模擬移動(dòng)床色譜分離技術(shù)概述和在生物質(zhì)有效成分純化中的應(yīng)用

1、模擬移動(dòng)床色譜分離技術(shù)概述和在生物質(zhì)有效成分純化中的應(yīng)用 1.基本概念生物質(zhì)：是植物通過光合作用生成的有機(jī)物，是地球上最廣泛存在的物質(zhì)，它包括所有動(dòng)物、植物和微生物以及由這些有生命物質(zhì)派生、排泄和代謝的許多有機(jī)質(zhì)。 生物質(zhì)有效成分或有效部位生物質(zhì)中具有某種特殊功能的一個(gè)成分或一組成分。例如：綠色抗癌藥物紫杉醇就是從紫杉樹的皮和葉中提取分離出來的有效成分；治療心血管疾病的銀杏黃酮就是從銀杏樹葉中提取分離出來的有效部位；2 純化生物質(zhì)有效成分或部位的必要性生物質(zhì)的有效成分和部位是生物體中含量甚微，但卻有特殊功效的組分。當(dāng)人們利用它們的特殊功效時(shí)，不能將生物體中的其它大量無用甚至有害的組分也一同混用

2、，所以必須純化。3 研究生物質(zhì)有效成分或部位純化技術(shù)的必要性生物質(zhì)有效成分和有效部位成品或中間體的工程化精細(xì)分離的難度比一般化工產(chǎn)品大得多。原因：第一，因?yàn)楫a(chǎn)品在粗產(chǎn)物中濃度通常很低，需處理的物料往往是成分復(fù)雜的粘稠的多相體系，因此，無論在熱力學(xué)特性，流變學(xué)特性以及流動(dòng)、傳熱、傳質(zhì)等方面，生物體系與一般化工體系相比都要復(fù)雜得多。第二，對(duì)生物制品要求高純度、無色、結(jié)晶以及能長(zhǎng)期保存等。第三，生物制品多為活性組分，耐溫性差，在深加工過程中多次分離、濃縮會(huì)造成收率低、步驟多、過程復(fù)雜等缺點(diǎn)。綜上所述有必要研究生物成品或中間體的規(guī)?；?xì)分離技術(shù)。4 模擬移動(dòng)床色譜分離技術(shù)在各種新型分離技術(shù)中，模擬移

3、動(dòng)床色譜技術(shù)因其既有實(shí)現(xiàn)高精度分離又有實(shí)現(xiàn)規(guī)?；哪芰Γ蔀樯锍善坊蛑虚g體的規(guī)?；?xì)分離的關(guān)鍵技術(shù)。色譜概念色譜法是分離混合物，提純物質(zhì)以及結(jié)構(gòu)同一性鑒定的有效方法之一。1903由俄國(guó)植物學(xué)家Tswett等創(chuàng)立。Tswett讓從綠葉中提取出來的色素石油醚溶液，通過一根填滿碳酸鈣的細(xì)長(zhǎng)的玻璃柱，然后用純凈的石油醚加以沖洗，結(jié)果在玻璃柱內(nèi)的植物綠葉色素就被分離成幾個(gè)具有不同顏色的譜帶，然后按譜帶顏色對(duì)混合物進(jìn)行鑒定分析。當(dāng)時(shí)Tswett將這種分離方法命名為色譜法，分離出的譜帶為色譜。4.2 色譜分類色譜自從1903年誕生后逐步發(fā)展完善。1935年，Adams和Holmes合成了離子交換劑并用于

4、色譜分離，從而誕生了離子交換色譜。1941年Martin和Synge設(shè)計(jì)了一個(gè)萃取容器，將乙?；被釓乃嘀休腿〉接袡C(jī)相，使其離析出來。不久又用填充顆粒硅膠的色譜柱代替這種萃取器，奠定了溶液分配色譜的基礎(chǔ)。1944年Consden等人將纖維紙做成濾紙形式，利用毛細(xì)管作用使溶劑在濾紙上移動(dòng)。由于混合物中各組分在兩相中溶解度的差異使它們以不同速率穿過濾紙，從而得到分離。由此而創(chuàng)立紙色譜法。1952年，Jomes和Martin在惰性載氣表面涂布一層薄而均勻的有機(jī)化合物液膜，并以氣體作沖洗劑，從而產(chǎn)生了氣-液色譜。1953年，Janak根據(jù)某些固體物質(zhì)能吸附氣體而發(fā)展了氣-固色譜法，1959年，Po

