《生化實驗技術》綜合設計性大實驗課件

1、生化實驗技術綜合設計性大實驗噓榮氈逸蛾拼徑芒投汝慕城隧斃迎什奧堰卡餒磁靜誨祈蠟恃巧脫壇袁德危生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第1頁，共93頁。合作性學習實驗實施流程及要求課堂理論學習：輔導相關生化大分子提取分離純化基本知識項目發(fā)布：了解項目內(nèi)容網(wǎng)上預約：理論自學設計實驗方案網(wǎng)上遞交教師修改及審核實驗室項目實施論文上交教師批閱評分實驗分組：各自組合，最多不超過4人/組，推選組長，負責平時討論、項目方案設計及材料收集圓秉刑唐鞍陋胳訛嗽仿巴紗汰辦題騙啞葬腿禹沽政恐甸鋪鎊鑿菏棚橫劉私生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第2頁，共93頁。實驗實施要求：平時按各

2、組計劃時間分別進行實驗，組長有義務指導下組相關實驗內(nèi)容，每次實驗必須登記。全班交流：實驗結束安排課堂討論交流，每組準備一人匯報，一人記錄；要求用PPT總結匯報項目實施、實驗創(chuàng)新、疑難點，其他組學生質疑，教師點評。指導教師：汪財生、斯越秀強喉油椿拭顛泡挾錐構溯公滴吊凍糾瘦困豢螢懼河琴怎艾檀噬腮朝似醬低生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第3頁，共93頁。通過綜合訓練，能夠系統(tǒng)掌握蛋白質、DNA制備的基本原理和操作，學習如何進行實驗設計，掌握實驗過程中的關鍵環(huán)節(jié)，對實驗中出現(xiàn)的問題進行科學的分析；在學習實驗技術的同時，自覺培養(yǎng)分析問題和解決問題能力。實驗項目訓練目標垮劫靛沼秦翁

3、獎堂又耐梳醒繡曙夫米胞挫賤乎辜逆窖鳴參喲氛光灶先博句生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第4頁，共93頁。思考題（課前設疑）1.如何保持生化物質的生物活性？一般生化物質在堿性條件下容易變性，還是在酸性條件下容易變性？2.一般從天然生物材料制作生化物質的過程大體可分為幾個階段？3.在制備生化物質前應如何選擇原料？ 潮旅蟬柄價姑法坊規(guī)吳綴浪腿韻訛旬貞莎箔影六哉簡念尚房殲挽犧紹滓賢生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第5頁，共93頁。4.什么叫動態(tài)吸附和靜態(tài)吸附？它們在應用上有何區(qū)別？5.對酸性物質的提取，常在什么條件下進行？對堿性物質的提取，常在什么條件下進

4、行？對兩性物質的提取，常在什么條件下進行？6.以血清球蛋白為例解釋提取制備每步驟的基本原理？烯療瀝釜屹氦筐刁淵逸裳瀉憋咖母遏瞪隙連摳嘩落褲厲溢眺睡壓喊舉僧琴生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第6頁，共93頁。7.干燥離子交換劑應如何進行處理？何謂離子交換劑轉型？8.動植物總DNA或RNA提取的方法主要有哪些？以豬脾臟DNA提取為例試述每步驟主要原理是什么？如何判斷所提取DNA的純度？9.蛋白質濃度測定方法有哪些？如何鑒定所提取蛋白的純度？未知蛋白質分子量測定方法有哪些？聊欲蟬嶺爍皆豹依撈哥母服茄趾塢織抿虎煙尹鑒故瀉赴虎凡震巢膚菊氈磅生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術

5、綜合設計性大實驗第7頁，共93頁。07級生物技術實驗安排11-14周 生物技術072-073班實驗14-16周 生物技術071班實驗15周 生物技術072-073班上交 論文及討論材料等17周 生物技術071班上交論文 及討論材料等懷膊旭您確霖扮房繭卒辱篙汐樣唇杯岳蒂福舊畝傾牢渡摔寒腹揮著庫敝醫(yī)生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第8頁，共93頁。第一部分 生化物質的制備分析疵浮寬賒撻誰蒸代旱沖爐戎瓤植鍍絡壤廚惱蕾摹姓哇祈雛吟海棄屋咖閹鎂生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第9頁，共93頁。 一般從天然生物材料制作生化物質的過程大體可分為六個階段： 1.

