表面展示技術(shù)(共12頁)

1、枯草芽胞桿菌( Bacillus subtilis) 是一種典型的好氧型的革蘭氏陽性細(xì)菌，也是研究的最早且最深入的一種芽胞桿菌。其中枯草芽胞桿菌 168是最早發(fā)現(xiàn)的可作為轉(zhuǎn)化(zhunhu)的芽胞桿菌菌株，隨后對其遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)系統(tǒng)做了深入的研究。1997年，日本和歐洲的幾個實驗室聯(lián)合完成了枯草芽胞桿菌168 基因組的測序1?？莶菅堪麠U菌有兩個生長時期: 孢子休眠期和生殖生長期。在營養(yǎng)缺乏等脅迫的環(huán)境下，枯草芽胞桿菌進(jìn)入休眠期形成具有抗逆作用的芽胞，在營養(yǎng)充足的環(huán)境下，芽胞又會進(jìn)入生殖時期，即芽胞萌發(fā)重新生長成為枯草芽胞桿菌。芽胞抗逆性非常強，在高溫和酸堿等極端環(huán)境下亦能生存，由于其獨特的生理

2、特性，使之成為新型的蛋白質(zhì)或酶類藥物表達(dá)載體而倍受關(guān)注。由于枯草芽胞桿菌是一種非致病性的益生菌，因此其可以作為一種生物安全的展示外源蛋白的宿主。目前利用該菌株已成功表達(dá)了破傷風(fēng)毒素2 4、不耐熱腸毒素4、乙醛酸脫氫芽孢桿菌屬和梭菌屬在受到外界應(yīng)力時如營養(yǎng)缺乏情況下自身母細(xì)胞會形成一種休眠體即芽孢,它可以抵御(dy)外界環(huán)境因素的攻擊。年前發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌的芽孢即使將其置于沸水中蒸煮一斷時間后,它仍能存活下來,這一有趣的現(xiàn)象吸引了科學(xué)家們開始探究芽孢的耐熱和抵御其他外界環(huán)境因素攻擊的作用機制。()枯草芽孢桿菌芽孢芽孢桿菌屬()在饑餓或環(huán)境惡劣等逆環(huán)境下,為了抵御外界不良應(yīng)力這時它的營養(yǎng)細(xì)胞會形成

3、一種近橢圓形的休眠體結(jié)構(gòu)即芽孢。芽孢的結(jié)構(gòu)由內(nèi)到外依次是核心、皮層、芽孢衣殼和芽孢外壁。芽孢的核心一般含有大量的染色體、酶和,但含水量卻很低,主要是由于它內(nèi)部的大部分水分子都被吡啶二羧酸復(fù)合體取代掉了。芽孢的外壁由肽聚糖構(gòu)成,與營養(yǎng)細(xì)胞的肽聚糖組分很類似,僅在于含量上有差別。芽孢的衣殼由至少種以上的蛋白構(gòu)成,這些蛋白也被稱為芽孢衣殼蛋白,它們具有抗酶解和抗藥物的功能,主要受一系列調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因控制。芽孢的外壁從結(jié)構(gòu)上又可細(xì)分為基底層、內(nèi)層、外層和層四個部分(圖)。芽孢誘導(dǎo)產(chǎn)生的整個過程大概需要將近八個小時。芽孢的形成受一系列調(diào)節(jié)酶如激酶(jmi)和磷酸酶、細(xì)胞周期及其他機制調(diào)控芽孢形成的步

4、驟可簡單地描述成如下幾個過程:第一步,包括、和在內(nèi)的組氨酸感受激酶開始活化,這時組氨酸感受激酶以擴展磷轉(zhuǎn)移的方式(fngsh)運載磷,并促使轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化。實際上,誘發(fā)芽孢產(chǎn)生的調(diào)控過程很簡單,因為只需要調(diào)控上游的表達(dá)就可以實現(xiàn),并且都不需要考慮它的營養(yǎng)是否缺乏。磷酸化調(diào)控的調(diào)節(jié)子基因很多,包括參與不均等分裂的相關(guān)蛋白和參與芽孢形成的因子蛋白。不均等分裂會使?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞分化成個間隔區(qū),大的是母細(xì)胞,而小的則是前孢子。前孢子最終演化為成熟的芽孢。隨后,母細(xì)胞以一種類似吞噬作用的方式逐漸包裹前孢子。待吞噬完成后,被母細(xì)胞吞并的前孢子則被覆蓋上了一個雙分子層膜。與此同時,還產(chǎn)生了兩個外部的保護(hù)(bo

