病毒學(xué)研究方法簡介

1、病毒學(xué)研究(ynji)方法簡介共三十一頁生物(shngw)安全實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室研究的病毒危險(xiǎn)性較低，試驗(yàn)人員連口罩都不用帶，穿上白大褂就可以了，試驗(yàn)人員在這里很放松；P2實(shí)驗(yàn)室研究的是中度危險(xiǎn)的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防護(hù)性較好的口罩；P3實(shí)驗(yàn)室研究的是高度危險(xiǎn)的病毒，傳染性很強(qiáng)，而且沒有疫苗，試驗(yàn)人員的保護(hù)措施要比P1/P2實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)密得多；P4實(shí)驗(yàn)室全球級別最高的生物安全實(shí)驗(yàn)室，研究的是極度危險(xiǎn)的病毒，如令人談之色變的埃博拉病毒、馬爾堡病毒，進(jìn)入這種實(shí)驗(yàn)室的工作人員，處于防護(hù)服的嚴(yán)密保護(hù)之下，連空氣都不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)呼吸，紅色(hngs)螺旋狀管子，是專門用來向室內(nèi)輸送新鮮空氣的，

2、試驗(yàn)人員一進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，要先屏住呼吸，馬上接上這種管子，然后才能呼吸。根據(jù)微生物及其毒素的危害程度不同，分為級，一級最低，四級最高。共三十一頁病毒學(xué)研究的主要(zhyo)方法生物學(xué)特性測定:在宿主上的反應(yīng)癥狀、傳播等病毒分離與培養(yǎng)：提純與純化、二元培養(yǎng)法光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應(yīng)(xingyng)抗血清的特異免疫吸附情況免疫學(xué)技術(shù)：以血清學(xué)和組織免疫化學(xué)方法檢測帶毒情況、多克隆抗體、單克隆抗體分子生物學(xué)技術(shù)：核酸分子雜交、PCR等共三十一頁一、生物學(xué)特性(txng)測定 在宿主上的反應(yīng) 宿主范圍、癥狀表現(xiàn)、傳播方式等 病毒的理化性質(zhì)(xngzh) 病毒粒子的形態(tài)、大小、對理化因子的耐受

3、性、 體外存活期等 病毒接種方法 注射接種、病毒組織培養(yǎng)技術(shù) 植物病毒汁液摩擦接種、昆蟲介體接種、嫁 接接種、菟絲子接種法等共三十一頁共三十一頁巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞的典型(dinxng)“貓頭鷹眼”樣核內(nèi)包涵體共三十一頁冠狀病毒感染“非典”X線胸部檢查(jinch)可見肺部不同程度的片狀陰影，少數(shù)病人進(jìn)展迅速，呈大片狀陰影，大多數(shù)為雙側(cè)改變，陰影吸收消散較慢。 共三十一頁TMV transmission by an Apis sp. A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV)腿色斑(s bn)Chlorotic spoting黃化(hun hu)Ye

4、llowing病毒檢測共三十一頁二、病毒的分離(fnl)與鑒定提純(tchn)extraction/純化purification 共三十一頁病毒(bngd)的分離與鑒定動物接種組織培養(yǎng)標(biāo)本采集標(biāo)本處理后接種雞胚接種卵黃囊膜尿囊液羊膜腔液絨毛尿囊膜觀察囊膜病變血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)CPEEM包涵體空斑試驗(yàn)紅細(xì)胞吸附中和試驗(yàn)觀察發(fā)病抗原檢測抗體檢測病理檢查共三十一頁 病毒的提純是將宿主中的病毒粒子與宿主細(xì)胞組分區(qū)分開來的過程。 原理是利用病毒的蛋白質(zhì)和大分子粒體的特性(txng)，及其與宿主細(xì)胞組分在理化特性(txng)上的差異將病毒粒子區(qū)分出來，并盡可能保持侵染力。 目的是確切地研究病毒理化、生物

