分子診斷的臨床應用現狀和展望

1、分子診斷的臨床應用現狀和展望分子診斷技術及臨床應用3Bridging a Historical Divide蛋白RNADNA蛋白RNADNA細胞生物學分子生物學 藥物 組織 / 器官 生理-病理學臨 床 診 斷 分 子 診 斷轉歸 預后 精準治療對分子診斷整體需求正常對照隱匿病例基因型、表型傳統的流行病學調查腫瘤風險預測模型的建立確診病例基因型、表型臨床病理因素治療療效數據預后隨訪信息預后預測藥物療效預測藥效學評估腫瘤早期干預治療方案選擇藥物選擇治療劑量調整分子診斷與個體化治療癌癥分子診斷和分型。隨著人類基因組計劃完成、HapMap計劃和蛋白組計劃的進行而產生了新的學科和臨床診療手段，利用基因

2、結構和表達變化，在分子水平上對癌癥進行診斷和分類；癌癥的個體化治療。個體化治療是“分子醫(yī)學”時代的特點。某種藥物只對有著特定基因變異的特定患者群有療效。確定不同癌癥患者的分子改變，在選擇治療方案時真正做到“對癥（分子）下藥”；癌癥個體化治療（靶向治療）的前提就是明確腫瘤的特異靶基因變異類存在與否和變異類型。臨床常用分子診斷技術免疫組織化學（IHC）技術檢測蛋白分子原位雜交DNA，RNA熒光原位雜交（FISH）技術DNA，RNA熒光定量PCRDNA，RNADNA測序技術DNA突變生物芯片技術DNA，RNA，蛋白質等1. 基于熒光定量PCR技術的檢測項目名稱檢測意義EGFR基因突變EGFR-TKI

3、靶向篩選KRAS基因突變EGFR-TKI靶向篩選BRAF基因突變惡黑、甲狀腺癌靶向篩選、腸癌預后預測PIK3CA基因突變腸癌、乳腺癌預后預測病原體核酸定量EBV、HBV拷貝數診斷、復發(fā)監(jiān)測ERCC1 RRM1表達量分析鉑類、紫杉醇療效預測2. 基于FISH技術的檢測檢測項目檢測意義HER2擴增herceptin靶向篩選EGFR拷貝數EGFR-TKI靶向篩選ALK斷裂Crizitinib靶向篩選N-myc擴增NB預后1p、19q缺失膠質瘤輔助診斷、用藥指導尿路上皮脫落細胞染色體異常血尿篩查BCR-Abl融合慢粒輔助診斷、Imatinib靶向篩選hTERC擴增CIN轉歸SS18斷裂滑膜肉瘤輔助診斷

4、IGH/BCL2染色體易位淋巴瘤輔助診斷EWS斷裂PNET輔助診斷PAX3-FKHR易位腺泡狀橫紋肌肉瘤輔助診斷3. 基于測序技術的檢測技術名稱檢測項目檢測意義測序EGFREGFR-TKI靶向篩選CKIT、PDGFRAImatinib靶向篩選UGT1A1等SNPCPT-11等化療毒性預測NORCH1、FWT7突變兒童T細胞淋巴瘤預后預測IDH1突變間變膠質母細胞瘤預后預測片段分析技術微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測2期腸癌5FU化療預測Lynch綜合征篩查毛細管電泳技術淋巴瘤Ig、TCR基因重排淋巴瘤輔助診斷4. 基于高通量技術的檢測技術名稱檢測項目檢測意義基于基因芯片技術的腫瘤多基因突變分型檢測19個基因

5、靶向篩選二代測序BRCA1/2、APC突變基因組測序基因突變套餐式檢測風險預測乳腺癌分子診斷與個體化治療Her-2基因擴增；Top-2A基因缺失和擴增；ER, PR表達與內分泌治療；BRCA1、BRCA2基因突變檢測；ERCC1等基因表達定量分析；實現篩查、治療、預后評估綜合防治目標靶向篩選HER2化療預測TOP2A易感篩查BRCA1/221基因表達譜乳腺癌-關愛她人1.000.750.500.25 0累計生存率0 24 48 72 96 120 144無擴增擴增基因擴增: 10 拷貝數無基因擴增: 3拷貝數臨界值: 不包括死亡時間 (月數)Log rank p0.001Ross JS, Fl

6、etcher JA. Stem Cells 1998; 16: 413428淋巴結陰性Seshadri R et al. J Clin Oncol 1993;11:1936421008060402000 12 24 36 48 60 72無病生存概率死亡時間 (月數)HER2 基因 3 拷貝數HER2基因 3 拷貝數對數秩檢驗 p=0.001淋巴結陽性 HER-2擴增患者無病生存期縮短2007 NCCN 治療指南HER2檢測的原則統計Ratio值（計數浸潤性部分的30個細胞）HER2基因未擴增（ Ratio 1.8）多體性不擴增（ Ratio 2.2或排列呈簇狀）多體性擴增（ Ratio 2.

