1.31老師動(dòng)植物學(xué)實(shí)驗(yàn)biological experiments

1、Biological experiments Ma WeiyuanDepartments of Dermatology Qilu Hospital of Shandong UniversityE-mail： 實(shí) 驗(yàn) 一 顯微鏡與解剖鏡（一）顯微鏡的成像原理1.顯微鏡的光學(xué)原理2.顯微鏡的照明原理（1）臨界照明（2）柯拉照明顯微鏡的光學(xué)原理 顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，有兩組重要的透鏡，一組是接物鏡，一組是接目鏡。這兩組透鏡雖然結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，但它們的作用都相當(dāng)于一個(gè)凸透鏡。凸鏡的成像原理，也就是顯微鏡放大成像的光學(xué)原理。只不過是通過兩次放大而已，其成像原理和光路圖如圖所示。 被檢物AB放在物鏡 下方的一倍

2、焦距之間，則在物鏡 后方形成一個(gè)倒立得放大實(shí)像，這個(gè)實(shí)像正好位于目鏡的下焦點(diǎn)之內(nèi)，通過目鏡后形成一個(gè)放大的虛像,這個(gè)虛像通過調(diào)焦裝置使其落在眼睛明視距處，即 25cm ，使所看到的物體最清晰，也就是虛像是在眼睛晶狀體的兩倍焦距之外，在眼球后的視網(wǎng)膜形成一個(gè)倒立的縮小像.（二） 顯微鏡的類型 電子顯微鏡使用電子束作光源的一類顯微鏡,以特殊的電極和磁極作為透鏡代替玻璃透鏡,能分辨相距0.2左右的物體放大倍數(shù)可80-120萬倍 光學(xué)顯微鏡以可見光作為光源,用玻璃制作透鏡的顯微鏡.其有效放大倍數(shù)可達(dá)1250倍,最高分辨力為0.2微米.顯微鏡可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡 光學(xué)顯微鏡可分為單式顯微鏡和復(fù)式

3、顯微鏡。 單式顯微鏡結(jié)構(gòu)簡單,擴(kuò)大的是方向一致的 虛像。 復(fù)式顯微鏡結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,放大倍數(shù)較高,包括普通生物顯微鏡, 暗視野顯微鏡, 相差顯微鏡, 熒光顯微鏡等。光學(xué)顯微鏡單筒復(fù)式普通生物顯微鏡雙筒復(fù)式普通生物顯微鏡10X4 低倍觀察10X10 中倍觀察10X40 高倍觀察10X100 油鏡 普通生物顯微鏡的放大倍數(shù) 物鏡是決定顯微鏡質(zhì)量好壞的重要部件,放大倍數(shù)有10,40,油鏡100倍,目鏡放大倍數(shù)有5,10,16倍. 暗視野顯微鏡特點(diǎn)是該顯微鏡具有暗視野聚光器，使光線不直接進(jìn)人物鏡，故呈暗視野。暗視野 Dark field microscope 根據(jù)Tyndall效應(yīng)原理設(shè)計(jì)， 在黑背景下

4、觀察物體的外部細(xì)節(jié)，分辨率高該顯微鏡適用于觀察細(xì)胞內(nèi)微小顆粒，例如線粒體、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)等。 熒光顯微鏡是用以觀察細(xì)胞及組織內(nèi)熒光物質(zhì)的分布。它是裝有、能產(chǎn)生紫外線（短波長）的光源及系列濾片裝置的顯微鏡。： 相差顯微鏡的特點(diǎn)裝有不同大小環(huán)狀光闌的聚光器。物鏡內(nèi)裝有位相板。中心望遠(yuǎn)鏡裝置。相差顯微鏡的基本原理是通過上述裝置。把透過標(biāo)本的可見光的相位差變成振幅 差，從而提高了標(biāo)本內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間的對比度，使標(biāo)本中的結(jié)構(gòu)清晰可辨。 使用電子束作光源的年一類顯微鏡,以特殊的電極和磁極作為透鏡代替玻璃透鏡,能分辨相距0.2左右的物體放大倍數(shù)可80-120萬倍。 透射電鏡是以電子束透過樣品經(jīng)過聚焦與放大后所產(chǎn)生的