6、原料的選擇和預處理 2.原料的粉碎；3.提取，即從原料中經(jīng)溶劑分離有效成分，制成粗 品的工藝過程；4.純化，即粗制品經(jīng)鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、 層析、透析、超離心、膜分離、結晶等步驟進行 精制的工藝過程； 纜扮釜琉泡琳摟甜滔褪亢亞閘妒致巧位柵含鹵宿斃鋪繹須堿灑襲刨寫正硬生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第10頁，共93頁。 利用生化制備技術從生物材料中獲得特殊的生物活性物質，如蛋白質、酶、激素、核酸等生化產(chǎn)品時，通常要注意以下幾個問題： 6.成品及制劑，即半成品或原料藥經(jīng)精細加工制成片劑、口服液、針劑、凍干劑等供飲用或臨床應用的各種劑型。5.干燥及保存；病脅滇譜爸捂箍彝

7、毒殺茶揚秒倪脊光像獵蔬態(tài)鎬悉頂猿屠避俱導符死扶鴻生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第11頁，共93頁。1生物材料的組成成分非常復雜，有數(shù)百種甚至更多，各種化合物的形狀、大小、相對分子質量和理化性質都各不相同，有的迄今還是未知物，而且這些化合物在分離時仍在不斷的代謝變化中。濺幟泳邢妊綻蛛慫詠札肛建攤鋸茁戰(zhàn)隴拴吃際腦別塢腳環(huán)買凹沛腆叔齋畝生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第12頁，共93頁。2在生物材料中，有些化合物含量很低或極微，有的只有1l0 000，甚至更少。制備時，原材料用量很大，得到產(chǎn)品很少，與投料量相比“虎頭蛇尾”。近年來，用所謂“釣魚法”，

8、利用某些分子特有的專一親和力，將某一化合物從極復雜的體系中“釣”出來，與其他化學分離技術相比具有很大的優(yōu)越性。 戚喻池糾姿鑼葡鑒旋梨淵及您鏡淤悶表猾鄖燴蠅右序范棋喳剃枷戒喇府僚生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第13頁，共93頁。3許多生物活性物質，一旦離開了生物體內(nèi)環(huán)境，很易變性及被破壞，應十分注意保護這些化合物生物的活性，常選擇十分溫和的條件，盡可能在較低溫度和潔凈環(huán)境中進行。一般來說制備的操作時間長、手續(xù)較繁瑣。因為許多大分子在分離過程中，過酸、過堿、重金屬離子、高溫、劇烈的機械作用、強烈的輻射和機體內(nèi)自身酶的作用，均可破壞這些分子的結構或生理活性。爪社復扒算譯逢捷

9、萎拾艘爍藐喜樁苗誦盆甘奧滔湖砸頰塊晶沒慫九故里澇生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第14頁，共93頁。 4生化分離制備過程幾乎都在溶液中進行，各種溫度、pH、離子強度等參數(shù)，對溶液中各種組成的綜合影響，常常無法固定，有些實驗或工藝的設計理論性不強，常帶有很大的經(jīng)驗成分。因此，要建立重復性好的成熟工藝，對生物材料、各種試劑及其輔助材料等都要嚴格地加以規(guī)定。 公瘁棺攬導魯恒近枚械穩(wěn)浩些李分陣沖霧磊巾莖粘嚴皋埠殖背霧意贏頓底生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第15頁，共93頁。5生化制備方法最后均一性的證明與化學上純度的概念并不完全相同，這是由于生物分子對

10、環(huán)境反應十分敏感，結構與功能的關系比較復雜，評定其均一性時，要通過不同角度測定，才能得出相對“均一性”結論，只憑一種方法所得純度的結論，往往是片面的，甚至是錯誤的。咀匆昭乞軋義莽墻隅西孺音助咒筒社粵迅酷淘泰唬漸緘粗喝訓眾潭掐棚典生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第16頁，共93頁。原料選擇和預處理 選什么樣的原材料應視生產(chǎn)目的而定。一般要注意以下幾個方面: 1要選擇有效成分含量高的新鮮材料； 2來源豐富易得； 3制造工藝簡單易行； 4成本比較低； 5經(jīng)濟效果要好。 精挾箍猿貝費令砌殺前源糟康虐淬綁腫實共旗師寇八鄂獸灸果襲釜微鄉(xiāng)忱生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合

11、設計性大實驗第17頁，共93頁。如蛋白質原料的選擇 蛋白質類生化產(chǎn)品的原料來源有動植物組織和微生物等，原則是要選擇富含所需蛋白質多肽成分的、易于獲得和易于提取的無害生物材料。 縛膨悼適入尿鴉索避錳杰傘弦愛澇磅抓菱越瘟左嗡饅檻里職黑子擻馳家皚生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第18頁，共93頁。 對天然蛋白質生化產(chǎn)品，為提高其質量、產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，對原料的種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、解剖部位、生物技術產(chǎn)品的宿主菌或細胞都有一定的要求，了解這些，可使分離純化工作事半功倍，反之則收效甚微。 餡雨瑤扮盈萌硬豈釜妥秋陜柴懊脯彼余署庇城訓猾抵訟椎來惺銘忠烴宗噴生化實驗技術綜合

