kras和egfr檢測與臨床應(yīng)用課件

1、KRAS和EGFR檢測與臨床應(yīng)用第1頁，共41頁。匯報(bào)內(nèi)容KRAS和EGFR的簡介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)等位特異性引物設(shè)計(jì)KRAS試劑盒開發(fā)簡介第2頁，共41頁。KRAS和EGFR的簡介及臨床意義第3頁，共41頁。KRAS背景KRAS是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體，是RAS基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信號通路的調(diào)控；EGFR在通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號傳導(dǎo)；KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直腸癌（

2、40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。第4頁，共41頁。KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對西妥昔單抗無應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者Karapetis CS, 2008, N Eng J Med第5頁，共41頁。結(jié)直腸癌患者檢測KRAS突變相關(guān)指南歐洲藥品評估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測KR

3、AS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療；美國FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測KRAS基因的基因型；2012年7月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測（KRAS和NRAS），至少應(yīng)檢測KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版） 。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)

4、直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時(shí)，必須檢測腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測腫瘤 K-ras 基因狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。第6頁，共41頁。KRAS基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗； KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Cli

5、n Oncol 第7頁，共41頁。非小細(xì)胞肺癌患者檢測KRAS突變相關(guān)指南美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細(xì)胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，KRAS基因測序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。第8頁，共41頁。KRAS主要突變位點(diǎn)在結(jié)直腸癌中，KRAS突變主要發(fā)生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和146 (C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E7

6、46-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753S192240-2257del1812370E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P192238-2248 GC(complex)

7、12422L747-T751Q192238-2252 GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751P192239-2251 C

8、(complex)12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769-D770insASV202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA6213第14頁，共41頁。EGFR突變與EGFR-TKI藥物療效關(guān)系所在外顯子突變類型與EGFR-TKI療效關(guān)系18G719A(S/C)3種點(diǎn)突變藥敏突變1919種缺失突變藥敏突變20點(diǎn)突變S768I藥

9、敏突變20點(diǎn)突變T790M耐藥突變*203種插入突變耐藥突變*21點(diǎn)突變L858R藥敏突變21點(diǎn)突變L861Q藥敏突變第15頁，共41頁。ADx EGFR試劑盒突變結(jié)果檢測組別突變類型所占比例對吉非替尼敏感性證據(jù) 1Exon 19 deletions; L858R 90%充分2T790M/deletion; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I 7%有限3T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations 3%無第16頁，共41頁。ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)第17頁，共41頁。ARMS-PCR原理ARMS是Am

10、plification Refractory Mutation System (擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng))的縮寫。根據(jù) PCR過程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對來實(shí)現(xiàn)對突變位點(diǎn)的檢測, 當(dāng)引物 3 末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí), 產(chǎn)物將不能延伸。因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，使其3末端分別與突變位點(diǎn)堿基匹配和錯(cuò)配，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷。第18頁，共41頁。ARMS-PCR原理Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one

11、 of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR). You F. M. 2008, BMC Bioinformatics第19頁，共41頁。PCR產(chǎn)物檢測-Real

12、time PCR每個(gè)PCR循環(huán)檢測熒光信號，不同PCR產(chǎn)物，不同熒光信號相比凝膠電泳：更快，可定量，無PCR產(chǎn)物污染信號產(chǎn)生方法：Scorpion (Qiagen)，雙環(huán)探針(廈門艾德)，Taqman，Molecular beacons，Sybr green，Yo-proFigure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer第20頁，共41頁。應(yīng)用于Real time-PCR的ARMS-PCRGCATGAAGG alleleA all

13、ele55553333AS primerAS primerMismatchMismatchReverse primerReverse primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbe第21頁，共41頁。ARMS技術(shù)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高（0.1-1%）操作簡便周期短不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染適用樣本類型多（如FFPE）精確突變類型缺點(diǎn)：方法建立需時(shí)較長僅能檢測已知突變第22頁，共41頁。測序法與ARMS法相比較Sanger測序法焦磷酸測序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE標(biāo)本成功率 低較高高商用試劑盒無有有流程與速度1-2天2-3天AGTGly13SerGGCA

14、GCGly12ArgGGTCGTGly13ArgGGCCGCGly12CysGGTTGTGly13CysGGCTGCGly12AspGGTGATGly13AspGGCGACGly12AlaGGTGCTGly13AlaGGCGCCGly12ValGGTGTTGly13ValGGCGTC第29頁，共41頁。三引物設(shè)計(jì)原理You F. M. 2008, BMC Bioinformatics第30頁，共41頁。三引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGA

15、ATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-319nt，49下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-325nt，54第31頁，共41頁。三引物設(shè)計(jì)下游引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACA

16、GCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列：5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3互補(bǔ)鏈：3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5下游引物：5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3第32頁，共41頁。3端增加錯(cuò)配如果3端是弱錯(cuò)配（C/A或G/T）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（A/G或C/T）才可阻斷3端的擴(kuò)增；如果3端是強(qiáng)錯(cuò)配（A/G或C

17、/T）則需要引入弱的錯(cuò)配（C/A或G/T）或不需引入錯(cuò)配即可阻斷3端的擴(kuò)增；當(dāng)3端是中度錯(cuò)配（A/A，C/C，G/G 或T/T）則需要引入中度的錯(cuò)配。野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3第33頁，共41頁。四引物設(shè)計(jì)第34頁，共41頁。四引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATAT

18、GATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內(nèi)引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 內(nèi)引物（R）5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3外引物（F）5-ATGACTGAATATAAACT-3外引物（R）5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3第35頁，共41頁。KRAS試劑盒開發(fā)簡介第36頁，共41頁。KRAS突變探針和引物設(shè)計(jì)KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGC

19、AAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 12GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT4. 5- ATAAA CTT GTG

20、GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT5. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT6. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCC C-3 12GGT CGT7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC8. 參照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-39. 下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探針：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3鎖核酸阻滯探針(野生型)： 5-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P04-3浙