5、物像， 投射到熒光屏上或照相底片上進(jìn)行觀察。透射電鏡的分辨率為0.10.2nm，放大倍數(shù)為幾萬幾十萬倍。 掃描電鏡是用極細(xì)的電子束在樣品表面掃描，將產(chǎn)生的二次電子用特制的探測器收集，形成電信號運(yùn)送到顯像管，在熒光屏上顯示物體。（細(xì)胞、組織）表面的立體構(gòu)像，可攝制成照片。電子顯微鏡透射電鏡（三） 顯微鏡的構(gòu)造 顯微鏡的基本構(gòu)造包括兩大部分,光學(xué)系統(tǒng)和機(jī)械系統(tǒng),機(jī)械系統(tǒng)有鏡座,鏡柱,鏡壁,鏡筒,物鏡轉(zhuǎn)換器,載物臺,調(diào)焦螺旋,聚光器調(diào)節(jié)螺旋.光學(xué)系統(tǒng)有物鏡,目鏡,反光鏡,聚光器,虹彩光圈.（四） 使用顯微鏡的主要步驟和方法1、低倍鏡觀察2、高倍鏡的使用3、油鏡的使用4、顯微鏡使用后整理1、低倍鏡觀察

6、（1）對光和放置切片（2）調(diào)焦 （3）低倍觀察:將需觀察的材料放到最有利的位置上,根據(jù)材料的顏色厚薄,成像反差再調(diào)節(jié),如:視野太亮可下降聚光器或調(diào)小光圈.2、高倍鏡的使用 （1）選取目標(biāo):用低倍鏡選取目標(biāo),并移至視野中央,換上高倍鏡. （2）調(diào)整焦點(diǎn):換上高倍鏡后視野中即有模糊圖象,調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使圖象清晰 （3）調(diào)節(jié)亮度,因高倍鏡視野較暗需升高聚光器,或放大光圈3、油鏡的使用（1）先從低倍油鏡找到被檢部分后,再換高倍鏡調(diào)整焦點(diǎn),然后再換用油浸鏡頭.（2）在換用油鏡前在蓋玻片上滴加一滴香波油，在油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)焦點(diǎn)。（3）油鏡使用完畢，需立即擦凈，擦拭方法是用棉棒或擦鏡紙蘸少許

7、清潔劑（乙醇或無水酒精的混合物，最好不用二甲苯，以免侵入鏡頭后使樹膠溶化，透鏡松散）4、顯微鏡使用后整理 觀察完畢升高鏡筒取下玻片，再轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使兩個(gè)物鏡位于載物臺上通光孔的兩側(cè)，罩上防塵罩。（五）顯微鏡的放大率1.顯微鏡總放大率=物鏡的放大倍數(shù)目鏡的放大倍數(shù) 2.顯微鏡的分辨力是主要由鏡口率決定 物鏡的有效鏡口率 =(物鏡鏡口率+聚光器鏡口率)/23.目鏡光欄所圍繞的圓即視野寬度,視野寬度與放大率成反比 . （六）顯微測微尺的使用臺式測微尺目鏡測微尺 1. 將目鏡測量尺（目尺）刻度向下裝在目鏡內(nèi)。將鏡臺測量尺（臺尺）安置在載物臺上，調(diào)焦使臺尺上的標(biāo)尺分度清晰。使臺尺與目尺上的標(biāo)尺在“0

8、”刻度上對齊。 目鏡測微尺的格植(微米)=兩重合線間 臺式測微尺的格數(shù)10微米 目鏡測微尺的格數(shù) 2.將臺尺取下?lián)Q上待測標(biāo)本，觀察所測物體所占目標(biāo)尺的格數(shù)，再乘以目標(biāo)尺上每格的長度，即為被測物體的長度。 臺式測微尺一種特制的載玻片，具帶刻度的標(biāo)尺長1mm 分100小格。每格0.01mm 即10微米 實(shí) 驗(yàn) 二 玻片標(biāo)本的制作技術(shù) 生物體大部分都是不透明的，因此在光學(xué)顯微鏡下不能直接觀察。我們需要利用各種方法對生物體進(jìn)行處理，將其制成使光線能夠透過的制片。根據(jù)制片標(biāo)本可保存的時(shí)間長短通常將其分為臨時(shí)制片和永久制片兩大類型。臨時(shí)裝片只能用于短暫的觀察，無法長期保存，且其制片的厚度較大，觀察效果不佳