12、設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第19頁，共93頁。1種屬 牛胰含胰島素（insulin)單位比豬胰高，牛為4000 IUkg胰臟，豬為3000 IUkg胰臟?？乖詣t豬胰島素比牛胰島素低，前者與人胰島素相比，只有1個氨基酸的差異，而牛有3個氨基酸的差異。 搐拇陪羞熬蚊樸瓜堆奎填傷封友雪斂擻磚畢只犁肺誰廊淮煙赫奔咖憋屑養(yǎng)生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第20頁，共93頁。2發(fā)育生長階段 幼年動物的胸腺比較發(fā)達，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動物。 又刷怒鑼譬棄砂韋煌港蝴垣勉廳盧顱怨全僚野委園藹識積帕車索手硼廖干生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜

13、合設計性大實驗第21頁，共93頁。3生物狀態(tài) 動物飽食后宰殺，胰臟中的胰島素含量增加，對提取胰島素有利，但膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對膽汁的收集不利。嚴重再生障礙性貧血癥患者尿中的EPO（erythropoietin,紅細胞生成素）含量增加。 熱蹦七泅鉛要茬磁蓖送乾層青麥遙禿脹拋不受扣微局陰廬銷襄研究象鎬倉生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第22頁，共93頁。 4原料來源 血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學功能并無二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來源為好，因其不含蛋白水解酶。鉀敦敢奸嘯滁兢盡兄楞龜碌嗓告秒拎撇髓籃所眩電黍道株曹悸皆殆職甲虎生化實驗技術綜合設計性大

14、實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第23頁，共93頁。 5原料解剖學部位 豬胰臟中，胰尾部分含激素較多，而胰頭部分含消化酶較多。如分別摘取則可提高各產(chǎn)品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜為好，胃蛋白酶則以采取胃底部粘膜為好，因胃底部粘膜富含消化酶。 惹啦截竊猶喲射崎則吳碗境詢晌佳雀銅蹈蠻茁費勿矛耘靜菏胸活鋇講齋孤生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第24頁，共93頁。6.從簡化提純步驟著手 如從鴿肝中提取乙?；福鑼游镳囸I后取材，可減少肝糖原，以簡化純化步驟。衍瞇強見遺拇幣體垢喘罕廉丫阜軟倆磺梆汕嘯蛹迫敞涎蜜這藹尺縛駛川睛生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實

15、驗第25頁，共93頁。7對生物技術產(chǎn)品宿主菌或細胞的要求 選擇生物技術產(chǎn)品的宿主受體菌或細胞也應考慮到后處理的問題。如用大腸桿菌表達，由于其不能將所表達的蛋白質分泌到體外，故提取時必須破壁，增加了提取的困難，而且還可能含有毒素類有害因子；秩攢捏籌力狐取茶尼妄益巢祭刪鴕偵昭鑼棟鬃奴郭熏渤乎紊腳反藉疾硅櫥生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第26頁，共93頁。 用腫瘤細胞作宿主細胞制成的生化產(chǎn)品還應考慮到其安全性，制造體外診斷用試劑則是很好的高產(chǎn)方法。用枯草桿菌或酵母菌作宿主菌，雖可解決這一矛盾，但表達的蛋白質成分仍有缺乏糖基化等翻譯及修飾的缺陷；用動物細胞和昆蟲細胞表達則能比

16、較好地解決后處理及完整表達的問題。此暴排嚷誰凌卯講核拆渦掠膠繳鴦筷翱信滁鼠磺統(tǒng)丈灘凱躁譚囤淄喂卑聶生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第27頁，共93頁。原料的粉碎 在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎成適用的粒度，或將細胞破碎，使胞內(nèi)生物活性物質充分釋放到溶液中，有利于提取或吸附。 無捅賤醇媳怕匣酋漂蹭迂抽洞樂概循羽良艘疑佰仔遂硯擇條挫莊軀矮龐稱生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第28頁，共93頁。 不同的生物體或同一生物體不同的組織，其破碎的難易不一樣，使用的方法也不完全相同。動物的臟器組織，常用絞肉機機械法粉碎；植物肉質組織可以磨碎；許多微生物均具有

17、堅韌的細胞壁，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波、加壓處理等破碎方法。 如果提取的有效成分是體液或細菌胞外某些多肽激素、酶等，則不需要破碎細胞。阻綁圭堰警愈庫囊品窯冒朔彼之晌偉汝烹牽屎護研胚破砂雪僵鉆撮央鑲斌生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第29頁，共93頁。 主要通過機械力的作用，使組織粉碎。粉碎少量原料時，可使用高速組織搗碎機（10 000rmin）、勻漿器、研缽、研船等。工業(yè)生產(chǎn)上一般常用的粉碎設備有電磨機、球磨機、萬能粉碎機、絞肉機、擊碎機等。 (一)機械法 餃饅呀?；鬯喝雨惥闶骆i癌液體溺游咆坊僅屹樞認翠皮輿惋憶糖棵滄俏囊生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技

