啟動子克隆及活性分析

1、第6章CpLTP3、CpLTPI.4基因啟動子克隆及瞬時表達分析為了深入探索蠟梅nsLTPs基因家族4個成員CpLTPl、CpLTP2、CpLTP3、 CpLTP4在表達和功能上存在差異的原因，需要進一步克隆各個成員的啟動子，以 便尋找調(diào)控方面的差異。我們利用hiTAIL-PCR法分離得到了 CpLTP3、CpLTP4 基因的啟動子區(qū)域，并對調(diào)控原件和瞬時表達活性進行了分析，另外兩個基因啟 動子暫時沒有得到成功分離，所以沒有進行分析。6.1實驗材料植物材料供試蠟梅開花大樹品種為罄口蠟梅，種植于西南大學校園內(nèi)，常規(guī)管理。蠟梅 小苗通過種子繁殖培育，種子采自西南大學校園罄口蠟梅樹。培養(yǎng)條件為濕度

2、85%，16h 光照（2000Lx），溫度 25C，8h 黑暗，溫度 20C。煙草 W38 （Nicotiana tobacum cv. Wisconsin 38）由本實驗室保存擴繁。菌種和載體大腸桿菌（Esherichia coli）菌株TOP10，為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌由本實驗室保存。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefacieus） LBA4404，用于農(nóng)桿菌介導的煙草 遺傳轉(zhuǎn)化，由本實驗室保存。克隆載體pMD19-T購自TaKaRa公司。植物表達載體pBI121，具有Km抗性和完 整的GUS基因表達元件，用于構(gòu)建瞬時表達載體。主要試劑Taq DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、Mg

3、cl2 dNTP、T4 DNA連接酶等購自 TaKaRa公司；DL2000、DNA Maker、質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒均購自BioFlux公司； PCR引物合成及DNA測序均由生物工程有限公司合成；氨芐青霉素（Ampicillin,Amp） 和卡拉霉素（Kanamycin,Km）均購自上海生物工程有限公司。主要設備紫外分光光度儀（島津），高速冷凍離心機（HITACHI），臺式冷凍離心機 （Eppendoff），TGL-16B 型臺式離心機（上海安亭），Eppendorf PCR 儀，IKA 型 渦旋器（德國產(chǎn)），高壓滅菌鍋（日本產(chǎn)），超低溫冰箱（sanyo），DYYIII型電泳 儀（北京六一廠

4、），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），F(xiàn)R-1型凝膠成像系統(tǒng)（上海 復日），722型分光光度計（重慶川儀九廠），恒溫振蕩搖床，恒溫培養(yǎng)箱，水浴鍋。常用溶液配方氨芐青霉素(Amp)：水溶，超濾，貯存濃度50mg/mL,-20C避光保存。 卡那霉素(Km)：水溶，超濾，貯存濃度50mg/mL,- 20C避光保存。TE (pH8.0)： 10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。50XTAE(電泳緩沖液),1L： Tris 242g/L,冰醋酸 57.1ml, EDTA(0.5mol/L pH 8.0)100ml/L。6x瓊脂糖凝膠上樣緩沖液：漠酚藍0.

5、25% (W/V)，蔗糖40% (W/V)?；九囵B(yǎng)基配方LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)大腸桿菌用)參照YEB培養(yǎng)基(培養(yǎng)農(nóng)桿菌用)Trptone1% (W/V)Yeast extract0.1%(W/V)MgSO47H2O0.5g/L蔗糖0.5%(W/V)pH7.0(固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂)煙草轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基MS0： MS基本成分+蔗糖30g/L，pH5.8MS1(高鹽脅迫培養(yǎng)基)：MS0+1mol - L-1 NaCl； pH5.8MS2(干旱脅迫培養(yǎng)基)：MS0+25%的PEG6000, pH5.8MS3(脫落酸脅迫培養(yǎng)基)：MS0+100mMABA, pH5.8MS4(赤霉素脅迫培養(yǎng)基)：MS0

6、+100mMGA3每種處理3瓶，重復3次(5) GUS染液0.5M MES (pH5.6)9.76g MES(嗎啡啉乙磺酸鈉)溶解于100ml MQ-water中，調(diào)pH5.6固定液(0.3%甲醛，10mM MES pH5.6,0.3M 甘露醇)750ul 甲醛，2ul 0.5MMES,5.46g甘露醇，加水至100ml50mM NaPO4 Buffer(pH7.0)57.7ml 1M Na2HPO4,42.3ml 1M NaH2PO4,加水稀釋至 2000ml組織化學染色試劑X-Gluc將10g X-Gluc溶解于100ul的二甲基甲酰胺中，加50mM NaP04(pH7.0)至 10ml7

7、0%的乙醇。6.2實驗方法及操作過程蠟梅基因組DNA的提取、純化蠟梅DNA的提取、純化見6.2.2 hiTAIL-PCR法擴增啟動子序列引物設計用Liu等人改良的TAIL-PCR: hiTAIL-PCR法擴增蠟梅非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基 因的啟動子280。以已克隆到的臘梅CPLTP3和CPLTP4基因5端序列為基礎，分別 設計3條特異的巢式引物RB0,RB1,RB2，結(jié)合簡并引物LAD、及AC0/AC1，分別進 行三輪擴增。LAD1: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3LAD2: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3