9、。永久制片厚度較薄，便于觀察且可長期保存，但制作步驟繁雜。 臨時(shí)玻片標(biāo)本的制作是使用顯微鏡觀察生物材料時(shí)最基本的技術(shù)，代表是洋蔥鱗莖表皮和口腔黏膜上皮?，F(xiàn)以洋蔥鱗莖表皮為實(shí)驗(yàn)材料來介紹臨時(shí)裝片的制作方法： （一） 裝片法2、實(shí)驗(yàn)過程 1、材料與儀器 （1）雙面刀片、鑷子、毛筆、培養(yǎng)皿、滴 瓶、載玻片蓋玻片、軟布 （2）洋蔥鱗莖 1、取載玻片和蓋玻片用軟布擦凈 2、用滴管滴1-2滴清水，滴在載玻片中央。 3、用刀片在洋蔥鱗莖外表皮或內(nèi)表皮劃一“井”字，再用鑷子撕取“井”字中央的表皮，并將其平展與載玻片的小水滴中。 4、用鑷子夾取一片干凈的蓋玻片，先以蓋玻片的一邊斜著與小水滴接觸，再慢慢放下蓋玻片

10、。 5、制作好的標(biāo)本要求水分充滿，當(dāng)水分不足時(shí)，可用滴管從蓋玻片一側(cè)的邊緣滴少許水分，再另一側(cè)用吸水紙吸 6、臨時(shí)裝片標(biāo)本如需短期保存，可滴入10%甘油水溶液，并放在培養(yǎng)皿中，上加蓋子，減少蒸發(fā)；如需長期保存，則應(yīng)通過固定、染色、脫水、透明、加拿大樹膠封藏等步驟制成永久玻片標(biāo)本。 實(shí)驗(yàn)過程 徒手切片法是指用手拿刀片和材料，并將材料切成玻片標(biāo)本的一種切片方法。本方法較為古老且存在一定的局限性，但由于方法簡單，容易掌握，省時(shí)方便，因此仍是觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)的一種基本切片方法。 1、材料與器具 雙面刀片、毛筆、培養(yǎng)皿滴瓶、馬鈴薯塊莖、 新鮮植物材料 2、實(shí)驗(yàn)過程（二） 徒手切片法 1、取材 用刀片將材料切

11、成2-3cm長的小段，并使材料的上端截面平整。適合徒手切片的材料：各種植物的葉片（丁香、薔薇、女貞、夾竹桃、海棠、蠶豆等）、柔嫩的植物莖（楊柳、南瓜、玉米、薔薇、梧桐等）。夾持物：對于特別柔軟的材料，可以使用夾持物輔助，常用的夾持物有白蘿卜根、馬鈴薯塊莖等。 實(shí)驗(yàn)過程2、切片 徒手切片時(shí)最重要的是，切下一小片平而薄的組織結(jié)構(gòu)。（1）、左手拇指食指及中指夾住材料，拇指要略 低于食指并使材料稍稍突出于手指之上約3mm。（2）、用右手拇指和食指橫向平握刀片，置于左手食指之上，刀口向內(nèi)，與材料的縱軸垂直。（3）、切片時(shí)現(xiàn)在材料和刀口蘸些水，并使材料和、裝片都保持在水平位置，再用臂力進(jìn)行連續(xù)切片每當(dāng)切下

12、數(shù)薄片時(shí)，即用毛筆蘸水，將切好的薄片撥到培養(yǎng)皿中。3、裝片 從切好的材料中，用毛筆挑出完整的、薄的、切面正的切片制成臨時(shí)水裝玻片標(biāo)本，染色后放置在顯微鏡下觀察。（三） 涂片法 涂片法就是利用涂布的方法制成玻片標(biāo)本，是一種將游離的細(xì)胞、動(dòng)植物組織中比較疏松的組織均勻的涂布在載玻片上的一種制片方法。 適合涂片的材料：單細(xì)胞生物、小型群體藻類、血液、細(xì)菌培養(yǎng)液、花藥、精巢等涂片法步驟：（1）將液體滴在載玻片的中間偏右1/4處。（2）涂抹法：用牙簽、解剖針、解剖刀等將液滴涂抹均勻。（3）載玻片法：另取一載玻片，將液滴夾在中間，兩片間呈3045度夾角，緩慢、用力均勻、勻速的輕輕推動(dòng)。（4）固定：動(dòng)植物可

