑒定，SNPs分析等 絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量， GMO定量檢測等 相對定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，基因芯片結(jié)果驗(yàn)證，差異顯示結(jié)果驗(yàn)證等熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用內(nèi)容概要 熒光定量PCR的原理 熒光定量PCR的標(biāo)記方法 熒光定量PCR的解析方法 SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知 TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南非特異性熒光標(biāo)記 SYBR Green I特異性熒光標(biāo)記 TaqMan Probe常用熒光標(biāo)記方法SYBR Green I染料法原理 SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。S

5、YBR Green I熱 變 性引物退火延伸反響SYBR Green I染料法作用機(jī)理問題點(diǎn)： SYBR Green I與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如 果反響體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將 同時被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。SYBR Green I染料法問題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)： 設(shè)計(jì)適宜引物，防止非特異性擴(kuò)增！將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo) (-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜SYBR Green I染料法融解曲線融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確SYBR Green I染料法融解曲線 對DNA模板沒有選擇

6、性 適用于任何DNA 使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜 探針 具有價格優(yōu)勢優(yōu) 點(diǎn) 容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反響條件 對引物特異性要求較高 不能進(jìn)行多重定量缺 點(diǎn)SYBR Green I染料法優(yōu)缺點(diǎn)Taqman探針法原理 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) 探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針Taqman探針法工作機(jī)理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR

7、1、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物Tm為59-60 2、反響參數(shù)確實(shí)定： 一般為：94 ，10-20S 60，30-60STaq酶53外切核酸酶活性在60 最高，也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法PCR體系的建立3淬滅基團(tuán)淬滅基團(tuán)性質(zhì)建議使用的5報(bào)告基團(tuán)TAMRA熒光物質(zhì)FAM, HEX, TET, JOE等Eclipse非熒光物質(zhì)FAM,

8、 HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX等Taqman探針法熒光標(biāo)記物的選擇 高度特異性 重復(fù)性好 可進(jìn)行多重定量優(yōu) 點(diǎn) 只適合一個特定的目標(biāo) 委托公司標(biāo)記，價格較高 不易找到本底低的探針缺 點(diǎn)Taqman探針法優(yōu)缺點(diǎn)不同定量方法的比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBR Green I 方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶不能進(jìn)行多重定量適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究TaqMan 方法特異性高重復(fù)性好多重定量價格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷內(nèi)容概要 熒光定量PCR原理 熒光定量PCR的標(biāo)

9、記方法 熒光定量PCR的解析方法 SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知 TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南絕對定量解析方法Sample25絕對定量的定義 Log起始濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品 可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反響存在的線性關(guān)系 根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備PCR目的基因克隆質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA拷貝數(shù)的計(jì)算：待測樣本濃度ng/ulOD26040稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)324待測樣本拷貝數(shù)copies/ul=待測樣本濃度/樣本分子量61014倍比梯度稀釋方法

10、：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算 方 法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進(jìn)行熒光定量檢測 試 劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMixProbe目錄號：FP203 標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105 、104 、 103 ；2個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照 實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBV DNA； 設(shè)計(jì)特異引物； 設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針； 熒光定量擴(kuò)增； 結(jié)果分析：獲取血液樣品中H

11、BV DNA的精確copy數(shù)。絕對定量實(shí)驗(yàn)例乙肝病人血液中HBV的絕對定量Samplecopies/mlCt1Ct2Mean CtSTD標(biāo)準(zhǔn)品510328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品510425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品510522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品510618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)絕對定量實(shí)驗(yàn)例乙肝病人血液中HBV的絕對定量擴(kuò)增效率E計(jì)算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 1 1.03 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用Mean Ct 作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線

12、y = -3.17x + 37.52 R2絕對定量實(shí)驗(yàn)例乙肝病人血液中HBV的絕對定量 相關(guān)系數(shù)R2：大于，越接近1，結(jié)果可信度越高。 擴(kuò)增效率E：0.8-1.2, 越接近1，越理想。 未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將Ct值帶入線性方程：QuantityUnknown=10 =229087 copies 絕對定量實(shí)驗(yàn)例乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-37.52-3.1726=5.36相對定量解析方法理論上目的基因表達(dá)量分析條件Sample BSample A目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同實(shí)際目的基因表達(dá)量分析相對定量的必要性以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因管

13、家基因進(jìn)行校正，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。管家基因 維持細(xì)胞根本代謝活動所必須的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等篩選方法 根據(jù)文獻(xiàn)提供 通過具體實(shí)驗(yàn)篩選相對定量分析管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值-ActinGAPDH-2-microglobulinHPRTP P P O 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2 -Ct法 相對定量分析兩種常用的分析方法 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對值即為相對表達(dá)量。 相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相

14、對定量分析雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對簡單缺點(diǎn)：對每一個基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一相對定量分析雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測樣品管家基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)公式：F =2相對定量分析2 法優(yōu)點(diǎn)：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為 100 %； 假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致； 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與

15、公認(rèn)的兩種相對定量方法之一 待測組目的基因平均Ct值待測組管家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組管家基因平均Ct值Ct實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample 處理前 處理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E1816172 - Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%Ct處理前18171 Ct處理后1617.4=Ct=Ct處理后Ct處理前1比率處理后/處理前=2Ct2 = 5.3 所以Jun基因在處理后表達(dá)水平比處理前高倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2Ct可以修正為：ECt，例如擴(kuò)增效率為，那么計(jì)算公式可修正為Ct相對

16、定量分析2 -Ct法內(nèi)容概要 熒光定量PCR的原理 熒光定量PCR的標(biāo)記方法 熒光定量PCR的解析方法 SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知 TIANGEN公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知樣品制備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)反響條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反響體系優(yōu)化試劑選擇分析方法樣品制備環(huán)境要求模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具高純度，濃度均一的RNA分光光度計(jì)檢測電泳檢測RT反響體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析上機(jī)AMVM-MLVQuantSuper下游反應(yīng)數(shù)

17、確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物高效、全長的cDNASYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間評價引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（3次）設(shè)置空白和陰性對照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC：5060Tm：5065單個堿基重復(fù)4個無二級結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長度：100200bp反響體系優(yōu)化上機(jī)反響條件優(yōu)化RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積5ul，推薦2050ulMg2調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產(chǎn)物長度決定擴(kuò)增效率：90110重復(fù)性：std0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R0.99或R2 0

18、.98SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知標(biāo)準(zhǔn)品待測樣本陽性對照陰性對照技能要求誤差控制儀器介紹上機(jī)試劑選擇RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7seriesBioerLinegene series分裝控制內(nèi)參控制機(jī)器校正控制平滑曲線，重復(fù)性好，靈敏度高SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知Rotor-gene6000 MiniOpticon Mx3005PTM LINE-GENE FQD-66A ABI PRISM 7500 iQ5 Real-Time PCR Detection System 數(shù)據(jù)分析儀器介紹分析方法上機(jī)RT樣品制備模板準(zhǔn)備相對定量：2Ct法絕對定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法可靠，準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要 熒光定量PCR的原理 熒光定量PCR的標(biāo)記方法 熒光定量PCR的解析方法 SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知 TIANGEN公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品SYB