8、LAD3: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAC-3LAD4: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCCAA-3LAD5: 5 -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3AC0: 5 -GGACGATGGACTCCAG-3AC1: 5 -ACGATGGACTCCAGAG-3 CPLTP3RB0: 5 - GACGCTACCTGCCCACACGTGATTG -3 CPLTP3RB1:5 -ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCCACGTGAGGAGAGGCCAACAGCAA -3CPLTP3

9、RB2:5 -CAGCATCAGGCACACAACAACTCCG -3CPLTP4RB0: 5 - CCGGTTCTACTTGTTGAATGGGTGG -3 CPLTP4RB1:5 -ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTACATGCTGCACCGGCACAGGCGC -3CPLTP4RB2: 5 -CAGAGTGTTGCGTCGGTGCCATTGC-3hiTAIL-PCR 過程以50ng的蠟梅基因組DNA為模板，用3個特異性的巢式引物和簡并引物 LAD1-5,AC0，AC1為引物對，進行TAIL-PCR擴增。將預擴增的PCR產(chǎn)物稀釋50被 作為第一輪PCR擴增的模板，第一輪PCR。各

10、輪PCR反應體系及反應條件見表6-1。表6-1 TAIL-PCR的擴增體系、反應條件Table 6-1 Amplif ication condition for TAIL -PCR反應Reaction循環(huán)體系Cycling system /gL溫度條件(時間)Temperature condition ( Time)循環(huán)數(shù)Cycle No.10 x Ex-Taq Buffer293 C (2min) , 95 C(1min)125mM MgCl21.694 C (30s) , 60 C (1 min) 72C(1min)10預擴增2.5 mM dNTP1.694 C (30s) , 25 C

11、(2min) , 72C(3min)1Pre-amplification20pMLAD194 C (20s) , 48 C (1min) , 72C(3min)256pMAC0172C (5min)16pMRB01genomic DNA1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.1ddH2Oup to20第一輪擴增10 x Ex-Taq Buffer2.5Primary reaction25mM MgCl2294 C (20s) , 65 C (1min) , 72C(2min)12.5 mM dNTP294 C (20s) , 68 C (1min) , 72C(3min)6pM AC11

12、94 C (20s) , 68 C (1min) , 72C(3min)6pM RB1194 C (20s) , 50 C (1min) , 72C(3min)1350 x1st PCR product172C(5min)1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.2ddH2Oup to25第二輪擴增10 x Ex-Taq Buffer2.5Secondary reaction25mM MgCl2294 C (20s) , 68 C (1min) , 72C(3min)2.5 mM dNTP294 C (20s) , 68 C (1 min) , 72C(3min)6pM AC1194 C

13、(20 s) , 50 C (1 min) , 72C(3min)76pM RB1172C(5min)110 x2st PCR product1TaKaRa Ex-Taq DNAase0.2ddH2Oup to25用1%瓊脂糖膠電泳。預擴增產(chǎn)物通常為涂抹狀，在檢查少數(shù)樣品后，不必對所有預擴增產(chǎn)物電泳檢測。同一樣品的第一輪和第二輪產(chǎn)物在相鄰的泳道電泳， 特異產(chǎn)物產(chǎn)生相應的大小差異。將獲得的PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后送上海生工測序。CpLTP3pro, CpLTP4pro啟動子片段的獲得根據(jù)CpLTP3pro , CpLTP4pro啟動子序列，設計含有HindiII和BamHI酶切位點 的擴增引物：FC

14、pLTP3pro: 5 - AAGCTT ATTACGATGGACTCCAGAGCGGC-3RCpLTP3pro: 5 -GGATCCCTCCGCTTACTTACTCAGTCACACT-3 FCpLTP4pro： 5 - AAGCTT ATTACGATGGACTCCAGAGCGGC-3 RCpLTP4pro： 5 -GGATCCTTGATGGATTTCACAGAGAATTG-3以蠟梅基因組DNA為模板進行PCR擴增，25 m l體系：10 xExTaq Buffer2.5 LMgCl21.5 rL TOC o 1-5 h z dNTP1.0rLDNA1.0rLFCpLTPpr o引物1.0 r

15、L HYPERLINK l bookmark91 o Current Document RCpLTPpr o引物1.0rLEx Taq DNA 聚合酶0.5rL (1U)ddH2O16.5pLTotal25.0LPCR擴增條件為：95C預變性5min； 95C變性45s，60C退火45s, 72C延伸 1min，30個循環(huán)；72C延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測?？寺≥d體 pMD- CpLTP3pro 和 pMD- CpLTP4pro 的構(gòu)建對PCR產(chǎn)物進行回收，然后連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10。 經(jīng)挑菌搖菌后，使用通用引物進行PCR檢測。提取質(zhì)粒，并