13、選用化學(xué)固定劑、細(xì)菌可選用干燥固定。（5）染色：細(xì)菌用亞甲基藍(lán)、革蘭氏染液、吉姆薩染液等，血液用瑞氏染色（6）沖洗（7）封片涂片的注意事項(xiàng)：1、載玻片必須清潔（重鉻酸鉀濃硫酸洗液）2、載玻片必須放置水平3、涂片過程中需要?jiǎng)蛩?、等力、緩?、固定時(shí)間（動(dòng)植物）與溫度（細(xì)菌）需嚴(yán)格掌握5、染色需染料蓋過所有組織、細(xì)胞（四）磨片法 主要用于珊瑚骨骼、軟體動(dòng)物外殼、脊椎動(dòng)物硬骨、人體牙齒玻片標(biāo)本的制作，工藝較為復(fù)雜，耗時(shí)較長，奧賽實(shí)驗(yàn)不會涉及。 去除肌肉脫脂鋸材磨薄水洗脫脂干燥封片（五）壓片法 壓片法是將植物或動(dòng)物中比較疏松的材料，用較小的力量壓碎在載玻片上使之成為一層薄膜的制片方法，細(xì)胞學(xué)上較為常用

14、。本法中常用醋酸洋紅作為染料。 適合壓片法的材料：花藥、根尖、水螅、蠕蟲的精巢、果蠅的唾液腺壓片法的步驟：（1）取材（2）染色：醋酸洋紅兼有殺生、固定、染色三重作用（3）壓碎（4）干燥（5）脫色：45%醋酸（6）觀察（六）懸滴法、分離法 懸滴法是將培養(yǎng)在載玻片上溶液里的或材料（如變形蟲、細(xì)菌、萌發(fā)的花粉）封閉在載玻片的小室里，共活體觀察的一種玻片標(biāo)本。 分離法是借助某些藥液的作用，將組織間的一些粘附物質(zhì)解離后，經(jīng)過制成梳理后的制成的玻片標(biāo)本，可用于導(dǎo)管、肌纖維的顯微觀察。（七）石蠟制片法1、材料與器具： （1）解剖刀、解剖針、鑷子、培養(yǎng)皿、吸管、恒溫箱、酒精燈、面盆、紙盒、切片機(jī)、毛筆、蠟帶盤

15、、載玻片、蓋玻片、水浴鍋、染色缸、展片臺、樹膠瓶、顯微鏡、真空泵、烤片架。 （2）酒精、二甲苯、冰醋酸、福爾馬林、石蠟、番紅、固綠、HE染料（蘇木素伊紅）、中性樹膠或加拿大樹膠。 （3）動(dòng)、植物材料石蠟制片法的基本步驟： 固定洗凈脫水透明浸蠟包埋切片粘片脫蠟染色去水封固7.1 取材 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮、準(zhǔn)確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。 所采集材料應(yīng)立即放入固定劑，并編號，注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當(dāng)，即要能說明問題，又要考慮固定劑的穿透能力。 一般組織學(xué)取材稍大，細(xì)胞學(xué)取材稍小，植物組織取材稍小，動(dòng)物組織取材要稍大。7.1.1動(dòng)

16、物的麻醉和殺死 從活的動(dòng)物體上采取材料不象采集植物材料那么容易，因?yàn)樵诓皇┘勇樽淼那闆r下，有的動(dòng)物會收縮(如蚯蚓、水蛭)，有的會騷動(dòng)(如蛙、鼠)，使我們無法下手。但制片所需的材料又要求越新鮮越好，尤其是細(xì)胞學(xué)方面的研究對材料的新鮮程度要求更嚴(yán)。因此，要割取生活著的動(dòng)物組織，在一般情況下，就要對動(dòng)物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉藥品，必須以不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)為原則。 若是一般的組織學(xué)制片，要求不太嚴(yán)格的話則可將動(dòng)物先殺死然后速取其組織進(jìn)行固定。蛙、蟾蜍、鼠等較小的動(dòng)物，可用斷頭法殺死，即用普通剪刀剪斷頸部。較大的動(dòng)物，如大竺鼠、免、貓等可用木槌猛擊頭后部，使其昏倒，或用50m1的