5、學(xué)特性、化學(xué)組分、組成、增殖過程及機(jī)制，還可用于制備高效價(jià)的抗血清。共三十一頁1953年，斯坦利第一次提取并結(jié)晶(jijng)了 TMV，這是病毒學(xué)史上一個(gè)重要的里程碑。共三十一頁（一）病毒的純化(chn hu)與提純一般純化方法動物病毒的純化：從空斑、病斑分離，用終點(diǎn)稀釋法植物病毒的純化：如確定是一種病毒，且可機(jī)械(jxi)摩擦接種，則接種到適當(dāng)寄主上；如可能有多種病毒，則要嫁接傳染，先將病毒保存，然后試用蟲媒或其他方法分離。二、病毒的分離與培養(yǎng)共三十一頁1、差速離心和密度梯度離心 差速離心：交替使用高速和低速(d s)離心高速離心（4000080000g）使病毒沉淀，取沉淀低速離心（約40

6、00g）僅去除大的細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，取上清 密度梯度離心：部分或完全根據(jù)顆粒在一個(gè)無對流介質(zhì)中的密度而獲得分離 蔗糖10%40% CsCl等（三）病毒提純(tchn)的技術(shù)二、病毒的分離與培養(yǎng)共三十一頁 2、沉淀法 簡便快速但粗糙易變性鹽析法 硫酸銨濃度達(dá)3050%飽和度時(shí)多數(shù)病毒沉淀等電點(diǎn)沉淀 加醋酸或鹽酸丙酮(bn tn)沉淀 濃度達(dá)4070%聚乙二醇沉淀 濃度達(dá)48%乙醇沉淀 濃度達(dá)20% 沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸 銨沉淀3、吸附法 磷酸鈣、離子交換樹脂、羧甲基纖維素4、酶處理 許多病毒抗蛋白酶和核酸酶（三）病毒提純(tchn)的技術(shù)二、病毒的分離與培養(yǎng)共三十一頁5、有機(jī)(yuj)溶劑萃

7、取有機(jī)溶劑可溶掉脂肪、有色雜質(zhì)或非病毒的變性蛋白，如脊髓灰質(zhì)炎病毒提純中用正丁醇：要考慮病毒對有機(jī)溶劑的耐受性（三）病毒提純(tchn)的技術(shù)脂肪變性非病毒蛋白病毒水醇二、病毒的分離與培養(yǎng)共三十一頁6、電泳法 普通電泳、密度梯度電泳、等電聚焦電泳等7、柱層析法 吸 附：用離子交換或吸附法 分子篩：瓊脂糖或葡聚糖制成凝膠柱8、抗血清處理 針對宿主蛋白的血清(xuqng)來沉淀雜蛋白 加病毒的抗血清形成病毒抗體復(fù)合物（三）病毒(bngd)提純的技術(shù)二、病毒的分離與培養(yǎng)共三十一頁 要證明某種疾病是某一感染因子所引起則必須滿足Rivers法則(fz)： 從患病者體內(nèi)分離出病毒； 在實(shí)驗(yàn)動物或寄主細(xì)胞中

8、可以培養(yǎng)； 證明這種培養(yǎng)物具有濾過性； 在原始宿主或相關(guān)種內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥； 能重新分離出病毒。病毒的分離與鑒定組成了病毒學(xué)診斷技術(shù)的主體。病毒分離(virus isolation)是診斷病毒感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”(goldstandard)。二、病毒(bngd)的分離共三十一頁病毒(bngd)的分離組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)(piyng)動物接種共三十一頁 組織培養(yǎng)：原代細(xì)胞：新鮮組織(zzh)+胰蛋白酶消化，分散+培養(yǎng)液 成單層細(xì)胞二倍體細(xì)胞株：原代細(xì)胞傳代（為二倍體細(xì)胞）傳代細(xì)胞系：腫瘤組織或二倍體細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化（非整倍體）二、病毒的分離(fnl)與培養(yǎng)共三十一頁卵黃囊接種：用58d雞胚，以細(xì)長針由氣室

9、端刺入卵黃囊，孵育后收集卵黃囊膜檢查。常用于一些嗜神經(jīng)病毒羊膜(yngm)腔：用1214d雞胚，將檢材注入羊膜腔，孵育后取羊水檢查。常用于流感病毒的初次分離尿囊腔：用912d雞胚，將標(biāo)本接種于尿囊腔，孵育后取尿囊液檢查。常用于培養(yǎng)流感病毒和腮腺炎病毒等絨毛尿囊膜：用1012d雞胚，無菌下開一小窗，將材料滴在絨毛尿囊膜上，孵育后觀察膜上有無斑點(diǎn)病變。常用于培養(yǎng)單純皰疹病毒，天花病毒和痘病毒雞胚接種(jizhng)絨毛尿囊膜痘病毒特異性損傷共三十一頁3. 動物(dngw)接種常用動物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒對動物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。接種途徑(tjng) 按病毒侵