16、根據(jù)以前所加的酶切 位點進行雙酶切驗證，最終獲得陽性克隆質(zhì)粒，分別命名為pMD- CpLTP3pro和 pMD- CpLTP4pro。HindiII和BamHI限制性內(nèi)切酶雙酶切體系(10pL)分別如下： TOC o 1-5 h z Buffer BamHI1.0pLHindlll0.2pLpMD- CpLTP3pro/pMD- CpLTP4pro 5.0pLddH2O3.4pLTotal10.0pL37 C酶切6個小時。6.2.5 植物表達載體 pBI121- CpLTP3pro 和 pBI121- CpLTP4pro 的構(gòu)建酶切質(zhì)粒DNA用HindiII和BamHI限制性內(nèi)切酶分別雙酶切克

17、隆質(zhì)粒pMD- CpLTP3pro,pMD- CpLTP4pro和pBI121 載體。25pL反應體系如下： TOC o 1-5 h z Buffer BamHI2.5pLBamHI0.4pLHindIII0.2pLpMD- CpLTP3pro/pMD- CpLTP4pro/PBI12115pLddH2O6.9pLTotal25.0pL37 C酶切8個小時后進行凝膠電泳，分別用試劑盒回收PBI121載體酶切后大片 段和CpLTP3pro、CpLTP4pro啟動子片段。連接將回收得到的pBI121載體和CpLTP3pro、%LTP4pro啟動子片段，以1： 3左右 的比例，在T4DNA連接酶作用

18、下進行連接。連接反應體系10pL如下： TOC o 1-5 h z 10XT4DNA 連接酶 Buffer1.0pLT4DNA 連接酶0.5pLPBI121載體回收片段1.5pLCpLTP3pro/CpLTP4pro 啟動子回收片段 4.0pLddH2O2.5pLTotal10.0pL16C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)（3）重組子鑒定1）PCR 檢測（同 ）2）雙酶切驗證10pL酶切反應體系如下:Buffer BamHI1.0pLBamHI0.4pLHindIII0.2pLPBI121- CpLTP3pro/PBI121- CpLTP4pro5.0pLddH2O3.4pLTotal1

19、0.0pL37C酶切6個小時后，進行凝膠電泳觀察酶切情況。獲得瞬時表達載體質(zhì)粒， 命名為 pBI121- CpLTP3pro 和 pBI121- CpLTP4pro。農(nóng)桿菌感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的選擇鑒定（1）農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備1）挑取LBA4404單菌落于5mlYEB液體培養(yǎng)基中，28 oC, 180rpm,培養(yǎng)過夜。2）取所搖菌液 2ml 加入 50mlYEB 中，28C 180rpm 至 OD600=0.5。3）冰浴 30min。4）4 oC, 5000rpm 離心 5min,棄上清，10ml 0.15mol/L NaCl 懸浮。5）4 oC，5000rpm 離心 5min,棄上清

20、，2ml 20mmol/L CaCl2 懸浮。6）加入15%甘油，每管100皿分裝，液氮速凍，-70C保存。（2）農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化1）加入1-2pg質(zhì)粒，冰浴30min，液氮速凍5min，37C溫育5min，冰浴2min。2）加入 1ml 液體 YEB，28C3-5h。3）重懸菌液，涂布于含相應抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上。4）28 C倒置培養(yǎng)2-3d。（3）農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取1）菌體收集同堿裂解法。2）將菌體懸浮于400皿STE溶液中，重旋、再離心、去掉STE溶液。3）再將菌體懸浮于250rL P1，渦旋混勻，加入溶菌酶50rL，37C, 3h。4）其余步驟同Watson小量質(zhì)粒抽提

21、純化試劑盒。（4）轉(zhuǎn)化子的選擇鑒定1）挑取單菌落，接種于3mlYEB+Km的10ml試管中，28C振蕩培養(yǎng)2d,取菌 液為模板分別參照宮R初。和乙尸尸劫刀基因的擴增條件，做PCR檢測；2）將陽性菌落放大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用BamHI/HindIII對表達載體pBI121- CpLTP3pro和PBI121- CpLTP4pro做雙酶切檢測是否含目的基因。農(nóng)桿菌介導的瞬時表達技術(shù)檢測啟動子活性重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，以LBA4404空菌株為陰性對照，以含pBI121載體的 菌株為陽性對照，采用農(nóng)桿菌介導的葉盤侵染法檢測已構(gòu)建的含蠟梅脂轉(zhuǎn)移蛋白 基因啟動子pBI121- CpLTP3pro. pBI1

22、21- CpLTP4pro的重組載體在不同脅迫環(huán)境下 的瞬時表達活性。（1）農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與活化將-80下保存的農(nóng)桿菌菌種LBA4404（含表達載體質(zhì)粒PBI121-CpLTP4pro），接 種到Y(jié)EB+Km 50mg/L培養(yǎng)基平板上，27-280到置培養(yǎng)2-3d。菌落長出后，挑取 單菌落接種于含Km 50mg/L的液體YEB培養(yǎng)基中，27-28C180rpm振蕩培養(yǎng)全 OD600為。將OD600為的菌液于室溫6000rpm離心8min，收集菌體。 用MS液體培養(yǎng)基重懸至OD600備用（2）培養(yǎng)條件所有組織培養(yǎng)過程若非特別說明，都是在24-26C，16h光照/8h黑暗光周期， 1500-2000