7、2）HER2 基因檢測結果示意圖Her-2基因無擴增情況紅信號數2，同時綠信號非整倍體R30%的腫瘤細胞全部的細胞膜高強度著色免疫組化（3+）與FISH對比 40100住院號：177319浸潤性導管癌級IHC：+FISH：呈簇團狀高度擴增100免疫組化（2+）與FISH對比30%的腫瘤細胞全部的細胞膜弱至中等著色40浸潤性導管癌級IHC：+FISH：Ratio5，中度擴增100免疫組化（）與FISH擴增陽性浸潤性導管癌級IHC：FISH：呈簇狀擴增腫瘤細胞不著色40100我院已完成HER2檢測1140病例小結推薦HER2檢測流程FISH3+0/1+2+IHCFISH重新檢測-+赫賽汀 治療赫賽

8、汀 治療-+赫賽汀 治療腫瘤標本（石蠟包埋）FISH重新檢測+消化系統腫瘤胃 癌 HER2 C-met FGFR2腸 癌 KRAS/BRAF/PIK3CA/PTEN MSI、MMR UGT1A1 15基因表達GIST C-KITPDGFRA肝癌 HBV-DNAHCV-RNA “老靶新用“靶向篩選遺傳篩查化療預測預后生存NCCN指南提及的與腸癌治療相關的分子指標Fodde R, et al. Nature Rev Cancer 2001;1:556740%的CRC具有KRAS基因突變KRAS基因突變是CRC發(fā)生的早期事件BRAF絲/蘇氨酸特異性激酶轉導因子：RAS/RAF/MEK/ERK/MAP

9、K與KRAS不同時發(fā)生突變突變類型：90% exon15 T1799A V600E 10% exon11 甘氨酸環(huán)腸癌BRAF MT 10%BRAF MT 患者對抗EGFR治療無效PFS、OS差PIK3CA在結直腸癌中，PI3K信號通路中PIK3CA基因突變率最高，在總體CRC人群占到15%，集中在9號(60-65%)和20號外顯子(20-25%)。PIK3CA突變對抗EGFR單抗的預測作用，研究結果不一致PI3CK突變率低，與KRAS基因突變并不互相排斥，對抗EGFR單抗的療效預測作用尚未應用于臨床PTEN變異在結直腸癌患者中，PTEN基因突變占5%，在MSI-H人群中突變率更高。20%40

10、% 結直腸癌患者存在PTEN 缺失PTEN基因缺失往往和KRAS、BRAF和PI3K基因突變同時發(fā)生近年來，PTEN 蛋白表達與抗EGFR單抗的療效的關系也得到廣泛關注；PTEN 缺失對抗EGFR單抗的預測作用同樣沒有用于臨床PRIME “RAS野生/突變”新定義RAS 突變患者數增加了12%的絕對值WT KRAS患者中，約20%患者存在NRAS突變，無法從加用帕尼單抗中獲益Oliner KS, et al. 2013 ASCO Abstract 3511.外顯子1外顯子2外顯子3外顯子4NRAS外顯子1外顯子2外顯子3外顯子4KRAS1213596111714612135961117146外

11、顯子1外顯子15外顯子16BRAF600PRIME 分子標志物分析：帕尼單抗+FOLFOX組RAS MT患者的生存結果不如FOLFOX組很可能，帕尼單抗在MT RAS患者中這一顯著不利影響將促使其在說明書中增加相關警告Oliner KS, et al. 2013 ASCO Abstract 3511.MT：任何KRAS或NRAS外顯子2,3和4突變HR = 1.25 p=0.04 HR= 1.31p=0.01 (n=276)(n=272)中位 (月)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability, MSI）腸癌MSI分子標志物檢測10-15%1%80+%FAP散發(fā)型微衛(wèi)星

12、不穩(wěn)定(Microsatellite Instability)染色體不穩(wěn)定CIN (Chromosome Instability)HNPCC散發(fā)型 MSI(+)MMR 胚系突變 MLH1MSH2MSH6PMS215-20%2 to 5% MMR MLH1 啟動區(qū)甲基 多年長80-85%APC, p53, DCC, kras, LOH,.APC 胚系突變 IHC法檢測MMR蛋白狀態(tài)PCR法檢測腫瘤DNA MSI胃癌Her-2基因擴增亞組中位 OS (月)全部11.1 vs 13.8預先計劃分析 IHC 0 / FISH+IHC 1+ / FISH+IHC 2+ / FISH+IHC 3+ / F

13、ISH+IHC 3+ / FISH7.2 vs 10.610.2 vs 8.710.8 vs 12.312.3 vs 17.917.7 vs 17.5探索性分析 IHC 0 or 1+ / FISH+IHC 2+ / FISH+ or IHC 3+8.7 vs 10.011.8 vs 16.0123450.921.240.750.580.830.48, 1.760.70, 2.200.51, 1.110.41, 0.810.20, 3.38HR95% CI 0.740.60, 0.911.070.650.70, 1.620.51, 0.83相對危險度傾向赫賽汀傾向無赫賽汀58

14、4617015925615131446N根據HER2狀態(tài)進行的探索性療效交互分析， p=0.0368van Cutsem E, et al. J Clin Oncol 2009; 27:Abstract 4509.HER2 狀態(tài)對總生存期（OS）的影響IHC（Dako）抗體檢測 HER2蛋白表達IHC 3+: 10% 的細胞中至強、完整的膜或基底側 面膜著色FISHDNA 探針檢測HER2基因擴增FISH+：HER2:CEP17 ratio 2HER2-陽性定義為： IHC 3+ 和/或 FISH+ToGA研究：HER2 檢測手段0FISH+可接受赫賽汀治療可接受赫賽汀胃癌治療的歐盟標準+1+

15、2+3IHC腫瘤標本Herceptin EU SmPC: http:/www.ema.europa.eu/humandocs/PDFs/EPAR/Herceptin/emea-combined-h278en.pdf.肺癌化療敏感預測?靶向藥物敏感性EGFR突變（Seq等）EGFR擴增（FISH）ALK-EML4（FISH）ROS1（FISH）KIF5B-RET（FISH）靶向藥物耐藥性EGFR T790M（Seq等）C-met擴增（FISH）PTEN缺失（FISH）KRAS，BRAF，PIK3CA突變？MassARRAYWhole Genome Seq驅動基因篩查化療敏感性非小細胞肺癌基因變異