17、注射器從耳靜脈向心臟注入空氣，使動(dòng)物發(fā)生急性空氣栓塞痙攣而死。 上述動(dòng)物若需麻醉后取材，則可用脫脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于動(dòng)物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大動(dòng)物(狗、猴等)應(yīng)用氨基甲酸乙酯作靜脈注射麻醉劑量一般為每kg動(dòng)物體重用1 g。麻醉后的動(dòng)物也需放血后進(jìn)行取材固定。 昆蟲等小動(dòng)物可投入充滿氯仿或乙醚蒸氣的大口瓶中，令其麻醉。若要?dú)⑺?，可將其投入含氰化鉀的毒瓶中?7.1.2動(dòng)物組織塊的切割 割取動(dòng)物組織塊時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)： 第一，要考慮所取的材料應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)或全部結(jié)構(gòu)，如消化管就應(yīng)包括粘膜、粘膜下層、肌層和外膜四層結(jié)構(gòu)。若所取的器官太大，不易全部制片時(shí)，則可切取能代表該器官的部分材

18、料，如狗的腎臟，可切取包括皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂的一部分為材料。 第二，應(yīng)注意切割方向如在管狀器官(腸等)取材時(shí)，一般是取其橫切面制片，但要觀察小腸的環(huán)行皺壁時(shí)，就應(yīng)取其縱切面制片。 第三，組織塊必須切得小而薄。細(xì)胞學(xué)制片的組織塊不能超過2mm，一般組織塊的大小以0.5*0.5*0.2cm為宜，柔軟組織不易切小,可先取稍大的組織塊固定2 - 3h。等組織稍硬后再切成薄的小塊繼續(xù)固定。7.2固定 割取組織塊后，應(yīng)立即進(jìn)行固定。 固定是制片極為關(guān)鍵的一個(gè)步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣。除與材料的新鮮程度有關(guān)外，還取決于最初的固定是否適當(dāng)和完全。 7.2.1固定的意義 新鮮的組織被割取后,由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用和細(xì)菌的

19、繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應(yīng)立即采用一 種方法將組織盡可能保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且有利于保存和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。固定的目的和作用在于：防止組織自溶和腐敗；使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來從而保存細(xì)胞的各種組成成分使其保持與生活時(shí)相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；因沉淀及凝固的關(guān)系，使細(xì)胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學(xué)上的差別使原來在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細(xì)胞各部易于染色；固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，有利于操作。 7.2.2固定的方法 固定有物理方法和化學(xué)方法兩種

20、。 物理方法固定有干燥、高熱和低溫騾冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；細(xì)菌涂片可用加熱法固定；許多組織化學(xué)反應(yīng)的制片是以低溫騾冷固定作冰凍切片的。 化學(xué)方法固定就是用化學(xué)試劑配制成固定液使之固定。 7.2.3固定液的選擇 固定液的種類很多。可分為兩大類：簡單固定液和混合固定液。 簡單固定液又稱單純固定液，就是用一種化學(xué)試劑作為固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它們只是對細(xì)胞的某種成分固定得較好；不能將細(xì)胞所有的成分都保存下來。如升汞固定蛋白質(zhì)、冰醋酸固定核蛋白、無水乙醇可固定糖原等，單純固定液是有局限性的。 混合固定液就是用幾種化學(xué)藥品，按一定的比例混合配制而成的，由于各種藥品的優(yōu)缺點(diǎn)互相彌