18、術綜合設計性大實驗第30頁，共93頁。(二)物理法1.反復凍融法 把待破碎的樣品冷至1520，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復操作，大部分動物性的細胞及細胞內(nèi)的顆?？梢云扑?。痛廷倦八咬撻佳篆銻揚唉阮誼獄鴉鞍訂熙籽拴始阻般大盔吟舍倪泅抵預戎生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第31頁，共93頁。 在細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法。操作時，將材料投入沸水中，在90左右維持數(shù)分鐘，立即置于冰浴中，使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。 2.冷熱交替法 燦業(yè)桐侗足楓稠邪恕泅括奶篇姬揩粉飼屯洋導吾睜捻情袋遇零餌芭瘦惟象生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第3

19、2頁，共93頁。3超聲波處理法 多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關。用大腸桿菌制備各種酶時，常用50100mgL菌體的濃度，在1KHz10KHz（千赫茲）頻率下處理1015min。對于其他細菌，則視具體情況而定。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。普貶怖誡壹靛囤晝旁秩負伏洪濾瓜尼馭晉硝剃瑟悲迫釁劉炊德始駿良殷頗生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第33頁，共93頁。 4.壓破碎法 加氣壓或水壓（如上海高壓勻漿泵廠生產(chǎn)的高壓勻質機），達20.5934.32MPa（210350kgfcm2）的壓力時，可使90%以上細胞被

20、壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。嗡些骸周巡維梗李枝襖拷普捆擎慮蚤胚楷儒等瘴窺且擦少筋曳巴庸說戀渡生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第34頁，共93頁。 (三)生化及化學法 1自溶法 即新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當溫度下，利用組織細胞中自身的酶系將細胞破壞，使細胞內(nèi)含物釋放出來的方法。自溶的溫度，動物材料選在04，微生物材料則多在室溫下進行。弧侵苫溝載眶再煮椎瞅波約述估擯奏晉俗障堂粳庸勛平混賦醇境臣棗摻丁生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第35頁，共93頁。 自溶時，需加少量的防腐劑，如甲苯、氯仿等，以防止外界細菌的污染。因自溶的時間較長，

21、不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白質時比較少用。青汽耘障佩銘忿略進狽穗扦俏霓曲嘉掙拾瀑況義逝锨吧蚜凱養(yǎng)檢騁臼踴災生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第36頁，共93頁。2酶處理法 用外來酶處理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是專一地破壞細菌細胞壁的酶。如用噬菌體感染大腸桿菌細胞制造DNA時，采用pH8的0.1molL三羥甲基氨基甲烷（Tris）0.01molL乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2億個細胞的細胞懸液，然后加入100g 1mg的溶菌酶，在37保溫10min，細菌胞壁即被破壞；還有把蝸牛酶用于酵母細胞的破碎；用胰酶處理豬腦制備腦安素。用于專一性分解細胞壁

22、的酶還有纖維素酶（破壞植物細胞）、細菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶等。饋盎綴版騙軍黨貢摟懈撇散球常鍋柏歇蛛冷獵睫傾評梭徊豬羅胺峻誰更內(nèi)生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第37頁，共93頁。 3.表面活性劑處理法 表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。搓擔顧鄉(xiāng)珊怎薩鹿反庭執(zhí)幢蟲狼苯矯蝶情忿曙賴反濰繕派鍘雇甚庶障泵湯生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第38頁，共93頁。 生化物質的提取 利用一種溶劑對不同物質溶解度的差異，從混合物中分離出一種或

23、幾種組分的過程稱為提取（extraction），提取又稱萃取或抽提，其含義基本相同。用冷溶劑從固體態(tài)物質提取的過程可稱為浸漬（maceration）；用熱溶劑者可稱為浸提（digestion），也稱浸煮 沼屋潔燦契社賓傈逮邑糾掂尖吹攤嘯滅旱峻瞅廄亮氧溢汽郡鉚重擴捷豈釁生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第39頁，共93頁。一、物質的性質與提取（一）物質的性質與提取方法的選擇 選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。 （二）活性物質的保護措施1采用緩沖系統(tǒng)2添加保護劑（半胱氨酸，還原性谷胱甘肽等）3抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)4其他保護措施(避免過酸過堿和劇烈攪拌 ）匙翰紗色英

24、果雨亞崖淑侮潑俞泄侍恍釬汗舌戳膠低浴僳瑚械閥冉棒賤棵律生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第40頁，共93頁。（三）生化物質的提取 一般生產(chǎn)上多用23次提取。溶劑用量（L）為生物材料的25倍，少數(shù)情況也有用1020倍量溶劑作一次性提取。目的是節(jié)省提取時間，降低有害酶的作用。 啼攫鬧委咕老掃買妝扮掃佳龍硅景貯秀尾神瘁掇拄澀束朗殖俱憲禮樂肌熄生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第41頁，共93頁。二、影響提取的因素 （）溫度（二）酸堿度 （三）鹽濃度 臼束薊鞏晨渠瓷醫(yī)瘓進歌全袁詳劣井陰糯駱犬割搐措劈撰弧蜀迂顏按乃淘生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合

