免疫學(xué)教學(xué)課件第22章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理

1、1第1頁，共45頁?？乖贵w反應(yīng)的特點(diǎn)高度特異性抗原表位與抗體分子中超變區(qū)互補(bǔ)結(jié)合表面化學(xué)基團(tuán)之間的可逆結(jié)合空間構(gòu)象互補(bǔ)；通過氫鍵、靜電引力、范德華力及疏水鍵等非共價(jià)的可逆結(jié)合。適宜的抗原抗體濃度和比例抗原抗體反應(yīng)的兩個(gè)階段抗原抗體結(jié)合的特異性階段。數(shù)秒鐘至幾分鐘?？梢姺磻?yīng)階段。數(shù)分鐘至數(shù)日。2第2頁，共45頁。抗原抗體反應(yīng)的特異性親和力affinity：抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合部位與相應(yīng)抗原決定基之間的結(jié)合強(qiáng)度。親合力avidity：一個(gè)抗體分子與整個(gè)抗原之間的結(jié)合強(qiáng)度。非共價(jià)的可逆結(jié)合3第3頁，共45頁?？乖贵w反應(yīng)的可見性4第4頁，共45頁?？乖贵w反應(yīng)的影響因素電解質(zhì)適當(dāng)濃度的電解質(zhì)會(huì)令

2、沉淀反應(yīng)更易出現(xiàn)，如0.85%NaCl。溫度溫度越高，出現(xiàn)可見反應(yīng)的速度越快37pH68之間5第5頁，共45頁。凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)6第6頁，共45頁。凝集反應(yīng) agglutination reactions顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成凝集團(tuán)塊mg/ml直接凝集間接凝集7第7頁，共45頁。直接凝集-玻片凝集試驗(yàn)紅細(xì)胞凝集8第8頁，共45頁。正向間接凝集實(shí)驗(yàn)9第9頁，共45頁。反向間接凝集試驗(yàn)10第10頁，共45頁。Coombs test11第11頁，共45頁。沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)沉淀物20mg/ml2mg/ml單向瓊脂擴(kuò)散雙向瓊脂擴(kuò)散免疫電泳免疫比濁12第12頁，共45

3、頁。單向免疫擴(kuò)散含有一定濃度抗體的瓊脂凝膠。沉淀環(huán)直徑與抗原濃度正相關(guān)。13第13頁，共45頁。雙向免疫擴(kuò)散根據(jù)沉淀線形狀，可鑒定兩種抗原是否相同。14第14頁，共45頁。免疫電泳常用于血清蛋白的組分分析15第15頁，共45頁。免疫火箭電泳rocketimmunoelectrophoresis沉淀峰高度和Ag的濃度成正比16第16頁，共45頁。免疫比濁在一定量抗體中分別加入遞增率抗原，經(jīng)一定時(shí)間后形成免疫復(fù)合物，以濁度計(jì)測(cè)量反應(yīng)液體的濁度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中抗原含量。17第17頁，共45頁。用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)免疫熒光法:直接熒光法間接熒光法酶免疫測(cè)定：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（EL

4、ISA）雙抗體夾心間接法BAS-ELISA微粒捕獲酶免疫分析技術(shù) MEIA酶聯(lián)免疫空斑試驗(yàn)ELISPOT免疫組織化學(xué)技術(shù)放射免疫測(cè)定法化學(xué)發(fā)光免疫分析免疫印跡法免疫PCR免疫膠體金技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)18第18頁，共45頁。免疫熒光法熒光素、酶或放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原。異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）等。直接熒光法、間接熒光法。19第19頁，共45頁。酶免疫測(cè)定pg/mlng/ml辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）或酶免疫組織/細(xì)胞化學(xué)法20第20頁，共45頁。ELISA雙抗體夾心法間接法BAS-ELISA酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) ELISP

5、OT21第21頁，共45頁。ELISPOT 酶聯(lián)免疫空斑實(shí)驗(yàn)思考： 做這個(gè)實(shí)驗(yàn)所使用的幾種抗體有什么特殊要求嗎？22第22頁，共45頁。微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)MEIA將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素親和素酶放大系統(tǒng)相結(jié)合，酶作用于熒光底物，使之發(fā)熒光，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷未知抗原的含量。用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物、性激素、甲狀腺素、HCG等微量可溶性抗原。23第23頁，共45頁。免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)24第24頁，共45頁。放射免疫測(cè)定法高靈敏性，pg/ml。125I、131I等。25第25頁，共45頁?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析吖啶酯、魯米諾等發(fā)光物質(zhì)26第26頁，共45頁。免疫印跡法Immunoblot

6、ting / Western blotting27第27頁，共45頁。免疫PCR28第28頁，共45頁。免疫膠體金技術(shù)膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下聚合成特定大小金顆粒，因靜電作用呈穩(wěn)定膠體狀態(tài)。膠體金顆粒聚集后呈紅色。膠體金標(biāo)記染色膠體金免疫層析試劑盒29第29頁，共45頁。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片：固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。30第30頁，共45頁。淋巴細(xì)胞的分離外周血淋巴細(xì)胞分離液外周血單個(gè)核細(xì)胞 PBMC31第31頁，共45頁。淋巴細(xì)胞類型鑒定免疫吸附分離法免疫熒光法磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)32第32頁，共45頁。磁珠

7、分離33第33頁，共45頁。34第34頁，共45頁。熒光激活細(xì)胞分選儀分離法流式細(xì)胞術(shù)鑒定熒光抗體單色、雙色或多色標(biāo)記的細(xì)胞。分析細(xì)胞周期分析細(xì)胞凋亡情況35第35頁，共45頁。流式細(xì)胞儀36第36頁，共45頁?？乖?MHC 分子四聚體技術(shù)定量檢測(cè)抗原特異性CTL。37第37頁，共45頁。T細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)有絲分裂原（PHA、ConA等）形態(tài)計(jì)數(shù)法：體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、胞核松散、核仁增多等。3H-TdR或125I-UdR摻入法MTT法遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)如：PPD試驗(yàn)38第38頁，共45頁。B細(xì)胞功能測(cè)定各類Ig含量的測(cè)定單向瓊脂擴(kuò)散法、ELISA、速率比濁法等?？贵w形

8、成細(xì)胞測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)ELISPOT39第39頁，共45頁。細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測(cè)CTL、NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞活性的細(xì)胞學(xué)技術(shù)。51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法：臺(tái)盼藍(lán)染死細(xì)胞凋亡細(xì)胞檢測(cè)法40第40頁，共45頁。凋亡細(xì)胞檢測(cè)法細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)法體積變小、形態(tài)變圓、胞質(zhì)濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、核仁消失、染色質(zhì)濃縮成半月形或斑塊狀，最后形成凋亡小體。瓊脂糖電泳法：DNA區(qū)帶圖譜流式細(xì)胞術(shù)：二倍體峰前出現(xiàn)亞二倍體峰TUNEL法41第41頁，共45頁。凋亡細(xì)胞的檢測(cè)DNA ladder band瓊脂糖凝膠電泳細(xì)胞核DAPI染色海馬神經(jīng)元原位凋亡檢測(cè)TUNEL法 40042第42頁，共45頁。吞噬細(xì)胞功能測(cè)定硝基藍(lán)四氮唑（NBT）試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)43第43頁，共45頁。細(xì)胞因子的檢測(cè)生物活性檢測(cè)法細(xì)胞增殖或增殖抑制法細(xì)胞病變抑制法免疫學(xué)檢測(cè)法細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子檢測(cè)：ELISA細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)