5、rath和Flodin提出了大小排阻色譜法，其原理是基于柱內(nèi)多孔填料對(duì)大小不同的分子具有選擇滲透作用。20世紀(jì)60年代早期，Giddings等將氣-液色譜重要理論用于液相色譜，同時(shí)出現(xiàn)了高效能液相色譜填料，到60年代末，Kirkland等研制了高效液相色譜儀。使液相色譜的分離效率和速度大大提高。4.3 現(xiàn)在的色譜法（層析法）現(xiàn)在的色譜法是指這樣的一種物理分離方法，它是根據(jù)不同物質(zhì)在由兩相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù)而分離。當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)也隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng)，并在兩相間進(jìn)行多次反復(fù)的分配，這樣就使各組分達(dá)到完全分離。如圖4.4 色譜理論在討論色譜理論時(shí)，一般以柱色譜為例。在色譜分離

6、過程中，當(dāng)流動(dòng)相攜帶樣品通過色譜的固定相時(shí)，樣品分子與固定相分子之間發(fā)生相互作用，使樣品分子在流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行分配。與固定相分子作用力越大的組分向前移動(dòng)速度越慢，與固定相分子作用力越小的組分向前移動(dòng)速度越快，經(jīng)過一定的距離后，由于反復(fù)多次的分配使原本性質(zhì)（沸點(diǎn)、極性等）差異很小的組分之間得到很好的分離。4.5 高效液相色譜法與低壓液相色譜相比高效液相色譜的特點(diǎn)：固定相的顆粒直徑 小且均勻，滿足柱 效高的要求；系統(tǒng)壓力大，固定 相要有 一定的強(qiáng)度 和剛度，防止在高壓 下變形和壓碎；效率高，柱效高和速率快。5 生產(chǎn)規(guī)模的色譜系統(tǒng)色譜是一個(gè)建立在吸附、分配、離子交換、體積排阻等基礎(chǔ)上的分離過程

7、，它利用不同組分在相對(duì)運(yùn)動(dòng)、相互不溶的兩相中的（其中相對(duì)靜止的相稱固定相，而另一個(gè)相對(duì)運(yùn)動(dòng)的相稱為流動(dòng)相）吸附能力、分配系數(shù)、離子交換能力、親和力或分子大小等性質(zhì)的微小差別，經(jīng)過連續(xù)多次在兩相間的質(zhì)量交換，使不同組分得到分離。色譜分離過程的特點(diǎn)是分離效率高，無需加熱和能耗低，對(duì)于那些用傳統(tǒng)分離方法如蒸餾、萃取及重結(jié)晶等難以分離的物系以及熱敏性物系，該方法具有明顯的優(yōu)越性。因此，在色譜技術(shù)發(fā)展過程中，不少化學(xué)、化工專家都致力于色譜技術(shù)的放大，使之用于制備和規(guī)模化生產(chǎn)。尤其隨著生物工程以及中醫(yī)藥現(xiàn)代化的迫切要求，在相關(guān)的領(lǐng)域都面臨著大量的分離純化任務(wù)，制備色譜作為一種快速高效的分離技術(shù)，已經(jīng)引起世

8、界各國(guó)的高度重視。在我國(guó)該技術(shù)已被列入“863”工程生物技術(shù)領(lǐng)域的攻關(guān)項(xiàng)目中。為了適應(yīng)精細(xì)化工、生物化工產(chǎn)品分離的需要，人們研制出多種生產(chǎn)規(guī)模的色譜系統(tǒng)。它們根據(jù)操作過程的特性可分為：批處理色譜(Batch Chromatography Process )和連續(xù)色譜（ Continuous Chromatography Process ）。批處理色譜的規(guī)模化（柱式固定床色譜分離） 批處理色譜即間歇制備色譜，是在分析型色譜的基礎(chǔ)上，通過放大色譜柱、增大進(jìn)樣量來提高分離能力，進(jìn)行工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)而建立起來的一種用大直徑柱分離物質(zhì)以得到大量純組分的分離技術(shù)。圖就是這種分離過程的模型。固定床是床層及進(jìn)出