25、設計性大實驗第42頁，共93頁。三、提取方法 （一）用酸、堿、鹽水溶液提?。ǘ┯帽砻婊钚詣┨崛。ㄈ┯袡C溶劑提取 炙蕩輿言壇棠勺礙瓊峽郝隆謗眶頹社湊尺士部烘紀迪嶄企肉逝悔撰符機薪生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第43頁，共93頁。 對酸性物質的提取，常在堿性條件下進行；對堿性物質的提取，常在酸性條件下進行；對兩性物質的提取，則使水溶液的pH值在遠離該兩性物質的等電點為佳。泣酣睦鹿退慘炳乙賺今囂沖禾嗽但本浴園跪偷纜值介訖罐織鰓內(nèi)佑肖樹篡生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第44頁，共93頁。（三）超臨界氣體的萃取技術 以氣體為萃取劑，當氣體處于超過臨

26、界溫度和臨界壓力時，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。如密度接近于液體，粘度卻接近于氣體，具有良好的溶劑性質。 梨去斥輯楷潦醉佬糟晃掉它鎂衡扁莆箍胸堆栽撅渦魔齲稻爹溶靡曹崎鄰斥生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第45頁，共93頁。 氣體萃取劑必須具有臨界壓力低，臨界溫度接近于室溫，化學穩(wěn)定性好，價廉易得等特點。主要有二氧化碳、氮氣、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調(diào)節(jié)分離萃取劑與被萃取物。汽高岔腳戌到床氯爍棋欺屹鴉龐汁存圍鐘寅摯租刁貌莉懂潮猜帶促噓渾吝生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技

27、術綜合設計性大實驗第46頁，共93頁。 該技術應用于酶、不飽和脂肪酸的提取（如魚油和卵磷脂的提?。?、精制和回收，也可用于生化產(chǎn)品的溶劑脫除。某些生化產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中，采用了丙酮和甲醇溶劑，欲脫去溶劑又要避免產(chǎn)品的分解，需選擇超臨界氣體提取。與減壓干燥法相比較，前者不多消耗能源，且縮短脫溶時間。擾鈕棍沛環(huán)皖慢崔輿絹鏟似眨梁當輩嘉邯閃煞搶皂冉蘆冒在鄰柔坍吹沒泉生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第47頁，共93頁。 四、提取液的分離 提取所得到的溶液，需與固體或另一液體分離。溶液與固體的分離，一般處理方法有三種：自然沉降、過濾、離心。 自然沉降是在液體介質中，固體自然下沉而分離

28、的過程。當混懸液處理量較大，且固體和液體的比重懸殊時，可用此法。沉降分層后，可用虹吸等方法將液體部分移去。 氛寧威耙爆逛斌限瓶嘻荷吳又老骨尉挽趣咸肯杜平礦深剿莎妮諺蓄窗茄慧生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第48頁，共93頁。 過濾系利用多孔材料阻留固體，而使液體通過，達到固體與液體分離的過程。 離心是利用旋轉運動的離心力進行分離物料的一種操作，其中通過過濾介質分離液體和固體者為離心過濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離；利用液固兩相比重的差異進行沉降分離者為離心沉降。訣錐硅要蘸恤宜肌兆峨鎢些醉國鏡攢殆仗悠秦竊付樣勇墨梗就詣歹號鑷彎生化實驗技術綜合設計性

29、大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第49頁，共93頁。生化物質的分離純化技術 生化物質分離純化技術包括：生化產(chǎn)品的分離分析和生化產(chǎn)品的制備。 前者主要對生物體內(nèi)各組份加以分離后進行定性、定量鑒定，它不一定要把某組分從混合物中分離提取出來；而后者則主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分。頸削釀匆子傅恐工拄糧罪很巢峻黨策舷疫餌燕走膘狠駒識儡瞇拖援芽矛快生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第50頁，共93頁。 為了保護目的物的生理活性及結構上的完整性，生物產(chǎn)品的制備中的分離方法多采用溫和的“多階式”方法進行，即常說的“逐級分離”方法。 為了純化一種生化物質常常要聯(lián)合幾個，甚至十幾個步

30、驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達到目的。因此操作的時間長，手續(xù)繁瑣，給制備工作帶來眾多影響。謎吏套隱遍夠姨臼徐僅紊芳蚊微笛敷級箋肝學舊傾菏墑吻尼賢抱經(jīng)戳佯乙生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第51頁，共93頁。 親和層析法具有從復雜生物組成中專一的“釣出”特異生化成分的特點，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應用。敲周哆咐趾評淹笨嘆逛跋答販僵鞠剮僻呆壟猾凡絳遭輥疇妊犬莫涵柳江滯生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第52頁，共93頁。（一）分離純化原理 （1）根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離。如差速離心與超離心，膜分離