23、Lx光強度的培養(yǎng)室中進行。農(nóng)桿菌在28C，180rpm的恒溫搖床上培養(yǎng)。（3）農(nóng)桿菌介導的葉盤侵染1）選取生長旺盛的煙草無菌苗（轉(zhuǎn)接后10-15天）葉片，用鋒利手術(shù)刀片切成 1cm2小片，棄去中脈，在MS0培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)。2）將切好的煙草葉片浸泡于備好的農(nóng)桿菌菌液中，確保葉片切傷邊緣完全與菌 液接觸，浸泡5min。3）傾去菌液，將感染葉片轉(zhuǎn)移到滅菌吸水紙上吸去多余菌液。4）將葉片轉(zhuǎn)移到MS0培養(yǎng)基中，葉片背面朝上黑暗中共培養(yǎng)兩天。5）將共培養(yǎng)兩天后的葉片分別轉(zhuǎn)入4種脅迫培養(yǎng)基MS1,MS2,MS3,MS4中，在 28C下暗培養(yǎng)，處理0.5h后進行GUS染色檢測活性；同時將部分在MS1中共培

24、 養(yǎng)后的葉片分別轉(zhuǎn)移到4C和37C下進行冷脅迫和熱脅迫處理。處理0.5h后分別 進行GUS染色檢測活性；每種處理3瓶，每瓶4個重復。轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性組織化學染色檢測1）取出經(jīng)農(nóng)桿菌侵染過的煙草葉片，切成小片，放入固定液中，37C保溫1h 全過夜。2）棄固定液，用50mM NaPO4 Buffer（pH7.0）洗滌材料3次。3）加組織化學染色試劑X-Gluc使之淹沒材料，置于37C過夜染色。4）用70%乙醇脫色5min或更長時間排除顏色干擾，然后在顯微鏡下觀察并照 相。6.3結(jié)果與分析蠟梅基因組DNA的提取用CTAB法提取的蠟梅基因組DNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測證明DNA提取 成功（圖

25、6-1 ）。圖6-1蠟梅基因組DNAFig.6-1 purified DNA of the genome DNA6.3.2 3輪TAIL-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果用1%瓊脂糖膠電泳檢測預擴增產(chǎn)物，不同引物對組合所得到的產(chǎn)物在大小和 豐度方面存在差異，圖6-2表明乙尸尸3尹0和CpLTP4pro預擴增PCR產(chǎn)物中 LAD1-LAD5與人。0只80組成的引物對均檢測到有大小不同的擴增產(chǎn)物，并伴有拖 帶情況出現(xiàn)。圖6-3CpLTP3pro和 CpLTP4pro第一輪和第二輪產(chǎn)物同時電泳結(jié)果， 可以看出第一輪和第二輪產(chǎn)物在特異性上有所差異，CpLTP3pro有1條1200bp左右 的條帶較特異，CpLTP4

26、pro有1條800bp左右的條帶較為特異。M12345 M 12 冥 45WQbplOOObp 750bp： 。典商 Wbp .WObp圖6-2 CpLTP3pro和CpLTP4pro的預擴增A: CpLTP3pro預擴增B： CpLTP4pro預擴增M: DNA Marker (D2000)； 1, 2, 3, 4, 5分別代表特異引物和兼并隨機引物LAD1-5組合的預擴增PCR產(chǎn)物Fig.6-2 Pre-amplification of CpLTP3pro and CpLTP4proA: Pre-amplification of CpLTP3pro B: Pre-amplification

27、 of CpLTP4proM: DNA Marker (D2000)； Each set of 5 lines contains products of LAD1-5and special primer pairs, respectively.AB圖6-3 CpLTP3pro和 CpLTP4pro第一輪及第二輪擴增A: CpLTP3pro一輪及第二輪產(chǎn)物B: CpLTP4pro第一輪及第二輪擴增M: DNA Marker (D2000) ； 1-1、1-2分別代表特異引物和兼并隨機引物LAD1組合的第一輪和第二輪擴增PCR產(chǎn)物，同理如2-1,2-2； 3-1，3-2； 4-1，4-2； 5-1

28、，5-2.Fig.6-3 Primary and secondary amplification of CpLTP3pro and CpLTP4proA: Primary and secondary amplification of CpLTP3pro B: Primary and secondaryamplification of CpLTP4proM: DNA Marker (D2000) ； 1-1,1-2 contains products the primary and secondary amplification of LAD1-5 andspecial primer pairs

29、,respectively.2-1， 2-1， 2-2； 3-1， 3-2； 4-1， 4-2； 5-1， 5-2 are as same means as 1-1,1-2目的片段回收及測序切膠回收圖6-3A泳道2-2中1200bp左右的片段和圖6-3B中泳道1-2,800bp左右 的片段，連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10進行克隆，然后對菌液PCR 檢測正確后送上海生工測序，對測序產(chǎn)物分別與蠟梅CpLTP3和LTP4進行同源性 比對，確認分別為CpLTP3和CpLTP4基因5側(cè)翼序列后，設計合成特異引物，以蠟 梅基因組DNA為模板，PCR克隆更大長度的啟動子序列，如圖6-4所