16、類型常見基因變異類型基因突變融合基因基因擴增或缺失常用檢測技術ALK-EML4， RET， ROS1融合基因, C-Met，EGFR，FGFR1擴增；PTEN缺失EGFR， KRAS， BRAF， PIK3CA，BIM缺失 定量PCR基因分型及定量熒光原位雜交（FISH）Sanger測序、高通量測序免疫組化技術非小細胞肺癌個體化治療分類基礎傳統病理分型腺癌鱗狀細胞癌大細胞癌基因分型EGFR Mut+BRAF MutKRAS Mut+PIK3CA Mut+ALK Fus+RET Fus+ROS1 Fus+MET Ampli+EGFR Ampli+FGFR Ampli+EGFR基因突變檢測EGFR

17、 mutations in lung adenocarcinomaSharma, Nat Rev Cancer, 2007突變位點分布不同標本檢測情況標本類型分布 （手術/穿刺/支氣管鏡/胸水） 標本類型例數成功檢出陽性檢出手術標本19491933（99.2%） 637（33.0%）活檢或穿刺標本10921057（96.8%） 416（39.3%）胸水2020（100%）6 （30%）匯總30613000（98.0%） 1059（35.3%） 不同標本EGFR基因突變檢出率356例NSCLC（腺癌）EGFR突變43個亞型檢出率及分布野生型突變型檢出例數169187比例169/356（47.47

18、%）187/356（52.5%）E18 G719XE19 DelE20 S768IE20 T790ME20 InsE21 L858R檢出例數67641897比例6/18776/1874/1871/1878/18797/187百分比3.20%40.64%2.14%0.53%4.27%51.87%中國人群的EML4-ALK融合基因？Ros 1融合基因？RET融合基因？肺癌的分子靶向基因肺癌分子靶向基因的回顧和展望ALK融合基因的檢測ROS1融合基因的檢測RET融合基因的檢測47Best tumor response to crizotinib by patient80604020020406080

19、100Change from baseline (%)PDPRSDCR30%1020304050607079SubjectKwak et al. New Engl J Med. 2010;363:169303ALK為肺癌亞型的分子標志物無EGFR和KRAS基因突變?腺癌病人非或極輕度吸煙者年輕 NSCLC肺癌中ALK陽性率約為3%-7%?每年有40,000例NSCLC肺癌病人ALK陽性肺癌亞型分子標記物ALK融合基因IHC法和2種FISH法檢測結果ALK融合基因和臨床病理參數的關系例數總病例 ALK陰性 ALK陽性 P Value病理類型(%)398364（91.5）34（8.5）腺癌308(

20、77.4)277(76.1)31(10)0.124鱗癌72(18.1)70(19.2)2(2.8)其他18(4.5)17(4.7)1(2.9)性別(%)男244(61.3)227(62.4)17(7)0.157女154(28.7)137(37.6)17(11)年齡（中位數/%）58215(54.0)192(52.7)23(11)0.09558183(46.0)172(47.3)11(6)分化類型高21（5.3）21（5.8）0（0.0）0.351中140（35.2）127（34.9）13（9.3）低237（59.5）216（59.3）21（8.9）臨床分期(%)+ 184(46.2)174(4

21、7.8)10(5.4)0.040 +214(53.8)190(52.2)24(11.2)吸煙狀況（%）不/曾吸煙233（58.5）206（56.6）27（11.6）0.010 吸煙165（41.5）158（43.4）7（4.2）EGFR檢測(%)38134932EGFR陰性248(65.1)219(62.8)29(11.7)0.002EGFR陽性133(34.9)130(37.2)3(2.2)ALK融合基因的qRT-PCR法和測序法檢測結果中國地區(qū)ALK-EML4融合基因陽性率QRT-PCR方法：12%測序法：9.4%EML4-ALK融合探針FISH法：8%Abott ALK分離探針FISH法

22、：5%肺癌的分子靶向基因肺癌分子靶向基因的回顧和展望ALK融合基因的檢測ROS1融合基因的檢測RET融合基因的檢測NSCLC融合基因: ROS1基因文獻報道NSCLC中ROS1基因重排陽性檢測率為0.8%-1.7%多見于年輕，不/少吸煙，腺癌和其他融合基因無重疊ROS1基因重排可引起癌基因ROS1融合激酶的表達及對ROS抑制劑敏感性靶向藥物Crizotinib對ROS1基因重排有效常見融合類型（8個基因11個亞型）基因類型TPM3-ROS1TPM3 exon 10:ROS1 exon 35SDC4-ROS1 SDC4 exon 2:ROS1 exon 32SDC4-ROS1 SDC4 exon

23、 4:ROS1 exon 32SDC4-ROS1 SDC4 exon 4:ROS1 exon 34SLC34A2-ROS1SLC34A2 exon 13:ROS1 exon 32CD74-ROS1 CD74 exon 6:ROS1 exon 32CD74-ROS1 CD74 exon 6:ROS1 exon 34 EZR-ROS1 EZR exon 10:ROS1 exon 34LRIG3-ROS1 LRIG3 exon 17:ROS1 exon 35CCDC6-ROS1 CCDC6 exon 6:ROS1 exon 34GOPC-ROS1 GOPC exon 7:ROS1 exon 35RO