5、h)結(jié)構(gòu):一個是前孢子內(nèi)膜與外膜間肽聚糖組裝成的核質(zhì);另一個是由衣殼蛋白質(zhì)構(gòu)成的芽孢最外保護(hù)層。實際上,肽聚糖的前體起初是在母細(xì)胞中合成的,然后它翻轉(zhuǎn)穿過前孢子外膜進(jìn)入外膜與內(nèi)膜間的空間,但是這種翻轉(zhuǎn)機制目前仍不太清楚。最后,母細(xì)胞破裂釋放成熟的芽孢進(jìn)入環(huán)境中。此時的芽孢能夠快速發(fā)芽并可通過吸收營養(yǎng)恢復(fù)它的增殖能力。新近發(fā)展起來的芽孢表面展示技術(shù),由于其具有獨特的穩(wěn)定性和安全性高的特點而引起廣大(gungd)學(xué)者的關(guān)注。一般來說,芽孢表面這些系統(tǒng)主要由宿主菌、分子載體和靶蛋白組成。目前,芽孢(y bo)表面展示系統(tǒng)中所用的宿主菌有枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、球形芽孢桿菌和巨大芽

6、孢桿菌。分子載體一般應(yīng)具有如下特質(zhì):它必須含有一個結(jié)構(gòu)域可以與靶蛋白(dnbi)進(jìn)行融合;必須含有一個錨定結(jié)構(gòu)域可使融合蛋白固定在芽孢的表面;分子載體和靶蛋白可以形成融合蛋白,相互功能不受影響;還必須具有抗酶解的能力;分子載體的敲除不影響芽孢的正常發(fā)芽、成熟和分化。芽孢表面展示系統(tǒng)中的外源蛋白也叫靶蛋白。針對靶蛋白而言,一般并無特別要求,選擇的對象應(yīng)從實驗需要出發(fā)。相對于芽孢表面展示系統(tǒng)來說,噬菌體或細(xì)菌表面展示系統(tǒng)都存在著一個明顯的缺陷,那就是這些系統(tǒng)中形成的融合蛋白都必須至少要穿過細(xì)胞質(zhì)膜才能錨定在宿主的表面,這容易導(dǎo)致有些融合蛋白由于無法穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)而就不能有效定位在噬菌體或細(xì)菌的表面

7、。例如那些細(xì)胞周質(zhì)中快速折疊的蛋白或疏水部位深埋在細(xì)胞膜的蛋白往往都不能有效地穿過細(xì)胞質(zhì)膜。芽孢表面展示技術(shù)發(fā)展較晚,但其卻具有如下諸多優(yōu)點:芽孢結(jié)構(gòu)比較特殊沒有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),所以當(dāng)它與外源蛋白融合后形成的融合蛋白在固定到芽孢表面的過程中避免了折疊不正確和定位不準(zhǔn)確的問題;其次,由于芽孢具有抗可逆環(huán)境等特性,因而它還會提高融合蛋白的穩(wěn)定性如熱穩(wěn)定性、耐有機溶劑等,尤其在制備生物催化劑方面;最后,被展示的外源蛋白或多肽范圍分布較廣,它還可展示多聚體類的蛋白。孢表面展示技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域和其他微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)相比,芽孢表面展示系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域,概況地說主要是生物分析和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地是

8、,芽孢表面展示系統(tǒng)可用于活性疫苗(ymio)和抗體的產(chǎn)生、多肽或蛋白庫高通量篩選、生物催化劑、生物傳感器、生物檢測器、重金屬離子和化學(xué)物質(zhì)的生物吸附等由于枯草芽孢桿菌的遺傳學(xué)背景和芽孢的結(jié)構(gòu)信息都比較清楚,所以用它產(chǎn)的芽孢來構(gòu)建芽孢表面展示系統(tǒng)也就更容易實現(xiàn)。年,意大利那不勒斯菲里德里克第二大學(xué)研究小組首次報道了來自枯草芽孢桿菌外層衣殼蛋白可以用作分子載體將破傷風(fēng)梭菌破傷風(fēng)毒素單位(dnwi)展示在芽孢的表面,并且每個芽孢上約展示有個融合蛋白分子。新型(xnxng)芽孢表面展示系統(tǒng)不僅穩(wěn)定性和展示效率高,而且易于純化,這些優(yōu)勢促使芽孢表面展示系統(tǒng)為錨定其他的生物分子提供了新的選擇。年,英國倫敦