30、示。圖6-4 蠟梅CpLTP3pro和CpLTP4pro啟動子的PCR擴增M: DNA Marker (D2000); 1: CpLTP3pro； 2 :CpLTP4pro； 3:陰性對照；Fig.6-4 Amplification of CpLTP3pro andCpLTP4pro promoterM: DNA Marker (D2000); 1: CpLTP3pro ； 2 :CpLTP4pro； 3: Blank經(jīng)PCR擴增、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、挑搖菌、重組子鑒定、序列測定等操作，最終獲得CpLTP3和CpLTP4啟動子分別為1298bp， 838bp，并分別命名為 CpLTP3pro和

31、CpLTP4pro。二者的序列差異較大，identity值為27.75%。其單鏈序 列分別如下：CpLTP3pro:ATTACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCTTTTTACCGGTCGTACATACCGAATATCGGCCACAATATCGGCCGATATTCAAAATATCGJTATTTAATTATTATTTTCAAAAACATCGATACGGTTTTTCACGATTTTTACACGTTTTTCACGATTTTTGACGGTTTTTCJTGGTTTTTCACGGTTTTCAACGGTTCAGGGTTTACGGGTTTCACGGGTTCTCACGGTTTTTTTGCGATTTTTTG

32、TGGTTTTTTGCAGTTTTTCACGATTTTTTACGGTTTTTTCACGGTTTCGATATCGGAGGAGAGAGAAATATACCGATTACGGAGGAGAGAGAAAAATATCAGCCGATATTACGGTTAAACCGATTTTTAAATCCCTGGTGTGGAGTCTATAAACATGTGACGTGAAAATTCGACACTAAGTGTTTCTTCAGAGAAGCTTGATCAATCCAGTTGACCAATTAATGATTAAGATATCAAAATTCATTTAATTTGAATTTTATGAACTCCGGAACTAATTTTAAGTGAAAAGTGTATAATTTT

33、GAGTTTCAAAAATCATACCTAAATAATTAAGAGAGAATGTTATTTTTCTTTAAATGTTTCGGTACAATTTTTTAAGTCTAAAATTATACGTTTTTCACTTAAAATTATTATCGAAATTCATAATATTAAGAGTAGATAAATTTTGATAACTTATTTGTAAAATCGATCAATAAACAACCTCATTTAAAAATCCCTCTCTACACCCTAGACTGTAATAAATTTAAATATAAGAGATTACAATACGATAAATCAAA TTATATTATTGAAAGATFAAACTCAAGTTAATTTJTTTTGTTTTC

34、AATTTTTACAGTATAAA AATTGTAATGAAAATTAGTTTAATTAAAATTTTTAAGAAACTTTCTCAATTCAAAATAATG TCTATTAATGAAGTAACTTCTAGATTGGTCAAAAATCAAAAGCAGAAATTTGGCAGGTA AATATCCCGCCTCCCAATGCAGGATTGATAATATAAAAAAATAAAGCTACTATTAAAGCGGTGCTACAATTGTACAACGTCCATTGCTGAACCATTTCCAGCCAACCGTCCGGGAGAAAAT TTGTCATCGGTGTAGTTGGTTCCCATATTCTCTCATTT

35、AAAGCCCAACCACCTCCTTGTTCC CTTTCCCCGTCCCTATATAACAACCATCACCAACTCAACTTCCCACCGTCAAAAATCAATC TTCTTCTTCACCGGTAACGTTGCAATTTGTTGCAGTAACAGAGTGTGACTGAGTAAGTAAGCGGAGCpLTP4pro :ATTACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCAGTAATACCACCGAGAATTTTGGTCTGTGAGAGGAGACAAGTGTGAGAGAAAATTAGAAAGAGAGGGACGAATTTGTGAGGTGGAGAGAG ATTTGTAATCTATATCCCA

36、TTTGGAATTAGTGAAACTCTCCGGTTGTTATCTGTGGACAG GAGCCTCGGTCGAGCTACGTTAAATTCAAGTGTTGATTGTGGATTGATTGTTTCCTTCAT TGGTTTGATTTACTGCCACTGATTGAATTGGAGATTAAATCCCAATACAAATTTTCTAAT CTATAGATAAAACTATGAATTCGAAAAGTAGCCCCTAATATTTAAGATGGACACTTTTTAAGGTGCATTTACTTAAAAAAAATCACTATTAAAAAAATAACGTGAGGTTCGTATCAACTACTTGAAATAAAGTAAA

37、TTTAAAATTTAAAACTGATGAATATGCTTTTCATTCAAGAGTTAAGGTGCCAAATTAGAACCTGATCAGCTCAAATTAAGTTCTGTGATGGTCAGAAGAA ATTGGTCGGTTCATGAGAAAGGACTATTTCTATTCACACACGGATAGAAAAGAGTTGAG AAATGAGTGCCAATTTGTCAAAAAGCAGGCCACTTCCACACTCATTGAATTAAAGCAAA TGCAGTTAGGTGGCCACTTGTCTTCTTCACTCACTATATTATTCTTTAGAGAGGTTACAA CACATGAGAGAGAGAAAC