24、S1融合基因分子檢測ROS1融合基因和臨床病理參數的關系肺癌的分子靶向基因肺癌分子靶向基因的回顧和展望ALK融合基因的檢測ROS1融合基因的檢測RET融合基因的檢測經驗總結KIF5B-RET融合多國報道檢出率0.8-2.0%都發(fā)生于肺腺癌主要見于非吸煙患者與其他驅動突變無交叉重疊目前無特異性RET-TKI常見融合類型（3個基因9種亞型）基因類型KIF5B-RETKIF5B exon 15:RET exon 12KIF5B exon 16:RET exon 12KIF5B exon 23:RET exon 12KIF5B exon 24:RET exon 8KIF5B exon 22:RET e

25、xon 12KIF5B exon 24:RET exon 11KIF5B exon 15:RET exon 11CCDC6-RETCCDC6 exon 1:RET exon 12NCOA4-RET NCOA4 exon 6:RET exon 12RET融合基因分子檢測RET融合基因和臨床病理參數的關系6%4%鼻咽癌EBV-DNA頭頸鱗癌HPV甲狀腺癌驅動基因BRAF、RET傳統優(yōu)勢項目HPV檢測新天地讓好的更好一些頭頸腫瘤血漿EBV-DNA定量分析在鼻咽癌臨床工作中的應用（一）鼻咽癌診斷鼻咽癌病人血漿EBV-DNA陽性率為97%（282/299），正常對照人群陽性率為12%（18/160），鼻

26、咽癌治療后陽性率為20% （39/120）。對初治鼻咽癌患者，血漿EBV-DNA對NPC診斷的敏感性為97，特異性為88%。 （二）鼻咽癌鑒別診斷62例鼻咽癌頸部淋巴結轉移的病人血漿EBV-DNA陽性率為97%，中位濃度為24473拷貝/ml；80例非鼻咽癌頸部淋巴結轉移癌病人陽性率為13%；中位濃度為0拷貝/ml；50例頸部淋巴結炎癥病人陽性率為12%，中位拷貝為0拷貝/ml。血漿EBV-DNA定量檢測在鼻咽癌臨床應用總結血漿EBV-DNA測定對鼻咽癌的診斷和鑒別診斷不僅有高度敏感性（90%以上），特異性也強（不低于85%）。鼻咽癌臨床TNM分期的發(fā)展與病人血漿EBV-DNA濃度呈顯著正相關

27、，能較好反映腫瘤TNM分期的進展，可在分子水平補充傳統臨床分期的不足。鼻咽癌病人治療后持續(xù)緩解的病人，如果血漿EBV-DNA濃度突然升高，預示腫瘤復發(fā)和轉移可能性很大。鼻咽癌經治療后血漿EBV-DNA快速轉陰（約80%），因此治療過程中動態(tài)觀察血漿EBV-DNA水平能夠協助評價治療效果，對持續(xù)陽性的病人要采取進一步的治療措施。治療前血漿EBV-DNA水平高的病人較水平低的病人預后生存差。定量檢測血漿EBV-DNA方法簡便，無創(chuàng)傷性，應用前景好。分子診斷在軟組織肉瘤診斷和分型中的應用最早發(fā)現的人類腫瘤遺傳異常Ewings Sat(11;22)(q24;q12)CMLt(9;22)(q34;q11

28、.2)Aurias A, et al. N. Engl. J. Med. 309:496-497, 1983.Turc-Carel C, et al. N. Engl. J. Med. 309:497-498, 1983.Delattre O, et al. Nature 359:162-165, 1992.Nowell PC, et al. Science 123: 1497-1500, 1960.Rowley JD. Nature 243:290-203, 1973.Groffen J, et al. Cell 33:93-99, 1984.Ph Chromosome P. Nowell

29、, et al. JNCI 25:85-109 , 1960.Tumor typeCytogenetic TranslocationGenes involvedES/PNET促纖維圓細胞腫瘤骨外黏液樣軟骨肉瘤 透明細胞肉瘤腺泡狀橫紋肌肉瘤黏液樣脂肪肉瘤滑膜肉瘤腺泡狀軟組織肉瘤隆突性皮膚纖維肉瘤低級別纖維黏液瘤血管瘤樣 惡性) 纖維組織細胞瘤 先天性纖維肉瘤 (中胚層腎瘤)內膜樣間質肉瘤炎性肌纖維母細胞瘤t(11;22) (q24;q12)t(21;22) (q22;q12)t(7;22) (p22;q12)t(2;22) (q33;q12)t(17;22) (q12;q12)inv(22)t(

30、16;21)(p11;q22) t(11;22) (p13;q12)t(9;22) (q22;q12)t(9;17) (q22;q11)t(9;15) (q22;q21)t(12;22) (q13;q12)t(2;22)(q33;q12) t(2;13) (q35;q14)t(1;13) (p36;q14)t(12;16) (q13;p11)t(12;22) (q13;q12)t(X;18) (p11;q11)t(X;17) (p11.2;q25)t(17;22) (q22;q13)t(7;16) (q32-34;p11)t(11;16)(p11;p11)t(2;22)(q33;q12)t(1

31、2;16) (p11;q13)t(16;22) (q13;q12)t(12;15) (p13;q25)t(7;17) (p15;q21)translocations at 2p23EWSR1-FLI1EWSR1-ERGEWSR1-ETV1EWSR1-FEVEWSR1-E1AFEWSR1-ZSGFUS-ERG EWSR1-WT1EWSR1-CHNRBP56-CHNCHN-TCF12EWSR1-ATF1EWSR1-CREB1 PAX3-FKHRPAX7-FKHRFUS(TLS)-CHOPEWSR1-CHOPSSX1-SYTSSX2-SYTASPL-TFE3COL1A1-PDGFBFUS-CREB3