21、補(bǔ)，因此可產(chǎn)生較好的效果。7.2.4常用的固定液福爾馬林醋酸酒精混合固定液（FAA液） 是植物制片技術(shù)中較為良好的固定液和保存液。除單細(xì)胞和絲狀藻類外，均可用此液固定也通用于昆蟲和甲殼類的固定。 FAA液配方： 福爾馬林 5m1 冰醋酸 5m1 50或70酒精 90m1Bouin氏液 是常用的良好固定液，廣泛應(yīng)用于一般動(dòng)物組織、昆蟲組織、無脊椎動(dòng)物的卵和幼蟲，以及胚胎學(xué)材料的固定。也適用于裸子植物的雌配子體和被子植物的胚囊的固定。 Bouin氏液配方： 苦味酸飽和水溶液 75份 福爾馬林 25份 冰醋酸 5份 此液穿透迅速而均勻，使組織收縮少，不使組織變硬變脆，著色良好。一般動(dòng)物組織固定122

22、4h，小塊組織數(shù)小時(shí)即可。固定后直接入70酒精中洗去黃色，但留一點(diǎn)黃色對染色并無妨礙。植物材料的固定時(shí)間為1248h。7.2.5固定的注意事項(xiàng) (1)固定的材料越新鮮越好。因此，采集或割取后須立即投入預(yù)先準(zhǔn)備好的固定液中進(jìn)行固定，切勿耽誤。 (2)材料大小以直徑不超過5mm為宜，材料與固定液的比例為 1:20。 (3)根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。 (4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物質(zhì)，則可用含有酒精的固定液固定。 (5)含有氣泡的材料投入團(tuán)定液后，材料不會下沉，故須將氣泡抽出使材料下沉。最簡易的抽氣方法是將材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽動(dòng)幾次。也小用抽

23、氣裝置進(jìn)行抽氣。 (6)固定時(shí)，要防止材料變形。 (7)外有被膜，而內(nèi)部站構(gòu)又極易松散的器官，應(yīng)將整個(gè)器官投入固定液22h后，再將其修成小塊材料繼續(xù)則定。(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理鹽水洗凈后再行固定。 (9)材料投入固定液后須經(jīng)常搖晃。(10) 容器外需貼標(biāo)簽。7.3 脫水 脫水是用一種即能與水又能與透明液混合的液體來逐漸置換樣品中游離的水。 現(xiàn)采用的脫水劑一般是丙酮或乙醇來進(jìn)行梯度脫水，脫水的時(shí)間，可根據(jù)組織的類型，大小而定。 脫水的過程：一般是30%乙醇50%乙醇70%乙醇80%90%100% 100% 脫水應(yīng)逐步而不應(yīng)跨越太大進(jìn)行，否則將引起組織強(qiáng)烈的收縮或變形，在經(jīng)無水乙

24、醇處理時(shí)，應(yīng)保證試劑的純度。7.4 透明 透明是用一種即能與乙醇又能與包埋介質(zhì)互溶的液體來置換樣品中的乙醇，從而為最終的包埋創(chuàng)造一個(gè)有利的條件。 現(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 其過程為： 1/3二甲苯+2/3乙醇混合液1/2二甲苯+1/2乙醇混合液2/3二甲苯+1/3乙醇混合液二甲苯二甲苯 二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強(qiáng)，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定。7.5 滲蠟 將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換了組織塊中的透明劑，便于今后的包理與切

25、片。 石蠟有液態(tài)與固態(tài)二種，滲蠟要在恒定溫箱（60c）中進(jìn)行，以保證石蠟處于液態(tài)中。7.6 包埋 樣品經(jīng)石蠟滲透后，其內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，此時(shí)還需要用同種硬度的石蠟包埋成蠟塊以利于后邊的切片，包埋可用相同的器具，也可折疊一牛皮紙盒。 將液態(tài)石蠟緩緩倒入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。 至此，一塊組織已完成前處理過程，可以切片，前邊的步驟看來既無高深的理論，又無復(fù)雜的技術(shù)，一切看似簡單，但一步做不到都會造成整個(gè)制片的前功盡棄。我們可以看到： 水和酒精可以相溶。 酒精和二甲苯相溶。 二甲苯和石蠟可以相溶。 因?yàn)橐陨舷噜彶襟E所使用的液體均可以

26、互溶，所以保證每一步驟液體能置換完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蠟不能相溶，所以如果有一個(gè)步驟的處理不徹底，殘留的液體帶到下一個(gè)步驟將不能互溶，最終帶到滲蠟步驟中，成為細(xì)小的空洞，以至不能成為質(zhì)地致密的石蠟塊，也就切不成良好的切片。7.7 切片修塊： 切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺上，以便于固定在切片機(jī)上。切片：一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)，切片的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶放在一干凈黑紙上。貼片：用小刀根據(jù)需要切成數(shù)段，分別用粘片劑貼在干凈載玻片上。在恒溫展片臺上展平，烘干。 7.