38、AGAAAAAAGCCTCATTAAAGGAAGAAGAAGAAGCAGTAGAAGCAGAGAGAAGAAGGGAAAGGAAAAGGAGAAATAGAAGATTCTCTTCAATTCTCTG TGAAATCCATCAA啟動子的生物信息學分析通過 PLANTCARE (plant cisacting regulatory elements, http: / /www.bioinformatics. psb. ugent. be /webtools/plantcare /html) 對獲得的 CpLTP3pro, CpLTP4pro啟動子進行分析，結(jié)果表明這兩個啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點均很多，

39、 其調(diào)控特性比較復雜(詳見表6-2和圖6-5)。TATA-box是RNA聚合酶II結(jié)合位 點，保證轉(zhuǎn)錄的精確起始，并調(diào)控上游激活蛋白,CpLTP3pro和CpLTP4pro啟動子 都具有多個TATA-box CpLTP3pro在翻譯起始密碼子上游-62bp、-70bp、-166bp、 -318bp等21處均含有TATA-box CpLTP4pro啟動子在翻譯起始密碼子上游-28bp、 -52bp、-293bp、-382bp 等 15 處均含有 TATA-box CpLTP3pro 和 CpLTP4pro 啟動 子上游都具有CAAT-box但CpLTP3pro包括的數(shù)量較少，僅分別在-24bp、

40、-197 bp、 -425 bp 處有 3 個 CAAT-box，CpLTP4pro 則在-97 bp、-116 bp、-134 bp、-211 bp 等23處都具有CAAT-bo% CAAT-box主要控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率，并增強轉(zhuǎn)錄， 其轉(zhuǎn)錄激活作用具有雙向性，作用距離不定，是啟動子、增強子區(qū)域常見作用元 件，主要轉(zhuǎn)錄激活因子有NFI、CTF1、CTF2、CTF3等多種蛋白。兩個啟動子 都擁有多個光應答元件，如ACE、GA- MOTIF、I-box等。另外還發(fā)現(xiàn)了這兩個啟 動子都具有很多與植物非生物脅迫相關(guān)的響應元件，如共同擁有的 ABRE、 G-BOX、HSE 以及 CpLTP4pro

41、所特有的 GARE-MOTIF、TATC-BOX、MBS、 TC-RICH REPEATSo這與植物非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白所具有的抗多種非生物脅迫的 功能相一致。同時發(fā)現(xiàn)，CpLTP3pro啟動子還具有與細胞周期調(diào)控有關(guān)的順式調(diào) 控元件MSA-like和胚乳表達必須的順式調(diào)控元件Skn-1_motif，這些在分離到的 CpLTP4pro中沒有發(fā)現(xiàn)。表6-2啟動子區(qū)的調(diào)控元件分析Table 6-2 Cis-acting regulatory elements analysis of twopromoter sequences編號位點名稱數(shù)量序列位點功能No.Site nameAmountSequen

42、ceFunction of siteCpLTP3pro1AAGAA-motif1GGTAAAGAAA燕麥中發(fā)現(xiàn)，功能未知2ABRE2GACACGTGGC脫落酸應答順式調(diào)控元件3ACE1ACGTGGA光應答元件4ATCT-MOTIF1AATCTGATCG部分光應答元件保守序列5Box II1CCACGTGGC部分光應答元件6Box II1TCCACGTGGC部分光應答元件6CAAT-BOX3CAATT 或 CAAT啟動子、增強子區(qū)域普通順或 CAAAT 或 CCAAT式作用元件7CCAAT-box1CAACGGMYBHv1結(jié)合位點8G-BOX7TAACACGTAG光、厭氧生活和ABA的應答元件；

43、與花特異表達有關(guān)；受光和紫外線誘導調(diào)控9GA- MOTIF1ATAGATAA部分光應答元件10GATA- MOTIF1GATAGGG或部分光應答元件也是AAGGATAAGGASF-2結(jié)合位點11GT1- MOTIF2GGTTAAGT-1結(jié)合起關(guān)鍵作用與光應答有關(guān)元件12HSE1AAAAAATTTC熱應答元件13I-box2GATAAGATT部分光應答元件14MSA-like1TCCAACGGT與細胞周期調(diào)控有關(guān)的順式調(diào)控元件15Skn-1_motif1GTCAT胚乳表達必須的順式調(diào)控元件16TATA-BOX21核心序列TATA轉(zhuǎn)錄起始處是啟動子核心元件17rbcS-CMA7a1GTCGATAA

44、GG部分光應答元件18circadian1CAANNNNATC晝夜節(jié)律順式調(diào)控元件CpLTP4pro15UTR Py-rich stretch1TTTCTTCTCT提高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件2ABRE1GACACGTGGC脫落酸應答順式調(diào)控元件3ARE1TGGTTT厭氧誘導的必須順式調(diào)控元件4ATGCAAAT motif1ATACAAAT與TGAGTCA序列相關(guān)的順式調(diào)控元件5CAAT-BOX23CAATT 或 CAAT啟動子、增強子區(qū)域普通順式作用元件或 CAAAT 或 CCAAT6CAT-BOX3GCCACT分生組織表達順式調(diào)控元件7G-BOX2TAACACGTAG光、厭氧生活和ABA的應答