9、大學(xué)皇家霍洛威學(xué)院研究小組發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的外層衣殼蛋白也能夠?qū)⑵苽L(fēng)梭菌破傷風(fēng)毒素單位和大腸桿菌不耐熱腸毒素單位展示在芽孢的表面,他們發(fā)現(xiàn)不同種類的抗原都能被固定在芽孢的表面,而且獲得的重組芽孢還可以充當(dāng)黏膜免疫的一個載體工具。年,韓國首爾大學(xué)研究小組證實枯草芽孢桿菌衣殼蛋白能將四聚體的鏈霉素錨定在芽孢的表面。年,中國江蘇大學(xué)寧德剛研究小組發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌外層衣殼蛋白具有充當(dāng)分子載體的能力,可成功將綠色熒光蛋白展示在芽孢的表面。同年,瑞士帝斯曼公司的研究小組闡述了芽孢衣殼內(nèi)層蛋白草酸脫羧酶()不僅能夠展示動物飼料中常用的植酸酶,還能展示來自大腸桿菌的四聚體葡萄糖醛酸酶。有趣的是,芽孢表面展示

10、的與植酸酶的融合蛋白分子數(shù)目要多于與植酸酶的融合蛋白分子數(shù)目。一般來說,和常用來展示抗原制備活性疫苗,而則用來錨定功能性酶蛋白制備全細(xì)胞催化劑。截止目前,已報道的枯草芽孢桿菌芽孢表面展示系統(tǒng)的實例見表。雖說芽孢表面展示系統(tǒng)擁有一些得天獨厚的優(yōu)勢,但是其也存在一些需要改進(jìn)甚或改善的地方(dfng)。具體問題如下:孢表面展示系統(tǒng)所用的分子載體來源較少,不利于大量(dling)蛋白的展示;該系統(tǒng)展示功能性酶蛋白所獲得的酶活一般較酵母(jiom)或細(xì)菌表面展示系統(tǒng)所得的偏低,這本身與枯草表達(dá)系統(tǒng)研究的不透徹有關(guān);產(chǎn)芽孢的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成本較高。芽孢表面展示系統(tǒng)作為新近發(fā)展起來的一種微生物表面展示系統(tǒng),它已

11、用于口服疫苗的研制、抗體的生產(chǎn)、生物傳感器的構(gòu)建及全細(xì)胞催化劑等領(lǐng)域。近年來,已有學(xué)者利用芽孢表面展示技術(shù)構(gòu)建-半乳糖苷酶和乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶枯草芽孢桿菌芽孢表面展示系統(tǒng),并將芽孢表面展示系統(tǒng)分別用于生產(chǎn)辛烷基-半乳糖苷和乙酰神經(jīng)氨酸,使得目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量大幅度提高。表面(biomin)展示技術(shù)的概況表面展示技術(shù)()是指通過基因工程技術(shù)將外源蛋白或多肽定位到噬菌體、細(xì)胞或芽孢表面的一種技術(shù)。自在年首次發(fā)現(xiàn)噬菌體能夠作為一種展示外源蛋白或多肽的載體后,其他噬菌體展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)和細(xì)菌表面展示技術(shù)便應(yīng)運而生。表面展示技術(shù)之所以受到人們的歡迎,主要是由于其可被廣泛應(yīng)用于活性疫苗的研制(ynz

12、h)、肽庫的篩選、抗體的生產(chǎn)、作為去除有害物質(zhì)和重金屬離子的吸附劑、全細(xì)胞催化劑和生物傳感器等領(lǐng)域。噬菌體表面(biomin)展示技術(shù)噬菌體(Bacteriophases，又稱Phages)是指一類寄生在原核生物體內(nèi)的病毒。噬菌體展示技術(shù)(Phase display technology)是指將外源蛋白或多肽通過與噬菌體衣殼蛋白融合后其被展示在噬菌體顆粒的表面,形成的融合蛋白中的外源蛋白或多肽仍保留了自身的生物活性的一種分子生物學(xué)技術(shù)噬菌體展示技術(shù)(jsh)缺點：具體如下:外源蛋白或多肽與衣殼蛋白融合后,在表達(dá)過程(guchng)存在無法預(yù)測的偏性;被展示的外源蛋白或多肽分子量不能太大,否則會