27、8 染色（見實(shí)驗(yàn)三）7.9 封片、晾片、鏡檢 實(shí) 驗(yàn) 三 生物標(biāo)本的染色技術(shù) 染料、染色液染料必須具備兩個(gè)條件： 要具有顏色 和被染物體之間具有親和力。 如果只有顏色而與被染物體之間無親和力，那只能是顏料或合色物質(zhì)，而不是染料。染料的顏色和親和力都是由分子結(jié)構(gòu)決定的，即由產(chǎn)生顏色的發(fā)色團(tuán)和與組織產(chǎn)生親和力的助色團(tuán)所決定。 發(fā)色團(tuán)：能使染料分子產(chǎn)生顏色的原子團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)，也就是能吸收一定波長的光線并因之而呈現(xiàn)顏色的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 助色團(tuán)：能使染料對織物纖維或組織成分產(chǎn)生親和力的原子團(tuán)稱為助色團(tuán)，也就是使化合物具有成鹽性質(zhì)的原子團(tuán)。 染色劑的分類 根據(jù)來源分 (l)天然染色劑 此類染色劑是從動(dòng)、植物體

28、中提取的，為天然產(chǎn)物，產(chǎn)量少。目前常用的有蘇木精、洋紅、地衣紅和靛藍(lán)等。其中最常用的為蘇木精和洋紅。 (2)合成染色劑 全是由芳香環(huán)或具有芳香性的雜環(huán)化合物所構(gòu)成。最早是由煤焦油蒸餾產(chǎn)物合成而得的，所以又稱為煤焦油染料。 除上述兩類外，在生物染色中還使用一些無機(jī)化合物，如硝酸銀、氯化金、鋨酸等。 根據(jù)用途分 (l)細(xì)胞核染色劑 用于細(xì)胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結(jié)品紫、硫堇、甲苯胺藍(lán)、甲基綠、美藍(lán)、孔雀綠和焦油紫等。 (2)細(xì)胞質(zhì)染色劑 用于細(xì)胞質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍(lán)等。 （3）脂質(zhì)染色劑 用于顯示脂質(zhì)的染

29、色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、硫酸尼羅藍(lán)及油紅等。 根據(jù)染色劑的化學(xué)性質(zhì)分 堿性染色劑、酸性染色劑和中性染色劑。 堿性、酸性和中性染色劑都是由一種酸和一種堿所構(gòu)成的鹽類。 堿性染色劑和酸性染色劑的主要區(qū)別，就在于染色劑的主要有色部分是陽離子還是陰離子。若染色劑電離后，其分子的主要部分成陽離子為堿性染色劑若電離后，其分子的主要部分為陰離子即為酸性染色劑。 染色原理 有關(guān)染色的理論至今是一個(gè)并末完全清楚的很復(fù)雜的問題。目前一般還是從物理和化學(xué)的作用來解釋各種組織或細(xì)胞的染色現(xiàn)象。 1、染色的物理作用 此理論認(rèn)為組織細(xì)胞的染色是以物理作用為基礎(chǔ)的，主要是依靠下列三種物理作用的一種或全部，

30、使染色劑進(jìn)入組織或細(xì)胞內(nèi)。 (1)毛細(xì)管作用及滲透作用 但染色劑與組織細(xì)胞沒有牢固的結(jié)合 (2)吸收作用 又稱溶解學(xué)說。這種學(xué)說認(rèn)為組織細(xì)胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。組織吸收染色劑，作牢固的結(jié)合。組織的著色與溶液的顏色相同，但不一定和干燥染色劑的顏色相同。 例如，品紅溶液為紅色，所染組織也為紅色，而干燥的品紅則為綠色。蘇丹類染色劑使脂質(zhì)著色，是一種溶解現(xiàn)象。因?yàn)樘K丹類染色劑在脂質(zhì)中的溶解度大于在酒精等溶劑中的溶解度。當(dāng)蘇丹類的酒精溶液與組織細(xì)胞中的脂質(zhì)接觸時(shí)染色劑就從酒精中溶解到脂質(zhì)中，從而使其著色。 (3)吸附作用 吸附作用是固體物質(zhì)的特性，即較大的物體能從周圍溶液(染液)中吸附一些