45、元件；花特異表達有關(guān)；受光和紫外線誘導調(diào)控8GA- MOTIF2ATAGATAA部分光應答元件9GARE-MOTIF1AAACAGA赤霉素應答元件10GATA- MOTIF1GATAGGG或部分光應答元件也是AAGGATAAGGASF-2結(jié)合位點11GT1- MOTIF2GGTTAAGT-1結(jié)合起關(guān)鍵作用與光應答有關(guān)元件12HSE2AAAAAATTTC熱應答元件13MBS1TAACTG與干旱相關(guān)的MYB結(jié)合位點14TATA-BOX15核心序列TATA轉(zhuǎn)錄起始處是啟動子核心元件15TATC-BOX1TATCCCA赤霉素應答元件16TC-RICH REPEATS1ATTTTCTTCA脅迫相關(guān)應答元

46、件17chs-CMA1a1TTACTTAA部分光應答元件18circadian1CAANNNNATC晝夜節(jié)律順式調(diào)控元件CpLTP3proCAAT-hgCGTCA-motifSkn-1 motifTC A-elementTGACG-mothGT 1-mom,6-5 nsLTPTCCACCT-motifA-boxG-box GT1-motif J HSELTR MBS MB SI- 一圖陽ch蠟梅區(qū)蕓基因啟動子或陷和劊處堅獨攜列分析gene promoter CpLTP3pro and CpLTP4pronucleotide sequence analysis-Eiox G-box GA-mot

47、if GAItE-motif GATA-motifI circadian克隆載體pMD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro的構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro分別經(jīng)BamHI和Hindlll雙酶切 鑒定，分別切出了約1200bp和800bp大小的預期目的片段和約1500bp和2100bp大小 的載體片段（如圖6-5）。進一步PCR擴增pMD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro的目 的片段，得到了預1200bp和800bp大小的片段（如圖6-6）。證明CpLTP3proK CpLTP4pro片段已插入pMD19-T中，克隆載體p

48、MD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro 構(gòu)建成功。Fig.6-6 The identification of pMD- CpLTP3pro and pMD- CpLTP4pro bydigesting withBamH I& HindIIIA： pMD- CpLTP3proB: pMD- CpLTP4proM: Marker(DL2000) ； 1:cloning vector plasmidM132000bp：2GClbp10褊WOObp750bp;5Mp圖6-7 克隆載體中目的片段M: Marker(DL2000) 1:克隆載體質(zhì)粒pMD- CpLTP3pro； 2:克隆

49、載體質(zhì)粒pMD- CpLTP4pro；3：陰性對照Fig. 6-7 Identification of CpLTP3pro and CpLTP4pro by PCRamplication in cloning vectorsM: Marker (DL2000); 1 pMD- CpLTP3pro; 2: pMD- CpLTP4pro; 3: blank6.3.6 植物表達載體pBI121- *7P3pro和pBI121- CpLTP4pro的構(gòu)建重組質(zhì)粒pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pro經(jīng)BimH I和HindI口雙酶切 鑒定，分別切出了約1200bp和80

50、0bp大小的預期目的片段和約12kb大小的載體片段 (如圖6-8)。進一步PCR擴增pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pr。的目的片段， 也分別得到了預期約1200bp和800bp大小片段(如圖6-9)。證明CpLTP3proP CpLTP4pro 片段已插入 pBI121 中，表達載體 pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pro構(gòu)建成功，表達載體結(jié)構(gòu)見圖6-10。M 1密M12320p圖6-9表達載體中目的片段的PCR驗證2Q0bp l.QObp1000p750bp.SOObp圖6-8 表達載體pBI121-CpLTP3pro和pBI

51、121-CpLTP4pr o 的酶切驗證M: Marker(DL2000)1:表達載體質(zhì)粒pBI121-CpLTP3pro2:表達載體質(zhì)粒pBI121-CpLTP4proFig.6-8 The identification of pBI121- CpLTP3proM: Marker(DL2000)1:表達載體質(zhì)粒pBI121-CpLTP3pro2:表達載體質(zhì)粒pBI121-CpLTP4pro3：陰性對照Fig.6-9 Identification of CpLTP3pro and andpBI121- CpLTP4pro by digesting with BamHI&HindIIICpLTP

52、4pro by PCR amplication.Marker(DL2000) 1： pBI121- CpLTP3pro ；Marker(DL2000) 1： pBI121- CpLTP3pro ；2:pBI121-CpLTP4pro2:pBI121-CpLTP4pro； 3:blankBamHI HindlllNos-ter GUS CpLTF3pro/ NptllCpLTF4pro圖 6-10 植物表達載體 pBI121- CpLTP3pro 和 pBI121- CpLTP4proFig.6-10 The construction outline of plant expression ve

53、ctorpBI121-CpLTP3pro and pBI121-CpLTP4pro含植物表達載體質(zhì)粒pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pro農(nóng)桿菌 LBA4404的獲得分別用2 g pBI121- CpLTP3pro和pBI121- CpLTP4pro質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404, 挑單菌落活化，參照CpLTP3pro和CpLTP4pro基因的擴增條件，PCR擴增目的基因， 分別得到了預期1200bp和800bp左右大小的片段(圖6-11)，根據(jù)PCR結(jié)果篩選到陽 性轉(zhuǎn)化子。M123456789102000bplOOObp750bp500bp200bp lOObp