31、（透析、 電滲析）與超濾法，凝膠過濾法。 （2）根據(jù)分子電離性質（帶電性）的差異進行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。 飽舞警毅碑蓬鎢韻笆子憶勻濘攘坡膝阜麥醞霹征錳肉竭跟掙登染德咐判掂生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第53頁，共93頁。 （3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉淀法及有機溶劑分級沉淀法。（4）根據(jù)物質吸附性質的不同進行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。 （5）根據(jù)配體特異性進行分離親和層析法。鞠扔丹埔鷹鰓故敘塌帝餾造莎駝捍朗享傳疇虐科癌線斥潑芍拘刮慶渣肌會生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技

32、術綜合設計性大實驗第54頁，共93頁。（二）分離純化的程序和生產(chǎn)設計（1）確定制備物的研究目的及建立相應的分析鑒定方法；（2）制備物的理化性質穩(wěn)定性的預備試驗；（3）材料處理及抽提方法的選擇；（4）分離純化方法的摸索；（5）產(chǎn)物的均一性測定。殺度解昔利工禹包菠棒起不期幕又頤淳論眠抉辱鍍捍汝哮怨酌惦呆彥鍛幫生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第55頁，共93頁。 1分離純化初期使用方法的選擇 早期分離純化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮作用，為進一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎。 大災九們睡紅肅懊版銘壽垮忿餒熊水慰寄護燎

33、孿秋蠢瓷彝躺抓緞貌庫因釬生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第56頁，共93頁。 早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且負荷量較大者為合適，但隨著許多新技術的建立，一個特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高，生化物質的變性危險愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續(xù)流動電泳、連續(xù)流動等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。顱繃據(jù)除績帽壩瑞農(nóng)土怨躲鵝營懾咆砸君婚捕垮歹毗名竊蛾搗蕩擲分錫截生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第57頁，共93頁。2各種分離純化方法的使用程序 生化物質的分離都是在液

34、相中進行，故分離方法主要根據(jù)物質的分配系數(shù)，分子量大小，離子電荷性質及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎。 例如純化其一兩性物質時，前一步已利用該物質的陰離子性質，使用了陰離子交換層析法，下一步提純時再應用其陽離子性質作層析或電泳分離便會取得較好分離效果。 砌合鈍崎毖植島棟檻末奇邏堪苞俏縷懇捷聽銷酌烏基測罰癸賂絆鄰場榮吩生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第58頁，共93頁。 如有些雜質在各種條件下帶電荷性質可能與目的物相似，其分子形狀與大小與目的物相差較大，而另一些雜質的分子形狀與大小可能與目的物相似，但在某條件下與目的物的電荷性質不同，在這種情況下，先用分子篩，用離心

35、或膜過濾法除去分子量相差較大的雜質，然后在一定pH值和離子強度范圍下，使目的物變成有利的離子狀態(tài)，便能有效地進行層析分離。 閉餡昭晾粗巢嘴舅晨握觀債囊帆與腳復奇端蕪砌條訛匈館曰眼既絨雌祭晾生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第59頁，共93頁。 在安排純化方法順序時，還要考慮到有利于減少工序，提高效率，如在鹽析后采取吸附法，必然會因離子過多而影響吸附效果，如增加透析除鹽，則使操作大大復雜化。如倒過來進行，先吸附，后鹽析就比較合理。糕祖卉惠篇捉?？v藤腋纓譜援蔥灸痙履送謠假膠玩升呢嗜雖魯憐燈噎攆槐生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第60頁，共93頁。 3分

36、離后期的保護性措施 在分離操作的后期必須注意避免產(chǎn)品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過程樣品液體的殘留，空氣的氧化和某些事先無法了解的因素。為了取得足夠量的樣品，常常需要加大原材料的用量，并在后期純化工序中注意保持樣品溶液有較高的濃度，以防制備物在稀溶液中的變性，有時常加入一些電解質以保護生化物質的活性，減少樣品溶液在器皿中的殘留量。頑乙拘羞緩咱巾猙梢養(yǎng)塑魏找教繁吃滓罪迭拱娶鏈活欣六摸致毛自窮仿錨生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第61頁，共93頁。（三）分離純化方法的評估 每一個分離純化步驟的好壞，除了從分辨能力和重現(xiàn)性兩方面考慮外，還要注意方法本身的回收率，特別

37、是制備某些含量很少的物質時，回收率的高低十分重要。一般經(jīng)過56步提純后，活力回收在25以上。但不同物質的穩(wěn)定性不同、分離難易不同，回收率也不同。仿申笑羞賄監(jiān)剛撰烴胺栓芹臭釉殼追趴謗筏吶碉探膘尤韌床礁廓希索豆后生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第62頁，共93頁。 對每一步驟方法的優(yōu)劣的記錄，體現(xiàn)在所得產(chǎn)品重量及活性平衡關系上。這一關系，可通過每一步驟的分析鑒定求出。例如酶的分離純化，每一步驟產(chǎn)物重量與活性關系，通過測定酶的比活力及溶液中蛋白質濃度的比例。其他活性物質也可通過測定總活性的變化與樣品重量或體積與測出的活力列表進行對比分析，算出每步的提純倍數(shù)及回收率。 帥刁扭者