31、小顆粒(化合物或離子)到自身的特性。細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此能選擇性地吸收不同的離子，即某種蛋白質(zhì)對某種染色劑有吸附作用,而對別種染色劑無吸附作用，這就可以解釋鑒別染色現(xiàn)象。 2、染色的化學(xué)作用 化學(xué)作用的主要理論根據(jù) 是染色劑的性質(zhì)可分為酸性、堿性和中性染色劑，而動(dòng)、植物的細(xì)胞內(nèi)般也可區(qū)分為酸性(陰離子)和堿性(陽離子)部分。當(dāng)堿性染色劑溶液中的有色部分成為陽離子時(shí)，就能與細(xì)胞的陰離子(酸件部分)較牢固地結(jié)合，當(dāng)酸性染色劑溶液中的有色部分成為陰離子時(shí)，就能與細(xì)胞內(nèi)的陽離子(堿性部分)較牢固地結(jié)合。 例如，細(xì)胞核，尤其是核內(nèi)的染色質(zhì)，主要由核酸組成，是酸性的組成成分故和堿性染

32、色劑(蘇木精)的親和力很強(qiáng)，易于著色。細(xì)胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，故和酸性染色劑(曙紅)的親和力很大，易于著色。 所以，在蘇木精曙紅(HE)染色中，細(xì)胞核被堿性染色劑蘇木精所染，細(xì)胞質(zhì)被酸性染色劑曙紅所染。這也就是細(xì)胞核是嗜堿性的，細(xì)胞質(zhì)是嗜酸性的。除染色質(zhì)外，粘液和軟骨的基質(zhì)等都是嗜堿性的，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含的某些顆粒也為嗜酸性。須注意的是嗜堿性和嗜酸性是相對而不是絕對的，若細(xì)胞在堿性染色劑溶液中停留過久，則細(xì)胞質(zhì)也可染上堿性染色劑的顏色。某些細(xì)胞(如血細(xì)胞）具有特殊性質(zhì)，能和中性染色劑發(fā)生親和力而結(jié)合。 由此可見，細(xì)胞各成分的染色強(qiáng)弱是與細(xì)胞成分及染色劑的性質(zhì)有密切關(guān)系：兩者之間的親和力強(qiáng)，染色就深；親和力

33、弱或無，染色也就淺或無。 但是，染色的實(shí)際情況是極為復(fù)雜的，組織細(xì)胞的染色作用，還隨所用溶液的pH值而變動(dòng)。 常用的染料（1）Deiafield氏蘇木精配方 蘇木精 4g 無水酒精 25m l 10銨明礬(硫酸鋁銨)水溶液 400m1 配制時(shí)先將蘇木精溶于無水酒精，待先全溶解后加入10銨明礬水溶液，充分?jǐn)噭?dòng)混合后，注入細(xì)口瓶內(nèi)，瓶口用紗布封住。然后將瓶置于溫暖有光處34天后過濾，濾后再加入100 m1甘油和100ml甲醇，混合均勻后，瓶口仍用紗布封口，再置于光線充足處12月使之成熟。待顏色變成紫褐色時(shí)即為成熟。成熟后過濾，塞緊瓶口置于陰涼處貯存， 可長期保存，多年不壞。此液著色力較強(qiáng)，染數(shù)分鐘即可。也可用染液l份加蒸餾水35份稀釋后使用，染色時(shí)間需延長一至數(shù)小時(shí)。此液染細(xì)胞核及嗜堿顆粒效果良好。染植物細(xì)胞的纖維壁比用其它任何染液著色更好。 （2）洋紅：染核效果好，常用的有醋酸洋紅、明礬洋紅、硼砂洋紅等。（3）蘇丹：脂肪（4）Wirghts染液：血細(xì)胞（5）甲基藍(lán)、曲利本藍(lán)（臺盼藍(lán)）：活體染料（6）神經(jīng)元染色：Nissal染色、銀染等（7）淀粉：碘碘化鉀染液（