9、樣口不動(dòng)分離設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，過程的最優(yōu)化控制容易分離效率高，無需加熱和能耗低，適合熱敏性物系。床層和吸附劑的利用率低，溶劑消耗大，產(chǎn)品的濃度低，增加了回收投入；操作不連續(xù)，原料的處理量較小。固定床制備色譜的優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)連續(xù)色譜批處理色譜的不足引起了人們對(duì)連續(xù)色譜的開發(fā)和研究。連續(xù)制備色譜根據(jù)流動(dòng)相和固定相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)主要可分為連續(xù)逆流色譜和連續(xù)錯(cuò)流色譜兩大類。連續(xù)逆流色譜的研究最早是從移動(dòng)床系統(tǒng)開始的。移動(dòng)床系統(tǒng)移動(dòng)床是因床層在連續(xù)移動(dòng)而得名；逆流是固定相和流動(dòng)相作逆向運(yùn)動(dòng)而得名。在移動(dòng)床系統(tǒng)中，流動(dòng)相在泵的作用下由下往上流動(dòng)，而填料依靠重力作用向下移動(dòng)，柱的中部連續(xù)進(jìn)料，分離結(jié)果弱吸附組

10、分從塔頂流出，而強(qiáng)吸附組分在固定相作用下從塔底流出。 雙組分移動(dòng)床吸附圖解法移動(dòng)床的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是連續(xù)色譜由于使用了連續(xù)進(jìn)樣，使填料得到了充分利用，降低了溶劑消耗量，提高了產(chǎn)量，還可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。缺點(diǎn)是用填料本身的移動(dòng)來實(shí)現(xiàn)逆流操作，吸附劑的磨損是很嚴(yán)重的，填料的不均勻性以及大的空隙率使傳質(zhì)效率也大大降低，而且由于密封的問題壓力不能太高，流速不能高，從而限制了移動(dòng)床的發(fā)展，這種概念僅僅在石油工業(yè)中有所應(yīng)用。 移動(dòng)柱系統(tǒng)移動(dòng)柱系統(tǒng)是固定相裝在色譜柱中，相對(duì)柱管的位置不動(dòng)，進(jìn)出口位置也不變，但把整根柱切成很短的小柱，整個(gè)小柱在移動(dòng)。移動(dòng)柱系統(tǒng)通過柱的移動(dòng)來代替填料的直接移動(dòng)，克服了真正逆流移動(dòng)床色

11、譜系統(tǒng)的不足，但其本身有不可逾越的缺陷，即在較高的系統(tǒng)操作壓力下，在移動(dòng)的色譜柱與靜止的進(jìn)、出口之間很難實(shí)現(xiàn)可靠的機(jī)械密封。 正是在這種情況下，模擬移動(dòng)床應(yīng)運(yùn)而生。 模擬移動(dòng)床系統(tǒng)在模擬移動(dòng)床系統(tǒng)中，整個(gè)吸附床層由若干個(gè)互相連接的色譜柱組成。固定相在小柱中不動(dòng)，小柱也不動(dòng)，但進(jìn)出樣口沿流動(dòng)相的流動(dòng)方向有次序的移動(dòng)，從而有效的模擬了固定相與流動(dòng)相的相對(duì)逆流流動(dòng)。6 模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)6.1 SMB帶結(jié)構(gòu)6.2 SMB的工作原理6.1 SMB帶結(jié)構(gòu)SMB是柱的串聯(lián)系統(tǒng)，其流路特點(diǎn)是流體的注入點(diǎn)和流出點(diǎn)都是多點(diǎn)，即多進(jìn)，多出，一般來說是兩進(jìn)（樣品進(jìn)入和流動(dòng)相進(jìn)入），兩出（目標(biāo)物流出和殘余液流出）。S