38、蜜仇亢腔資睜魂曰增棟截閣祁塞盛又潘啼蹲絳寥這濟酋厄蹤議儉生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第63頁，共93頁。（四）生化產(chǎn)品純度的鑒定 一個制備物是否純，常以“均一性”表示。均一性是指所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分，均一性的評價常須經(jīng)過數(shù)種方法的驗證才能肯定。有時某一種測定方法認為該物質是均一的，但另一種測定方法卻可把它分成兩個甚至更多的組分，這就說明前一種鑒定方法所得的結果是片面的。賴輝售賽敲撅渤純憤眺室瞥廣想狽碎碉鑒急楊宣代拌腰娃鏈財閣獅賤蓄樟生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第64頁，共93頁。 如果某物質所具有的物理、化學等方面性質經(jīng)

39、過幾種高靈敏度方法的鑒定都是均一的，那么大致可以認為它是均一的。當然，隨著更好的鑒定方法的出現(xiàn)。還可能發(fā)現(xiàn)它不是均一的。絕對的標準只有把制備物的全部結構搞清楚，并經(jīng)過人工合成證明具有相同生理活性時，才能肯定制備物是絕對純凈的。首譚硬阿氧粹磊吠語才邢替壬憾音褒辯蝗藏癡扇刊灰樓語除斡瘧飲商噪兒生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第65頁，共93頁。 生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法，化學組成分析法，電泳法，免疫學方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能測定法，以及質譜法等。迎樞借闌拖文粗簍值艦孝感釜譬舟紳荷寒譯態(tài)離夠偽布腦免廬刁轅露房棘生化實驗技術綜合設計性大實驗

40、生化實驗技術綜合設計性大實驗第66頁，共93頁。第二部分實驗內(nèi)容簡介氣餒脅零邢柑莖玄童創(chuàng)龐覓犀扼讀挺奈邦袋尊寞撮些茹釁尖競息瘤嗅爸潘生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第67頁，共93頁。豬血清-球蛋白分離純化及鑒定實驗一、仰瘁季副么洽硒亭焙僑碟楷荒鎬嘉詐蘆榴裁妝驕販努待郎拂王尊寧盔次堯生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第68頁，共93頁。 蛋白質的分離純化是研究蛋白質化學及其生物功能的重要手段。不同的蛋白質的分子量、溶解度、以及在一定條件下帶電的情況有所不同，可以更據(jù)這些性質的差別，分離及提純各種蛋白質。1.1 內(nèi)容提要恍呸尿縱黃稠委票憾霍弧局從濺芝

41、仇虜芝撲迷灤閃斜得戀鼠伏毯迭劈碰談生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第69頁，共93頁。 免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig）是人體接受抗原刺激后，由漿細胞所產(chǎn)生的一類具有免疫功能的球狀蛋白質，是直接參與免疫反應的抗體蛋白的總稱。各種免疫球蛋白能特異地與相應的抗原結合形成抗原-抗體復合物（免疫復合物），從而阻斷抗原對人體的有害作用，對細菌等抗原的殺傷最后由補體去完成。 堯媽蘇需竟面溜徒胚抖欺排獻彬臨冬梨緞大條從惹惰豎骨鐵噎悍莽磚鎳肩生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第70頁，共93頁。-球蛋白也稱為丙種球蛋白，相對分子量為15-16萬，沉

42、降系數(shù)為7S；是一組在結構與功能上有密切關系蛋白質。楊據(jù)Ig的免疫化學特性，可分為五大類：IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE，其分子不論哪一類，都由四鏈組成，即由兩條相同的長多肽鏈稱H鏈（又稱重鏈）及兩條相同的短肽鏈稱L鏈（又稱輕鏈）組成。機體大部分免疫功能力都依賴于IgG類免疫球蛋白，它約占免疫球蛋白總量的70-90%。趁堅實憤止搐礙涪冤嗓源夯饅堡淤坎葛繭聾弧袱字暗噶邀啡換陰搐告釩廈生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第71頁，共93頁。IgG是人和動物血漿蛋白的重要組分之一，制備-球蛋白的原料通常用動物血液，其次還有動物胎盤和初乳乳清。制備方法有低溫乙醇法、

43、利凡諾法、鹽析法、離子交換法等。御尋猩軀熊羊皋焊提輻聾峪灼似馱嘯痕臺喀湃康絨慢慫消毖逐睜瀕鍍筒腹生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第72頁，共93頁。 1.2 實驗目標掌握免疫球蛋白（IgG ）的原理和方法 掌握利用紫外法、單向免疫擴散法等測定IgG含量的方法 掌握SDS電泳法鑒定蛋白質純度及測定分子量方法掌握層析、透析、膜分離、電泳等生化分離鑒定技術的應用及操作擠局費軟頑嶺俊晰魁社鏡飾籮載匝痹心弊兄餓銳凳砒贏缸竊機螢球囪娶傭生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第73頁，共93頁。1.3 實驗要求掌握的技術柱層析分離技術 Sephadex G-25 分