32、L2FUS-CREB3L1EWSR1-CREB1FUS-ATF1EWSR1-ATF1ETV6-NTRK3JAZF1-JJAZ1ALK, multiple fusion partners軟組織肉瘤特征性細胞遺傳學改變一覽Ewings 肉瘤/PNET診斷和鑒別診斷 臨床特征好發(fā)于青年、長骨 胸壁軟組織、椎旁、 腹膜后、肢端影像學特征 破壞性 parameative lesion involving 長骨骨干、骨盆、胸壁 病理學特征富含糖原的原始間葉細胞、菊形團結構超微結構特點：原始間葉細胞, 糖原沉淀、神經分化 分子遺傳學特征t(11:22) (q24;q12), FLI-1-EWSR1融合; t

33、(21;22) (q24;q12), ERG-EWSR1融合; t(7;22) (p22;q12), ETV1-EWSR1融合Ewings Sarcoma融合基因PrototypicFISH技術 （融合探針）FLI-1 Probe (green)EWS/FLI-1 FusionEWS Probe (red)滑膜肉瘤診斷SYT（SS18）基因斷裂檢測滑膜肉瘤（Synovial Sarcoma, SS）臨床特征好發(fā)于青年 占所有軟組織肉瘤的5%-10% 好發(fā)于肢端 病理特征2種細胞形態(tài)：上皮細胞和梭形細胞亞型: (1)雙向型, (2) 纖維型, (3) 上皮型 分子遺傳你學特征t(X;18) (1

34、1.23; 11.2)易位; SYT-SSX1/SSX2融合基因形成SYT-SSX1 融合基因與蛋白SSXRDKRABControlSYT RearrangementGreenRedDual Color Break Apart SYT 18q11.2 ProbeACBA: 滑膜肉瘤B: 纖維肉瘤AB黏液樣圓細胞型脂肪肉瘤(myxiodround cell liposarcoma，MRCL)脂肪肉瘤主要類型之一95%的MRCLs存在染色體易位t(12;16)(ql3;pl1)，形成FUS-CHOP融合基因脂肪肉瘤診斷CHOP基因斷裂檢測檢測探針： LSICHOP Dual Color Break

35、-Apart Probe 無CHOP易位 有CHOP易位2個緊密相鄰的紅綠信號或疊加的部分呈黃色1對紅綠信號分離1對紅綠信號緊密相鄰A: CHOP基因斷裂，綠點呈散沙樣B: CHOP基因斷裂，2O2GC: CHOP基因無斷裂A：MRCLB：MRCLB：高分化C：去分化分子診斷在淋巴瘤輔助診斷和分型的應用3號染色體bcl-6基因bcl-6bcl-6探針35斷裂基因多拷貝雜交正 常 異 常結果觀察與解讀雙色分離重排探針(bcl-6 BA）14（灰）號和18號（黑）染色體IgHBcl2IGH/BCL2探針I(yè)gH基因Bcl-2基因雜交正 常 異 常融合基因擴增結果觀察與解讀雙色雙融合易位探針( IGH

36、/BCL2）淋巴造血系統腫瘤預后評估個體化治療治療檢測輔助診斷分類疾病名稱檢測項目白血病APLPML-RARa融合基因定性、定量ANLLAML1-ETO、MLL（11q23）5q-/-5，7q-/-7，+8，20q-，t（6；9），t（9；22），t（9；11），inv16/t(16;16)，Inv3/t(3;3)MLLBCR-Abl、t（12；21）TEL-AML1基因MLL（11q23）、IgH、TCR重排CMLBCR-AblCLL12，11q-，17p-，13q14.3/13q34淋巴瘤FL、MCL、MALT、BurkittIgH/BCL2、IgH/CCND1、IgH/MYC、IgH/M

37、ALTDLBCLBCL6ALCLALK漿細胞疾病 MMt（11；14），t（4；14），t（14；16），RB1（13q14），17p-骨髓增生疾病MPNJAK2-V617F基因突變、JAK2基因exon12、13突變MDS5q-/-5，7q-/-7，+8，20q-淋巴瘤類型染色體易位發(fā)生頻率涉及基因FLt（14；18）（q32；q21）90%IGH -BCL2t（3；14）（q27；q32）及變異型5-15%BCL6-IGHMCLt（11；14）（q13；q32）95%CCND1-IGHMALTt(11;18) (q21;q21)15-40%API2/MALT1 t(14;18)(q32；q

38、21)20%IGH-MALT1BLt（8；14）（q24；q32）85%MYC-IGHt（2；8）（p12；q24）10%IGK-MYCt（8；22）（q24；q11）5%MYC-IGLDLBCLt（14；18）（q32；q21）20-30%IGH-BCL2t（8；14）（q24；q32）10%MYC-IG （nonIG）t（3；14）（q27；q32）30%BCL6-IGH BL/DLBCLt（8 q24）35-50%MYC-nonIGt(14；18)(q32；q21)15%IGH-BCL2t（3 q27 ）？BCL6漿細胞瘤t(11；14)(q13；q3220-25%CCND1-IGHAL