13、影響噬菌體的組裝并降低它感染(gnrn)宿主的能力;在構(gòu)建肽文庫時,存在限制容量的弊端。細(xì)菌表面展示技術(shù)細(xì)菌表面展示系統(tǒng)主要分為革蘭氏陰性菌表面展示系統(tǒng)和革蘭氏陽性菌表面展示系統(tǒng)。芽胞表面展示技術(shù)是將外源目的蛋白編碼基因與含有自身啟動子的芽胞外套蛋白基因融合，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體，然后將這種載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)芽胞的宿主菌株，得到的重組菌株在生孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，外源目的基因就會在外套蛋白基因啟動子的啟動下表達(dá)，并通過與外套蛋白偶聯(lián)的作用將外源蛋白展示在芽胞的表面。由于芽胞獨特的抗逆性，使得展示在芽胞表面的外源蛋白也具有相應(yīng)的抗逆性。革蘭氏陽性菌表面展示系統(tǒng)這些細(xì)胞壁蛋白都具有相同的保守特質(zhì)即端含有一個引

14、導(dǎo)細(xì)胞壁蛋白穿過細(xì)胞膜的信號肽和端含有一個將細(xì)胞壁蛋白固定在細(xì)胞壁上的分選信號肽。因此,革蘭氏陽性菌表面展示系統(tǒng)又可以分為C端融合和N端融合。革蘭氏陰性展示(zhnsh)系統(tǒng)由于每種分子載體都具有不同的特性,所以這些特性就決定了它們只能用在一些特殊的用途中。是革蘭氏陰性菌表面展示系統(tǒng)(xtng)應(yīng)用最多的宿主菌,因為其表達(dá)系統(tǒng)成熟,操作相對簡單由于(yuy)革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁外僅有一層質(zhì)膜,所以其細(xì)胞壁上的分子載體與外源蛋白或多肽形成的融合蛋白可以很容易地穿過質(zhì)膜,這就大大提高了融合蛋白定位的準(zhǔn)確率。其次,可展示一些大分子外源蛋白;第三,革蘭氏陽性菌具有較厚的肽聚糖層,有利于對環(huán)境中重金屬離

15、子的吸附。同樣地,革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁厚的特點有時又會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低的問題,因此這在構(gòu)建豐富度高的多肽庫時很難操作;此外,革蘭氏陽性菌中的諸如枯草芽孢桿菌會分泌產(chǎn)生大量的蛋白酶,這些蛋白酶的出現(xiàn)有時會對外源蛋白的穩(wěn)定性造成破壞影響。革蘭氏陽性展示系統(tǒng)的缺點由于革蘭氏陽性菌在進(jìn)行遺傳操作時難度比較大,所以目前僅有少數(shù)幾種革蘭氏陽性菌被用作表面展示的宿主菌。母表面展示技術(shù)是一種利用真核微生物作為宿主的表面展示系統(tǒng)。其基本原理也是通過將外源蛋白的編碼序列與酵母細(xì)胞壁上的分子載體融合,分子載體上的信號肽引導(dǎo)融合蛋白定位在酵母細(xì)胞的表面。優(yōu)點(yudin):關(guān)于它的遺傳學(xué)背景研究得很清楚,和它相關(guān)的一些分

16、子生物學(xué)技術(shù)也發(fā)展比較成熟(chngsh),因此容易實現(xiàn)外源蛋白在它表面的展示;可以展示糖基化和二硫鍵異構(gòu)化修飾(xish)的真核生物蛋白;展示的外源蛋白分子量分布范圍廣,可達(dá);酵母細(xì)胞表面展示的目標(biāo)蛋白分子數(shù)目多達(dá);酵母顆粒大,因而可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行快速的篩選;酵母是菌種之一,安全無毒,有利于活性疫苗、全細(xì)胞催化劑和疾病治療等方面的研究。酵母表面展示系統(tǒng)優(yōu)點明顯,但缺點也很突出,具體如下所述:展示外源蛋白的范圍比較窄,由于它是真核生物會對外源蛋白發(fā)生或糖基化修飾,所以往往只能用來生產(chǎn)不含糖基化位點的功能性蛋白;當(dāng)外源蛋白是真核功能性酶蛋白時又會存在過度糖基化的可能性,進(jìn)而導(dǎo)致外源蛋白酶活性的喪失;遺傳穩(wěn)定性差,在傳代過程中容易丟失。芽