熒　光　顯　微鏡分類、性質(zhì)和維護(hù)

1、熒光顯微鏡分類、性質(zhì)和維護(hù)基本知識熒光的性質(zhì)保持固有的熒光特性熒光波長激發(fā)波長熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光染色分類：自發(fā)熒光 二次熒光 抗體熒光技術(shù)自發(fā)熒光（不加染色）有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光），但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。二次熒光（用化學(xué)染色）非熒光性的物質(zhì)（蛋白質(zhì)、炭水化合物）用熒光色素染色，由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進(jìn)行觀察。對特定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或細(xì)胞區(qū)別出來而可以觀察到。熒光的種類自發(fā)熒光 二次熒光自發(fā)熒光：物質(zhì)受光激發(fā)產(chǎn)生的固有熒光

2、二次熒光：物質(zhì)借熒光色素受光激發(fā)產(chǎn)生的熒光染 色 不染色 激發(fā)光發(fā)射光抗體熒光技術(shù)（用免疫染色）利用特定的抗原必然和特定的抗體相結(jié)合這一個事實(shí)，有意識地使帶熒光標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗原進(jìn)行抗原/抗體反應(yīng)，這樣兩者的結(jié)合體就能通過抗體的熒光觀察到。 熒光顯微鏡的種類 透射式 落射式熒光的特性（1）熒光的吸收光譜和發(fā)射光譜大致對稱于某軸分布，形成鏡象關(guān)系熒光發(fā)出時不像普通光那樣會產(chǎn)生熱效應(yīng)，它是冷光。熒光的吸收及發(fā)射光譜30-180nm熒光發(fā)光方向與激發(fā)光的方向無關(guān), 它呈球體輻射 。 熒光具有偏振性。一、熒光顯微鏡原理原理： 熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光作

3、為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。 在強(qiáng)烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。 熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為一種激發(fā)標(biāo)本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源。我們之所以能觀察標(biāo)本，不是由于光源的照明，而是標(biāo)本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。 熒光顯微鏡的基本構(gòu)造 ： 由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。 特點(diǎn)熒光： 一般采用超高壓汞燈(50-200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激

4、發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。光源濾光片激發(fā)濾光片：緊靠光源 UV:340-380nm 有色玻璃 V:390-460nm 種類： B:460-500nm 干涉濾色片 G:500-570nm截止濾光片：物鏡與目鏡間阻斷(或壓制)濾光片：吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛。選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。 熒光顯微鏡就其光路來分有兩種： 1 透射式熒光顯微鏡 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反

5、光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱所以對觀察較大的標(biāo)本材料較好。 透射熒光顯微鏡汞燈光源激發(fā)濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡透射熒光顯微鏡原理 目鏡吸收濾色鏡 物鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡 汞燈透射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱優(yōu)點(diǎn)：由于用了暗場聚光鏡，激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 由于上述同樣的原因，任何物鏡都可用于觀察。 用低倍物鏡時，比反射熒光顯微鏡更亮。 缺點(diǎn)：必須正確調(diào)整聚光鏡中心和高度，否則不能獲得明亮的熒光像。 由于暗視場聚光鏡焦距限制，不能使用厚的載玻片。 視

6、場照明區(qū)不能過大，否則容易使熒光標(biāo)本熒光色衰褪。 厚的或不透明的標(biāo)本不適用。 2落射式熒光顯微鏡： 這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45度角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。組成光源：高壓汞燈或鹵素?zé)簟?聚光鏡：因?yàn)槲镧R作為聚光鏡，所以不需要聚光鏡。物鏡：所用的物鏡必須能透過足夠的紫外光，而且本身不產(chǎn)生熒光，對數(shù)值孔徑?jīng)]有