39、K+ ACLCt（2；5）（p23；q35）及變異型100ALK -NPM 按淋巴瘤瘤種區(qū)分的染色體易位及相關基因 按染色體易位區(qū)分淋巴瘤瘤種 涉及基因淋巴瘤類型發(fā)生頻率IGH -BCL2FL70%DLBCL20-30%BL/DLBCL15%CCND1-IGHMCL95%漿細胞瘤20-25%API2/MALTIGH/MALTMALT（胃）15-40%MALT（肺、眼、涎腺）20%IGH-MYCBL85%DLBCL10%BL/DLBCL5%BCL6DLBCL30%BL/DLBCL?ALKALK+ ACLC100不同類型的淋巴瘤染色體易位類型不同優(yōu)點-適用于形態(tài)學上難以診斷且IHC結果不理想的標本

40、；-適用于細胞數量少，形態(tài)不典型的活檢及穿刺組織。必須結合組織形態(tài)學和IHC結果作最后診斷！FISH檢測染色體易位在淋巴瘤分型中的應用病例1：會診84363，男，74y 腹腔腫物；FISH：54%的細胞可見融合信號； 診斷：FL-級。4401001040病例3: 399318，女、5y 頸淋巴結活檢； ISH: EBERs（+）； FISH:45%的細胞可見融合信號； 診斷：散發(fā)性經典型BL。病例5:399625，男、42y ISH:EBERs（-）； 診斷：較符合散發(fā)性非典型BL； FISH: 25%的細胞可見融合信號； 440 活檢穿刺標本1040IHC:CyclinD1病例6: 3933

41、01，男，40y； 肘部腫物； IHC：CyclinD1弱陽性； 經科內會診； FISH:21%的細胞可見融合信號；所示箭頭為染色體易位產生的融合信號（100）診斷：套細胞淋巴瘤 （MCL） 10CyclinD140病例7: 386766，女，67y 扁桃體活檢2塊，直徑0.3CM IHC：CyclinD1弱陽性； FISH:45%的細胞可見融合信號；診斷：不排除MCL的可能，重取活檢；形態(tài)不典型+IHC不理想所示箭頭為染色體易位產生的融合信號（100）最后診斷：套細胞淋巴瘤基因重排原理- 在B 和T淋巴細胞分化過程中不斷進行Ig和TCR基因重排。- 良性增生性淋巴細胞起源于多個克隆，基因重排

42、各式各樣，PCR 擴增產物片段長短不一，序列不同，電泳見不到克隆性重排而呈彌漫分布的涂抹狀。- 淋巴瘤是淋巴細胞某一分化階段的惡性克隆性增生所致的腫瘤，為單克隆性，基因重排片段大小相同，PCR產物在特定的基因片段范圍內電泳呈一窄帶。 510%的疑難病例； 一些可疑的B細胞增生，而形態(tài)學和免疫表型不能 排除惡性病變時； 所有可疑的T細胞增生（需要特別注意的是：T細胞豐富的B-NHL）；鑒定一個病人中的兩個淋巴惡性的克隆關系或區(qū)分是復發(fā)或新發(fā)腫瘤。哪些需要進行基因重排的檢測？以 IGH (VHJH) 重排為例.示例：左腎下極腫物DLBCL（非GCB亞型）IGH/BCL2(+)IGH/CMYC(-)

43、BCL6無斷裂IGA重排（+）IGA重排（+）IGH/BCL2分子診斷在少突膠質細胞瘤診斷中的應用 分類檢測項目檢測目標適用技術特色檢測預后及分子分型1p19qLOHFISHIDH1/2基因多態(tài)性DHPLC / 測序EGFRvIIImRNA表達RT-PCR免疫治療BRAF融合基因mRNA表達個體化治療常規(guī)化療藥物鉑類ERCC1mRNA表達/蛋白表達QPCRBRCA1LRP依托泊苷TOP2A長春新堿-tubulin 鉑類XRCC1基因多態(tài)性DHPLC/測序5-Fu類TYMS伊立替康UGT1A1甲氨蝶呤TPMT卡莫司汀MGMT甲基化MSP+DHPLC替莫唑胺靶向藥物貝伐單抗VEGFR1,2mRNA

44、表達/蛋白表達QPCRVEGFICAM1ELISAEGFR-TKIsEGFRvIII基因突變DHPLC / 測序K-rasPTENLOHFISH2、全面把握膠質瘤 生物遺傳特性輔助病理診斷的分子檢測意義二代測序技術在腫瘤個體化診療中的應用Next Generation Sequencing in Personalized Cancer Treatment邵建永中山大學腫瘤醫(yī)院分子診斷科2015.09 南寧第一部分 腫瘤基因組學及二代測序技術背景遺傳學發(fā)展里程碑腫瘤研究的轉折點：人類基因組測序杜爾貝克 （Renato Dulbecco）腫瘤病毒學家1975年獲諾貝爾生理學和醫(yī)學獎“A missi

45、on impossible!”“我們永遠不可能知道人類基因組序列 我可以保證，300年內不可能知道”！111想更多地了解腫瘤，我們從現在起必須 關注細胞的基因組。兩種選擇：要么通過零敲碎打的方法發(fā)現導致癌癥的基因，要么去測定整個人類基因組序列。腫瘤研究將因對DNA的詳細知識而得到巨大推動。國際腫瘤基因組計劃: 目標全面解析所有重要腫瘤類型的遺傳基礎鑒定所有重要腫瘤類型的基因組、轉錄組和表觀基因組變異圖譜113TCGA: “各平臺齊頭并進，各顯神通”25 種癌癥膠質母細胞瘤 (腦)鱗狀細胞癌(肺)漿液性囊腺癌(卵巢)等等多種數據類型1臨床診斷治療史組織學診斷病理學報告和圖像組織解剖部位外科手術史