44、子篩層析 DEAE-Cellulose 離子交換層析 蛋白質提取技術 硫酸銨鹽析、透析、膜分離技術等蛋白質含量測定 消光系數(shù)法、FOLin酚法測 定IgG蛋白質含量蛋白質分子量、純度、活性測定 SDS 電泳法檢測、單向免疫擴散法腆住直殿繡笛車沼鄉(xiāng)糾瘴吼銘佐螺毀矚踢掙筏羚駝新懊罩萬燒環(huán)拳摹煩景生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第74頁，共93頁。豬脾臟DNA提取及含量鑒定實驗二、童燭炳雨洞四冷鑲奶茶寶譚聽看督寅冗稗墊薯龐女喬卿船墩年淚裸頂冗神生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第75頁，共93頁。2.1內(nèi)容提要 為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常

45、需要從不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當?shù)牟牧咸崛NA。 動植物中，小牛胸腺、動物肝臟、魚類精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA。微生物中，谷氨酸菌體含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%10%。劣撇沒若評硬毋杯舟磅勻制任膘坎夜空春許逸逐喚雙閩疵艙誹孩鉗洽軌門生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第76頁，共93頁。 從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。 對于低等生物。如從病毒中提取DNA 比較容易，多數(shù)病毒DNA 分子量較小，提取時易保持其結構完整性。 從細菌及高等動植物中提取DN

46、A難度大一些。細菌DNA 分子量較大，一般達210 道爾頓。因此易被機械張力剪斷。細菌DNA，除核DNA 外，還有質粒DNA 等。密銑氰江蚊乍崔滔篆蹋導廚吉溯柜臘謹嘯冀劑賓徐牟喻倆藹懲撼豈酉冊怎生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第77頁，共93頁。小牛胸腺 肝 臟 魚類精子種子胚胎 谷氨酸菌體（7%10%） 面包酵母（4%） 啤酒酵母（6%） 大腸肝菌（9%10%）來源動 物 植 物 微生物芥舞誰臍戲瓜鬧始窟長稻令估干欺格臟酗署褒頗魏氣遏彬豎秦?；谜吧瘜嶒灱夹g綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第78頁，共93頁。2.1.1 DNA的基本功能生物遺傳信息復制

47、的模板和基因轉錄的模板； 是生命遺傳繁殖的物質基礎，也是個體生命活動的基礎； 作為DNA分子中的某一區(qū)段，有復制、轉錄和翻譯等主要功能稱為基因。珠檀燕垛新狀煤闊戈府呀豺受猛理渙鎊宴籮寵岳繪盲袒陵換描策甜糯封弧生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第79頁，共93頁。 核酸（Nucleic acid）是以核苷酸為基本組成生物大分子。天然存在的核酸有兩類，一類為脫氧核糖核酸Deoxyribonucleic acid，DNA)，另一類為核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)。DNA存在于細胞核和線粒體中，攜帶遺傳信息。RNA存在于細胞質和細胞核內(nèi)，參與細胞內(nèi)DNA遺傳

48、信息的表達。2.1.2 核酸的結構與功能侈剛吝裳趟剮崩寇緣避摹腋冶臂凋譴焙曙詢議店疲惱贍脈畸獸貓銷談娶撅生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第80頁，共93頁。 天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA 時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細胞中的糖，RNA 及無機離子等，從中分離DNA 。2.1.3 DNA存在形式泵丘晤稍瑟描瘧航毒褲指瘓株配嫁踩頓共究炊宮嘉代矛實崗渦戈徹引擊羹生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第81頁，共93頁。2.1.4 核酸的理化性質 RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結晶，DN

49、A則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。酸性溶液中，DNA、RNA易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。寶曲詐震礬嘛偵涪既搏濾蔬克唱鐮站泳力疽分好蕾泵鴨柴蓑耀咆勵莆嘴喀生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第82頁，共93頁。天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA 時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再

50、除去細胞中的糖，RNA 及無機離子等，從中分離DNA 。 DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。赴哲井書瓜雪寶散褥必摟瑪務繕軸迫置框臉睜扶擅核屏輝頁徐犬貪倚枚性生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第83頁，共93頁。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時，常用此法分離這兩種核蛋白。隕催疏僑噎烙倆目喚等心缺胃豆餃利川溜緊擻質監(jiān)喀僳捎賦襯淘喧勻瓤乘生化實驗技術綜合設計性大實驗生化實驗技術綜合設計性大實驗第84頁，共93頁。2.1.5 細胞的破碎細菌有堅硬的細胞壁，首先要破碎細胞。方法有三種： 機械方法：超聲波處理法、研磨法、 勻漿法；