7、限制。標(biāo)本：厚的標(biāo)本或不透明的標(biāo)本都能觀察。汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡熒光顯微鏡下的絲狀細(xì)菌反射熒光顯微鏡原理汞 燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物 鏡 標(biāo) 本優(yōu)點(diǎn)： 由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調(diào)節(jié)。 物鏡數(shù)值孔徑不受限制，在高放大倍率時，也可以獲得高分辨率的像。 厚的或不透明的標(biāo)本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。 其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合。 可以避免不必要的熒光色衰褪現(xiàn)象。 缺點(diǎn)：在用低倍率物鏡時，像比較暗，因此必須用大數(shù)值孔徑的物鏡。 濾光鏡系統(tǒng)必須有效地分離開激發(fā)光和熒光。 激發(fā)熒光的方式： 按光的波長范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明

8、法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。 UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。 BV激發(fā)法是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。 該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍(lán)光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素，對于激發(fā)光的極大吸收波長和熒光的極大發(fā)光波長比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像。 其缺點(diǎn)是500nm以下

9、的熒光無法看到，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發(fā)法的缺點(diǎn)往往影響極大。 熒光顯微鏡的照明可根據(jù)聚光器的構(gòu)造和激發(fā)光的波長按以下三點(diǎn)考慮： 從熒光像的反差要求來看，UV激發(fā)暗場聚光器照明最好。 以像的亮度來考慮，BV激發(fā)濾光片暗場觀察效率最高。 UV激發(fā)濾光片暗場觀察和BV激發(fā)暗場聚光器照明的特性，可看作介于這兩種照明方法之間，但前者濾光片暗場的性質(zhì)較強(qiáng)，顯示圖像較明亮，反差?。缓笳咭虮Ａ舭祱龉饴返男再|(zhì)，故顯示圖像較暗，而反差有所改善。當(dāng)實(shí)際使用熒光顯微鏡時，應(yīng)采用最適合標(biāo)本要求的照明法進(jìn)行觀察。

10、需要注意，即使像反差最佳的UV激發(fā)暗場聚光器照明，由標(biāo)本折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會進(jìn)入物鏡，這樣在光學(xué)系統(tǒng)中的加拿大膠膠合面和光學(xué)玻璃因激發(fā)引起的自身熒光會使像的反應(yīng)變壞。因此，必須在目鏡前面使用紫外吸收濾光片作為截止濾光片（螢石或氟石玻璃）。 三、使 用 方 法 1使用顯微鏡時請保持周圍環(huán)境的清潔。 2打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。使用熒光進(jìn)行觀察時，不要頻繁的開關(guān)熒光電源。開關(guān)間斷時間要保持在2030分鐘以上。 3透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片雙色束分離器阻

11、斷濾片的插塊。4儀器的所有鏡頭均經(jīng)校正，不得擅自拆開，如有灰塵沾在鏡頭上可先用吹風(fēng)球?qū)⒒覊m吹去，再用毛筆拂除。載物臺在不使用時不應(yīng)放置過重的物體，以防止升降機(jī)構(gòu)損壞。 用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。 放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。 使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時，必須用無熒光的特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。顯微鏡使用過后，應(yīng)立即切斷電源。并保持載物臺的清潔。如使用100X油鏡，請?jiān)谑褂煤?，用清潔液清洗?清潔液配比，乙醚：酒精=7：3 觀察熒光: 在示教臺上的熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，可見經(jīng)的丫啶橙熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色) 細(xì)胞器染色激光共聚焦染色四、注意事項(xiàng) 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。 應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查，進(jìn)人暗室后接通高壓穩(wěn)壓器電源，開啟35min后再開啟激發(fā)高壓汞燈，當(dāng)看到高壓汞燈完全亮后，停止激發(fā)，再開始觀察標(biāo)本。 防止紫外線對眼睛的損害，做實(shí)驗(yàn)前將防護(hù)屏放下。 檢查時間每次以1h為宜，超過90min，高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱，標(biāo)本經(jīng)激發(fā)15min后，熒光亦明顯減弱。 熒光