免疫學教學課件第22章免疫學檢測技術(shù)的基本原理

1、1第1頁，共45頁。抗原抗體反應(yīng)的特點高度特異性抗原表位與抗體分子中超變區(qū)互補結(jié)合表面化學基團之間的可逆結(jié)合空間構(gòu)象互補；通過氫鍵、靜電引力、范德華力及疏水鍵等非共價的可逆結(jié)合。適宜的抗原抗體濃度和比例抗原抗體反應(yīng)的兩個階段抗原抗體結(jié)合的特異性階段。數(shù)秒鐘至幾分鐘?？梢姺磻?yīng)階段。數(shù)分鐘至數(shù)日。2第2頁，共45頁?？乖贵w反應(yīng)的特異性親和力affinity：抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應(yīng)抗原決定基之間的結(jié)合強度。親合力avidity：一個抗體分子與整個抗原之間的結(jié)合強度。非共價的可逆結(jié)合3第3頁，共45頁?？乖贵w反應(yīng)的可見性4第4頁，共45頁?？乖贵w反應(yīng)的影響因素電解質(zhì)適當濃度的電解質(zhì)會令

2、沉淀反應(yīng)更易出現(xiàn)，如0.85%NaCl。溫度溫度越高，出現(xiàn)可見反應(yīng)的速度越快37pH68之間5第5頁，共45頁。凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標記技術(shù)6第6頁，共45頁。凝集反應(yīng) agglutination reactions顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成凝集團塊mg/ml直接凝集間接凝集7第7頁，共45頁。直接凝集-玻片凝集試驗紅細胞凝集8第8頁，共45頁。正向間接凝集實驗9第9頁，共45頁。反向間接凝集試驗10第10頁，共45頁。Coombs test11第11頁，共45頁。沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)沉淀物20mg/ml2mg/ml單向瓊脂擴散雙向瓊脂擴散免疫電泳免疫比濁12第12頁，共45

3、頁。單向免疫擴散含有一定濃度抗體的瓊脂凝膠。沉淀環(huán)直徑與抗原濃度正相關(guān)。13第13頁，共45頁。雙向免疫擴散根據(jù)沉淀線形狀，可鑒定兩種抗原是否相同。14第14頁，共45頁。免疫電泳常用于血清蛋白的組分分析15第15頁，共45頁。免疫火箭電泳rocketimmunoelectrophoresis沉淀峰高度和Ag的濃度成正比16第16頁，共45頁。免疫比濁在一定量抗體中分別加入遞增率抗原，經(jīng)一定時間后形成免疫復合物，以濁度計測量反應(yīng)液體的濁度，根據(jù)標準曲線推算樣品中抗原含量。17第17頁，共45頁。用標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)免疫熒光法:直接熒光法間接熒光法酶免疫測定：酶聯(lián)免疫吸附試驗（EL

4、ISA）雙抗體夾心間接法BAS-ELISA微粒捕獲酶免疫分析技術(shù) MEIA酶聯(lián)免疫空斑試驗ELISPOT免疫組織化學技術(shù)放射免疫測定法化學發(fā)光免疫分析免疫印跡法免疫PCR免疫膠體金技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)18第18頁，共45頁。免疫熒光法熒光素、酶或放射性核素等標記物標記抗體或抗原。異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）等。直接熒光法、間接熒光法。19第19頁，共45頁。酶免疫測定pg/mlng/ml辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）或酶免疫組織/細胞化學法20第20頁，共45頁。ELISA雙抗體夾心法間接法BAS-ELISA酶聯(lián)免疫斑點實驗 ELISP

5、OT21第21頁，共45頁。ELISPOT 酶聯(lián)免疫空斑實驗思考： 做這個實驗所使用的幾種抗體有什么特殊要求嗎？22第22頁，共45頁。微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)MEIA將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素親和素酶放大系統(tǒng)相結(jié)合，酶作用于熒光底物，使之發(fā)熒光，通過檢測熒光強度判斷未知抗原的含量。用于檢測腫瘤標志物、性激素、甲狀腺素、HCG等微量可溶性抗原。23第23頁，共45頁。免疫組織（細胞）化學24第24頁，共45頁。放射免疫測定法高靈敏性，pg/ml。125I、131I等。25第25頁，共45頁?；瘜W發(fā)光免疫分析吖啶酯、魯米諾等發(fā)光物質(zhì)26第26頁，共45頁。免疫印跡法Immunoblot

6、ting / Western blotting27第27頁，共45頁。免疫PCR28第28頁，共45頁。免疫膠體金技術(shù)膠體金顆粒標記抗體或抗原氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下聚合成特定大小金顆粒，因靜電作用呈穩(wěn)定膠體狀態(tài)。膠體金顆粒聚集后呈紅色。膠體金標記染色膠體金免疫層析試劑盒29第29頁，共45頁。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片：固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。30第30頁，共45頁。淋巴細胞的分離外周血淋巴細胞分離液外周血單個核細胞 PBMC31第31頁，共45頁。淋巴細胞類型鑒定免疫吸附分離法免疫熒光法磁珠分離法流式細胞術(shù)抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)32第32頁，共45頁。磁珠

7、分離33第33頁，共45頁。34第34頁，共45頁。熒光激活細胞分選儀分離法流式細胞術(shù)鑒定熒光抗體單色、雙色或多色標記的細胞。分析細胞周期分析細胞凋亡情況35第35頁，共45頁。流式細胞儀36第36頁，共45頁?？乖?MHC 分子四聚體技術(shù)定量檢測抗原特異性CTL。37第37頁，共45頁。T細胞功能測定T細胞增殖實驗有絲分裂原（PHA、ConA等）形態(tài)計數(shù)法：體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、胞核松散、核仁增多等。3H-TdR或125I-UdR摻入法MTT法遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測如：PPD試驗38第38頁，共45頁。B細胞功能測定各類Ig含量的測定單向瓊脂擴散法、ELISA、速率比濁法等。抗體形

8、成細胞測定溶血空斑試驗ELISPOT39第39頁，共45頁。細胞毒試驗檢測CTL、NK細胞殺傷靶細胞活性的細胞學技術(shù)。51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法：臺盼藍染死細胞凋亡細胞檢測法40第40頁，共45頁。凋亡細胞檢測法細胞形態(tài)學檢測法體積變小、形態(tài)變圓、胞質(zhì)濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、核仁消失、染色質(zhì)濃縮成半月形或斑塊狀，最后形成凋亡小體。瓊脂糖電泳法：DNA區(qū)帶圖譜流式細胞術(shù)：二倍體峰前出現(xiàn)亞二倍體峰TUNEL法41第41頁，共45頁。凋亡細胞的檢測DNA ladder band瓊脂糖凝膠電泳細胞核DAPI染色海馬神經(jīng)元原位凋亡檢測TUNEL法 40042第42頁，共45頁。吞噬細胞功能測定硝基藍四氮唑（NBT）試驗巨噬細胞吞噬試驗43第43頁，共45頁。細胞因子的檢測生物活性檢測法細胞增殖或增殖抑制法細胞病變抑制法免疫學檢測法細胞分泌的細胞因子檢測：ELISA細胞內(nèi)細胞因子檢測