12、MB流路這種特點(diǎn)造成SMB的區(qū)帶結(jié)構(gòu)，因?yàn)榱髀分羞M(jìn)口與出口兩側(cè)流速不同，在進(jìn)樣口兩側(cè)組分濃度也不同。若將流速相同的區(qū)域看成一個(gè)帶，SMB流路系統(tǒng)被進(jìn)出口結(jié)點(diǎn)分成了幾個(gè)帶，因此SMB是一個(gè)多帶的流路。通常的SMB為四帶結(jié)構(gòu)。按文獻(xiàn)習(xí)慣，一般地，將進(jìn)樣口后面的出口稱為萃取液出口，而將進(jìn)樣口前方的出口稱為殘余液出口。四帶系統(tǒng)模擬移動(dòng)床系統(tǒng)根據(jù)其結(jié)構(gòu)主要分為三帶、四帶和多帶系統(tǒng)。模擬移動(dòng)床中兩個(gè)輸入口和兩個(gè)輸出口將整個(gè)系統(tǒng)分割成幾個(gè)流速不同的帶，洗脫液D入口與萃取液E出口之間的區(qū)域稱為洗脫帶I；樣品溶液F入口與萃取液E出口之間的區(qū)域稱為一精帶II（第一精餾帶）；樣品溶液F入口與殘余液R出口之間的區(qū)域稱

13、為吸附帶III；在殘余液R出口與洗脫液D入口之間的區(qū)域稱為二精帶IV（第二精餾帶）， 這樣的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)稱為四帶系統(tǒng)。三帶系統(tǒng)如果流動(dòng)相不循環(huán)，IV帶可以省略，這樣的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)稱為三帶系統(tǒng)。模擬移動(dòng)床主要是通過PLC控制各接點(diǎn)閥來實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣點(diǎn)（F）、進(jìn)流動(dòng)相點(diǎn)（D）、出產(chǎn)品點(diǎn)（E）和出雜質(zhì)點(diǎn)（R）位置的變換，從而模擬固定相的逆流，提高固定相和流動(dòng)相的利用率，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了色譜分離的連續(xù)化。6.2 模擬移動(dòng)床的工作原理 三帶模擬移動(dòng)床運(yùn)行方式t=t0t=t0+ts/2t=t0+3ts/2t=t0+ts四帶模擬移動(dòng)床四帶模擬移動(dòng)床各帶的作用I帶是強(qiáng)吸附組分A的解吸帶，新鮮的流動(dòng)相D，從該帶底部進(jìn)入

14、，與固定相逆流接觸，將吸附的組分A全部沖洗出來，從而在該帶的頂部得到萃取液E（2+D），同時(shí)一部分滿足分離條件的產(chǎn)品回流進(jìn)入II帶。II帶是組分A的精制帶。該帶中吸附有弱吸附組分B和強(qiáng)吸附組分A的固定相與I帶流上來的僅含有A+D的流動(dòng)相接觸，兩組分在流動(dòng)相和固定相中再次分配。由于固定相對(duì)組分A的吸附能力強(qiáng)，固定相中被吸附的組分B逐步被后來的A+D溶液中的組分A所置換，經(jīng)過多次反復(fù)的吸附、置換、解吸，組分B漸漸減少直至全部置換出來。隨著兩相的逆流流動(dòng)，向上流動(dòng)的液體成為含組分B濃度高的溶液，而吸附組分A較多的固定相在下一個(gè)切換進(jìn)入解吸帶I。帶是組分A的吸附帶，該帶中的固定相將從該帶低部進(jìn)入的進(jìn)樣

15、液F和從II帶中流上來的溶劑中的組分A吸附， 從該帶的頂部流出富含組分B的殘余液R。帶是組分B的精制帶和流動(dòng)相的部分解吸回收帶。從帶進(jìn)入的僅含有洗脫劑D的固定相進(jìn)入IV帶與III中過來的含B+D的溶液接觸，組分B被吸附。吸附組分B的固定相在下一個(gè)切換進(jìn)入III帶，干凈的洗脫液從帶頂部流出，進(jìn)入帶，形成連續(xù)逆流循環(huán)操作 。三四帶SMBC比較三帶SMBC中由于沒有第帶，即二精帶，取消了溶劑的循環(huán)，從而各帶的流速相對(duì)比較獨(dú)立，無需循環(huán)泵，管路也相對(duì)簡(jiǎn)單。因此，與四帶相比，三帶的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，一次投資少，容易操作，主要缺點(diǎn)是溶劑本身沒有循環(huán)，增加了溶劑消耗，同時(shí)產(chǎn)品的濃度也較低。但如果采用適當(dāng)?shù)拇胧?/p>