10、襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬病毒 小鼠腦內(nèi)接種柯薩奇病毒 乳鼠腹腔接種乙肝病毒 黑猩猩靜脈注射流感病毒 鼻腔滴種用途 分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清共三十一頁標(biāo)本制備 濃縮標(biāo)本有以下幾種方法： 超速離心 離心的時(shí)間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的半徑(bnjng)，一般是30min到3h沉淀的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網(wǎng)上； 超過濾法 用于分子篩的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為10000； 接種細(xì)胞 接種細(xì)胞增殖病毒，然后快速包埋、切片； 免疫凝集 如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮病毒三、病毒(bngd)的光鏡與電鏡觀察法光 鏡：宿主組織切片、包涵體共三十一頁三、

11、病毒(bngd)的電鏡觀察法1、正染法（超薄切片法、病組織）將細(xì)胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察病毒顆粒，通常12 d完成。操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，但樣品可長期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)生過程。2、負(fù)染法直接將病毒懸液(也可用細(xì)胞)滴在銅網(wǎng)上，用重金屬(通常用磷鎢酸)進(jìn)行染色，觀察病毒顆粒，10-20min可出結(jié)果。原理：負(fù)性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負(fù)性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有亮度，在周圍暗背景上顯示亮區(qū)較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)(qudin)：敏感性低，要求病毒量在107mL以上，同科病毒難于鑒別。3、投影技術(shù)4、膠體金標(biāo)記

12、技術(shù)、與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合等共三十一頁采用幾種電鏡技術(shù)(jsh)觀察病毒粒子的形態(tài)Orf virus：口瘡(kuchung)病毒(接觸性膿皰皮炎)Ebola virus埃博拉病毒（正染技術(shù)）Vaccinia virus 痘苗病毒（投影技術(shù)）負(fù)染技術(shù)共三十一頁美國(mi u)疾病控制和預(yù)防中心公布的一張未標(biāo)明日期的彩色電子顯微照片。它顯示出H5N1型禽流感病毒（金黃色）在MDCK細(xì)胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動狀態(tài)共三十一頁電鏡技術(shù)(jsh)的應(yīng)用研究病毒形態(tài)、鑒定 觀察病毒的形態(tài)及形態(tài)發(fā)生學(xué)過程；亞顯微結(jié)構(gòu)；病毒與宿主細(xì)胞的關(guān)系；病毒感染細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變；病毒的分類等。診斷病毒病 檢測不能在體外培養(yǎng)(

13、piyng)的病毒，如輪狀病毒、星狀病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用電鏡最先發(fā)現(xiàn)的能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的病毒和病毒病。共三十一頁四、免疫學(xué)技術(shù)(jsh)1、病毒抗原(kngyun)2、病毒抗體3、免疫學(xué)診斷方法免疫熒光法(IF)免疫酶法（ELISA）單克隆抗體技術(shù)血凝抑制（HI）試驗(yàn)血凝試驗(yàn)HA瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)共三十一頁五、病毒(bngd)抗原檢查可檢測細(xì)胞內(nèi)、外的游離病毒抗原。敏感、特異，簡便、快速(kui s)。適用于多種病毒性疾病的早期快速(kui s)診斷。Influenzavirus A培養(yǎng)物DFA染色陽性 生殖道HSV-2涂片DFA染色陽性共三十一頁五、分子生物學(xué)技術(shù)(jsh)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 核酸(h sun)分子雜交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot蛋白質(zhì)組學(xué)基因組學(xué)：核酸序列測定及基因功能基因工程 ：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子多肽 、病毒載體共三十一頁內(nèi)容摘要病毒學(xué)研究方法簡介。生物學(xué)特性測定:在宿主上的反應(yīng)癥狀、傳播等。病毒分離與培養(yǎng)：提純與純化(chn hu)、二元培養(yǎng)法。光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應(yīng)抗血清的特異免疫吸附情況。高速離心（40