54、圖6-11轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4405中目的片段的PCR驗證M: M: Marker（DL2000） ； 1-4:隨機挑選的pBI121- CpLTP3pro質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的LBA4404;5-8:隨機挑選的 pBI121- CpLTP4pro質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的LBA4404； 9:未轉(zhuǎn)化的LBA4404 （陰性對照）；10:水（空白對照）Fig. 6-11 Identification of CpLTP3pro and CpLTP4pro by PCR amplicationin transformed LBA4404M: DL2000 marker; 1-4: Random selected pBI121-

55、CpLTP3pro transformed LBA4404 single thalli ;5-8: Random selected pBI121-CpLTP4pro transformed LBA4404 single thalli 9: Untransformed LBA4404（ Negative control）;10:H2O:Water served as model;用堿裂解法大量提取PCR結(jié)果陽性的LBA4404菌液的質(zhì)粒，用HindIII和 BamHI做雙酶切，得到了預期1200bp和800bp左右大小的片段（圖6-11），說明 表達載體質(zhì)粒pBI121- CpLTP3pro和p

56、BI121- CpLTP4pro成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 LBA4404。圖6-11轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404中目的片段的酶切驗M: Marker（DL2000） ； 1：載體質(zhì)粒 pBI121- CpLTP3pro （農(nóng) 桿菌 LBA4404 中） 2:載體質(zhì)粒 pBI121- CpLTP4pro （農(nóng) 桿菌LBA4404中）Fig. 6-11.Identification of pBI121-CpLTP3pro and pBI121- CpLTP4pro by digesting with HindIII&BamHI in transformed LBA4404M: Marker（DL2000）; 1

57、: Expression vector pBI121- CpLTP3pro in transformed LBA4404;2: Expression vector pBI121- CpLTP4pro in transformed LBA4404;6.3. 8瞬時表達技術(shù)檢測啟動子活性GUS活性組織化學染色結(jié)果（圖6-12）表明，不進行任何誘導的情況下，%乙沈3尸0和乙沈4尸0均表現(xiàn)出一定的啟動子活性；在ABA、Nacl、PEG、4C、37C處理下，CpLTP3pro和CpLTP4pro可以啟動GUS告基因的表達，其表達強度 略高于不進行任何誘導處理的情況；在GA3處理下，CpLTP4pro的啟

58、動子活性明顯 高于CpLTP3pro, 這與CpLTP4pro含有赤霉素誘導相關(guān)的調(diào)控元件TATC-BOX、 GARE-MOTIF而CpLTP3pro不含有任何赤霉素誘導相關(guān)調(diào)控元件的生物信息學分 析結(jié)果相吻合。圖6-12 CpLTP3pro和CpLTP4pro啟動子的瞬時表達檢測Fig. 6-12 Detection of transient expression of CpLTP3pro and CpLTP4pro promoters66.4討論雖然用隨機引物進行染色體步行的技術(shù)提出較早，但是由于無法有效地控制 由隨機引物引發(fā)的非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，這種方法一直未能得到廣泛應用，由LIU 等

59、提出的TAIL-PCR具有過程簡單、快速省時、高效特異、直接測序等優(yōu)點，則巧 妙地解決了這個問題。與其他PCR方法相對，TAIL-PCR在已知基因的未知側(cè)翼序列的應用中具有 以下優(yōu)點：（1）方法簡單，PCR前既不需要特殊的DNA操作，反應后也不需要繁 瑣的產(chǎn)物鑒定，僅僅進行瓊脂糖電泳即可有效地證明產(chǎn)物的特異性，而其他PCR 方法在反應前需要對DNA進行純化、限制性內(nèi)切酶消化、連接和加尾等操作，反 應后還需要對產(chǎn)物進行Southern雜交、引物標記和延伸等繁瑣耗時的鑒定。（2） 高特異性。TAIL-PCR的特異引物的解鏈溫度要比任意兼并引物高出10C；任意兼 并引物較短，且具有較低的解鏈溫度；交

60、替進行的熱不對稱巢式PCR反應加上不 同特異引物與兼并引物的組合使特異產(chǎn)物大大增加，非特異產(chǎn)物得到高倍稀釋， 產(chǎn)物可直接測序。（3）快速省時，整個反應僅需1天就可以完成。本實驗中用于克隆啟動子的TAIL-PCR方法是LIU等人在傳統(tǒng)的TAIL-PCR方 法基礎上經(jīng)過改良的hiTAIL-PCR280，它結(jié)合利用TAIL-PCR和抑制PCR的原理， 預擴增反應中利用5帶尾巴的高簡并倍數(shù)的LAD引物在靶序列上創(chuàng)造結(jié)合位點; 兩端均為LAD引物和兩端均為特異引物產(chǎn)生的較短的非特異產(chǎn)物（300 bp）的擴 增受到抑制，第一輪TAIL-PCR中利用5帶尾巴的第一輪特異引物抑制較短的特 異產(chǎn)物的擴增，并利用