16、，仍可以達(dá)到降低溶劑消耗的目的。我們?cè)O(shè)計(jì)的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)是三帶模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)。7 模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域 在石油化工領(lǐng)域的應(yīng)用 在食品工業(yè)中的應(yīng)用 在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用化工中的其他應(yīng)用7.1 使用模擬移動(dòng)床色譜時(shí)應(yīng)考慮的因素色譜柱的選擇：1. 柱尺寸, 2. 填料類型, 3. 填料尺寸, 4. 色譜柱的裝填, 5. 對(duì)稱性，流動(dòng)相的選擇：流動(dòng)相的種類及比例模擬移動(dòng)床系統(tǒng)操作參數(shù)的確定與調(diào)節(jié) 1. 操作參數(shù)的初步選定, 2. 流速與時(shí)間的調(diào)節(jié) , 3. 各帶柱數(shù)的配置 7.2 SMB應(yīng)用實(shí)例例1 在虎杖白藜蘆醇的純化中的應(yīng)用柱的制備樣品檢測(cè)參數(shù)選擇檢測(cè)結(jié)果1.1 柱的制備120cm無銹鋼空

17、柱，干法填充20-25um的反相ODS填料，共四根。柱的分離能力測(cè)試 檢測(cè)波長(zhǎng) 308nm；UV檢測(cè)器；流動(dòng)相：V(甲醇):V(水)=1：1；流速；室溫。 柱的對(duì)稱性測(cè)試4 1 20cm模擬移動(dòng)床1.2 HPLC檢測(cè)條件檢測(cè)波長(zhǎng) 308nm；UV檢測(cè)器；流動(dòng)相：V(甲醇):V(水)=1：1；100mmODS柱；流速 ；室溫。1.3 SMB參數(shù)選擇:1.4 SMB分離結(jié)果例2 紫杉醇純化中的應(yīng)用紫杉醇是一種抗癌新藥，可用于治療子宮癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等。據(jù)FDA報(bào)道，該藥物治療了2000余例晚期卵巢癌的患者，平均有效期為6個(gè)月。紫杉醇在植物中的含量很低(0.02% )，而且其水溶性差，分離困難

18、。生產(chǎn)紫杉醇的方法很多，有合成法、半合成法、細(xì)胞培養(yǎng)法、樹皮提取法、樹葉提取法。其中合成與半合成法經(jīng)濟(jì)效益不太高，而且全合成法分離較困難；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的成本太高。利用樹皮提取方法不能再生，對(duì)資源破壞嚴(yán)重，而且國(guó)內(nèi)有些單位采用甲醇、氯仿等有毒溶劑，對(duì)環(huán)境造成污染。也有少部分單位從樹葉中提取，但也都采用氯仿和甲醇作溶劑不利于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。本中心采用東北紅豆杉中可再生部分樹葉為原料，利用無毒、無污染的乙醇作為提取溶劑，研究了紫杉醇的提取過程，得到了高純度的紫杉醇。例3 銀杏黃酮及內(nèi)酯B的模擬移動(dòng)床純化銀杏內(nèi)酯B(縮寫為 GB)是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板活化因子拮抗劑，可在臨床上用于治療血栓、急性胰腺炎和心血管疾病，還可用于轉(zhuǎn)移性癌癥的治療。藥效優(yōu)于總內(nèi)酯，價(jià)格也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于總內(nèi)酯。據(jù)報(bào)道，國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格為20萬美元/ 公斤。銀杏內(nèi)酯B由于在銀杏浸膏粉中只含1%2%，且與銀杏內(nèi)酯A等結(jié)構(gòu)相近，因此分離極為困難。銀杏內(nèi)酯B的分離屬于精細(xì)分離，市場(chǎng)需求