46、基因表達/RNA測序染色體拷貝數雜合性喪失甲基化方式miRNA 表達DNA 測序RPPA (蛋白)多類型樣本的分型多于150個組織采取點的生物標本核心資源庫6個癌癥基因組研究中心3個基因組測序中心7 基因組數據分析中心數據協調中心113實現產業(yè)轉化時間：核能30年，衛(wèi)星20年，基因15年？1945美國中國落后19年1969美蘇中國落后20年1999 人類基因組計劃 中國與強國同步二十世紀人類三大科學創(chuàng)舉DNA變異檢測分析：全基因組測序 (Whole genome Resequencing)外顯子測序 (Exome-seq)個性化目標區(qū)域測序 (Target region seq) 二代測序技術

47、115116(Meyerson et.al, nature reviews genetics,2010)Point mutations (nucleotide substitutions)Small coding insertions/deletions (indels)Copy number alterations (CNAs)Chromosomal rearrangements體細胞DNA變異檢測RNA表達分析（RNA-sequencing）轉錄組測序 (Transcriptome seq)表達譜測序 (Expression profile)小RNA測序 (miRNA seq)長非編碼RN

48、A測序 (lncRNA seq)二代測序技術117表觀調控分析技術：DNA甲基化 全基因組重亞硫酸鹽測序(WGBS) 甲基化 DNA 免疫共沉淀測序(MeDIP-seq) 基于雙酶切消化的重亞硫酸鹽測序(dRRBS)DNA羥甲基化HMST-Seq羥甲基化 DNA 免疫共沉淀測序RNA甲基化組蛋白修飾 染色質免疫共沉淀測序(ChIP-Seq)二代測序技術118二代測序原理邊合成邊測序（sequencing by synthesis）鳥槍法（shotgun）僅供醫(yī)藥衛(wèi)生專業(yè)人士參考120測序價格（每百萬個堿基）變化趨勢商品化二代測序平臺的問世和升級帶來了測序價格的顯著下降。目前，一個人類全基因組的

49、測序成本（非高質量商品化測序服務售價）已低至1000美元。僅供醫(yī)藥衛(wèi)生專業(yè)人士參考第二部分二代測序技術在腫瘤臨床診療的應用腫瘤基因組研究進入大數據時代癌癥藥物治療現狀：化療+靶向基因檢測能夠有效預測藥物療效及毒副作用常用二代測序平臺能檢測哪些生物標志物? 服務于藥物研發(fā)和個性化醫(yī)療全基因組測序外顯子組測序RNA測序基因序列基因拷貝數基因組結構融合轉錄本RNA拷貝數RNA序列基因融合(gene fusion)拷貝數變異(CNV)等位基因表達(Allelic expression)基因突變(SNPs, indels)藥物研發(fā)：the story of vemurafenibNature 2002;

50、417:94954從高通量全基因組數據中篩選與惡性黑色素瘤相關的生物標志物結合分析其他利用低通量技術獲得的相關生物標志物研究成果生物信息學統計發(fā)現：66%的惡性黑色素瘤中發(fā)現BRAF錯義體突變，其中的80%是V600E點突變Nature 2010;467:5969N. Engl. J. Med 2010;363:80919成功合成突變型BRAF(V600E) 的靶向抑制劑PLX4032Phase I clinical trial2011年8月17日，Vemurafenib獲得FDA批準，用于治療晚期黑色素瘤?！皏emurafenib”的名字來自于“V600Emutated BRAFinhibi

51、tion”細胞實驗發(fā)現：突變型BRAF(V600E)蛋白表現出更高的激酶活性Cancer Res 2005;65:2412-21動物模型發(fā)現：表達突變型BRAF(V600E) 的惡性黑色素瘤表現出更強的血管生成能力和瘤體生長速度基因突變頻率研究蛋白功能研究靶向藥物合成臨床實驗瑪格麗特公主癌癥中心麻省總醫(yī)院達納-法伯癌癥研究所安德森癌癥中心范德比爾特-英格拉姆癌癥密歇根大學綜合癌癥中心紀念斯隆-凱特林癌癥中心梅奧診所癌癥中心古斯塔夫魯西研究所法國國家癌癥研究所英國癌癥研究院荷蘭個體化癌癥治療中心挪威全國計劃瑞典隆德大學全世界國家級機構對實體瘤的基因篩查策略及平臺 腫瘤個體化治療基因檢測 （508

52、基因） 細胞生存 細胞凋亡 基因組穩(wěn)定性 MAPK信號 RTK信號 PI3K信號 STAT信號 TGF信號 細胞周期/凋亡 HH信號 APC信號 NOTCH信號 轉錄調節(jié) 染色質修飾 DNA損傷控制 肺癌 TP53 EGFR MLL3 CDKN2A MLL2 NF1 STK11 SMARCA4 SETBP1 ATRX CREBBP KDR ATM KRAS KEAP1 MALAT1 CRIPAK - EPHB6 EPHA3 乳腺癌 PIK3CA TP53 GATA3 MAP3K1 CDH1 MLL3 MAP2K4 PTEN RUNX1 AKT1 PIK3R1 TBX3 MALAT1 CBFB

53、FOXA1 CTCF NCOR1 - CDKN1B RB1 NF1 其他實體瘤 AJUBA ARFRP1 B4GALT3 BACH1 BAK1 BCL2 BCL2A1 BCL2L1 BCL2L11 BCL2L2 BCL6 BCORL1 BCR BLM BTG1 BTK C11orf30 - C1R C1S CBL 結直腸癌 APC TP53 KRAS PIK3CA FBXW7 NRAS SMAD4 SMAD2 BRAF CTNNB1 MLL4 PTCH1 RB1 CDH1 PTCH1 ARID1A MLL2 - 化療藥物 靶向藥物 藥物靶點基因 28種臨床期靶藥 TP53 TPMT ERCC2

54、 XPC XRCC1 GSTP1 ABCB1 ERCC1 ABCC4 MTHFR CYP1B1 ABCC1 ABCC2 DPYD - EGFR KRAS NRAS BRAF ALK ROS1 KIT PDGFRA MET RET ERBB2 PIK3CA PTEN AKT1 - ABL2 AKT2 AKT3 AURKB CDK6 CHEK1 JAK3 IGF1R MDM2 MDM4 NOTCH1 PIK3R1 MEN1 SRSF2 - 33種FDA批準靶藥 27種化療藥物 癌癥相關12條通路所有實體瘤88種抗癌藥物 檢測技術檢測內容檢測優(yōu)勢樣本類型 適用人群檢測508個基因外顯子序列解讀88種

55、腫瘤藥物目標區(qū)域捕獲+高通量測序可檢測5%以上的突變靈敏度：99%特異性：99%腫瘤組織：新鮮組織穿刺樣本，石蠟切片對照：外周血腫瘤患者腫瘤個體化檢測介紹腫瘤個體化基因檢測1. 依據分子靶點的個體化醫(yī)療各瘤種相對應的 體細胞突變 染色體重排 小片段插入/缺失 遺傳性突變132基于單基因、單位點檢測已不能滿足個體化治療的需求，基于二代測序技術的多靶點基因檢測是未來個體化治療的趨勢。示例1：NSCLCJAMA. 2014;311(19):1998-2006. doi:10.1001/jama.2014.3741. 強烈推薦廣泛的分子標記物的篩選以尋找有效藥物 Nat. Rev. Clin. Onc

56、ol. advance online publication 21 July 2015 示例2：轉移性乳腺癌精準醫(yī)療的難點及解決辦法2條解決途徑乳腺癌靶向基因組變異Growth factor receptorsHER2, FGFR, IGFR, EGFR inhibitor PI3K/AKT/mTORPI3K inhibitor, AKT inhibitorMEK pathwayMEK inhibitorJNK pathwayCell cycleCDK4 inhibitorDNA repairPARP, MDM2 inhibitorER signallingEndocrine therapyE

57、pigeneticsDrug targeting epigeneticsNOTCH3NOTCH inhibitor甲狀腺結節(jié)FN樣本分子檢測及相關癌癥風險甲狀腺結節(jié)細針穿刺樣本分子檢測及篩查流程2. 基因組測序技術在血漿循環(huán)腫瘤DNA檢測的應用外周血循環(huán)腫瘤DNA檢測ctDNA方法學液體活檢的應用J Clin Oncol 32:579-586.外周血循環(huán)腫瘤DNA在不同腫瘤的檢測頻率Nat Med. 2014, 20(5):548NSCLC ctDNA的深度測序 腫瘤特異DNA突變的檢測 EGFR單抗的藥效監(jiān)測 治療過程中多個耐藥克隆的出現mCRC靶向藥物ctDNA突變監(jiān)測 3.遺傳性腫瘤基因

58、檢測144癌癥分為散發(fā)性癌，家族性癌和遺傳性癌5-10%的腫瘤是遺傳-遺傳特定基因的突變個體發(fā)生腫瘤的風險會增加。加強管理，指導患者及親屬的癌癥防治腫瘤遺傳易感基因檢測臨床管理145 遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征 (Hereditary breast ovarian cancer syndrome, HBOC)HBOC：指一個家族中有2 個一級親屬或 1 個一級親屬和 1 個二級親屬患乳腺癌或卵巢癌，并具有遺傳傾向。 常染色體顯性遺傳HBOC檢測NCCN指南基因基因功能易感性意義BRCA1BRCA1相關蛋白復合物高外顯率全外顯子及外顯子與內含子交接10bp，不包括拷貝數改變及大片段缺失胚系突變B

59、RCA2Fanconi/BRCA高外顯率PALB2Fanconi/BRCA中外顯率BARD1BRCA1相關蛋白復合物中-低外顯率BRIP1Fanconi/BRCA中外顯率RAD51CFanconi/BRCA中外顯率CHEK2DNA雙鏈斷裂修復中外顯率RAD50DNA雙鏈斷裂修復中外顯率MRE11ADNA雙鏈斷裂修復中-低外顯率NBNDNA雙鏈斷裂修復中-低外顯率ATMDNA雙鏈斷裂修復中外顯率MRE11ADNA雙鏈斷裂修復中-低外顯率CDH1細胞粘附高外顯率TP53細胞生長高外顯率PTENPI3K/MAPK 信號通路高外顯率MUTYHDNA修復中-低外顯率MLH1錯配修復基因MSH2錯配修復基

60、因MSH6錯配修復基因PMS1錯配修復基因PMS2錯配修復基因148注：紅色標注后面空格位置表示刪除該點的readsSanger 驗證CDS區(qū)發(fā)現了3種變異。與現有數據庫比對，BRCA2兩個突變與疾病意義不明確。BRCA1中的變異導致BRCA基因編碼框截斷，如圖紅色部分。整個編碼區(qū)在第117氨基酸處終止MDLSALAVEEVQNVINAMQKILECPICLELIKEPVSTKCDHIFCKFCMLKLLNQKKGPSQCPLCKNDITKASLQESTAFSQLVEELLKIICAFQLDTGLEYANSYNFAKKEITLLNIXMDLSALAVEEVQNVINAMQKILECPICLEL