細菌感染的實驗室診斷課件

1、第三章 細菌感染的病原學診斷第一節(jié) 標本的采集和處理原則一、標本采集的一般原則1.早期采集2.無菌采集 無菌部位:嚴格無菌操作有正常菌群部位：明確目的菌；選擇合適的選擇培養(yǎng)基3.采用不同方法采集需氧菌或兼性厭氧菌厭氧菌：穿刺法采集4.采集適量標本和適當標本采集有明顯病變的標本根據(jù)病程采集不同的臨床標本5.安全采集二、標本的處理1.及時送檢2.運送與保存 1）根據(jù)待檢菌特點對標本進行冷藏、保 溫或保持厭氧狀態(tài) 2）注意安全防護第二節(jié) 細菌形態(tài)學檢查顯微鏡種類1.普通光學顯微鏡（light microscope） 光源：可見光2. 暗視野顯微鏡（ darkfield microscope ） 暗背

2、景，菌體發(fā)光用于檢查不染色的活細菌和螺旋體的形態(tài)及運動觀察3. 相差顯微鏡 檢查不染色活細菌的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)4. 熒光顯微鏡 光源：100W200W的高壓汞燈5. 電子顯微鏡 光源：電子流透射電鏡：觀察細菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡：對細菌表面結(jié)構(gòu)及附件觀察 一、 不染色標本的檢查常用方法壓滴法懸滴法毛吸管法 用于檢查厭氧菌動力用途動力試驗檢查細菌有無動力制動試驗鑒定血清型三、 染色標本的檢查（一）常用染料色基：決定染料的顏色助色基：決定染料的酸堿性1. 堿性染料電離后色基帶正電荷細菌染色常用，如美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅等2. 酸性染料用于細胞漿染色，如伊紅、酸性復紅、剛果紅3. 復合染料（中性染

3、料）堿性染料與酸性染料的復合物，如瑞氏染料、姬姆薩染料等4. 單純?nèi)玖先缣K丹染料，溶于脂肪溶劑，不溶于水，化學親和力低（二）常用的細菌染色法單染色法只用一種染料，如呂氏美藍復染色法用兩種或兩種以上不同顏色的染料 細菌染色的一般程序1. 涂片2. 干燥：自然干燥為好3. 固定4. 初染5. 媒染 媒染劑6. 脫色 脫色劑7. 復染1. 革蘭染色法（Gram stain）（1）原理1）細胞壁學說：兩種細菌細胞壁通透性不同 2）等電點學說3）化學學說：兩種細菌含有RNA鎂鹽不同（2）方法：制片結(jié)晶紫初染碘液媒染酒精脫色復紅復染結(jié)果 革蘭陽性菌G：紫色 革蘭陰性菌G：紅色（3）影響染色結(jié)果的因素1）操

4、作技術(shù)：涂片和脫色2）染色液：3）細菌：1824h培養(yǎng)物為好（4）意義:1）鑒別細菌2）選擇藥物3）與致病性有關(guān) 2. 抗酸染色法細菌著色后不被鹽酸酒精脫色的染色方法染料：石炭酸復紅、鹽酸酒精、美藍方法 初染：5%石炭酸復紅加熱染色5min 脫色：3%鹽酸酒精 復染：呂氏美藍3.熒光染色 金胺O法4.特殊染色法細胞壁染色、莢膜染色、芽胞染色、 鞭毛染色、異染顆粒染色5.負染法 背景著色 肺炎鏈球菌莢膜染色 墨汁負染法芽胞染色第三節(jié) 細菌分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基（culture medium） 由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。（一）培養(yǎng)基的組成成分

5、1. 營養(yǎng)物質(zhì)碳源、氮源、無機鹽、水、生長因子（1）蛋白胨 提供氮源 植物胨: 大豆 動物胨：牛肉、動物組織等（2）肉浸液 碳源、氮源（3）牛肉膏 氮源（4）糖（醇）類 碳源和能源（5）血液 提供特殊生長因子、觀察溶血（6）無機鹽類常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等微量元素：Co、Zn、Mn、Cu、Mu等（7）雞蛋與動物血清用于某些特殊培養(yǎng)基（8）生長因子維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等2.凝固物質(zhì) 即賦形劑（1）瓊脂（2）明膠 動物膠原組織熬制而成3. 抑制劑和指示劑（1）抑制劑：膽鹽、煌綠、染料、抗生素等選擇培養(yǎng)基：加入一定種類的抑制劑，以抑制雜菌生長或減少生長，有利于檢出菌生長的

6、培養(yǎng)基。（2）指示劑： 酚紅、中性紅、中國藍等 鑒別培養(yǎng)基：加入特定底物和指示劑（二）培養(yǎng)基的種類1.按培養(yǎng)基的物理性狀（1）液體培養(yǎng)基：增菌（2）固體培養(yǎng)基：純化，增菌（3） 半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種 液體培養(yǎng)基 固體斜面培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基2. 按營養(yǎng)成分和用途分類（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：只有基本營養(yǎng)成分（2）營養(yǎng)培養(yǎng)基：加有血液 、血清等（3）鑒別培養(yǎng)基：含有特定底物和指示劑（4）選擇培養(yǎng)基：含有抑制劑（5）特殊培養(yǎng)基：厭氧、細菌L型（三）培養(yǎng)基的選擇1.血平板 最常用2.巧克力血平板 奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌3.腸道選擇培養(yǎng)基 分離腸道細菌 常用中國藍、EMB、MAC、SS4.堿性瓊脂或T

7、CBS 分離霍亂弧菌5.血液增菌培養(yǎng)基 血液、骨髓增菌用6.營養(yǎng)肉湯 增菌用（四）培養(yǎng)基的制備1. 常用各種器具滅菌前的準備（1）培養(yǎng)皿：用紙包裹（2）試管：加塞后用紙包好（3）吸管和毛細管（4）燒瓶2. 培養(yǎng)基制備的一般程序（1）調(diào)配 根據(jù)培養(yǎng)基組成，準確稱取各組分，先加需要蒸餾水的一部分，再加培養(yǎng)基干粉，最后補足水量。（2）溶化 液體培養(yǎng)基不需加熱 （3）調(diào)整pH值 一般7.27.6（4）過濾澄清（一般可以省略）液體培養(yǎng)基： 濾紙固體培養(yǎng)基： 紗布 （5）分裝 平板：滅菌后冷卻至50 60時傾倒 90mm 2530ml（4mm）：藥敏用 90mm 1315ml(3mm)：培養(yǎng)用瓊脂斜面：分

8、裝量為試管的1/41/3，滅菌后趁熱制成斜面，斜面長度2/3高層、半固體、液體：分裝量為試管長度1/42/3 （ 6）滅菌高壓蒸汽滅菌 無糖：103.4kPa 121.31530min含糖： 68.4kPa 115 15min流動蒸汽滅菌法 血清、牛乳、雞蛋間歇蒸汽滅菌法（7）鑒定無菌試驗：將制好的培養(yǎng)基在35孵育過夜，判定是否滅菌合格。效果檢查：按不同的培養(yǎng)要求，接種相應菌種，觀察細菌的生長狀況，判斷培養(yǎng)基是否符合要求。（8）保存 4 冰箱保存，一周左右 注意事項1. 器皿 中性硬質(zhì)玻璃器皿2. 化學藥品 化學純以上3. 準確稱量，正確溶解4. 準確測定培養(yǎng)基酸堿度5. 保持澄清6. 滅菌時

9、間不宜過長，不宜反復滅菌二、分離培養(yǎng)（一）細菌的分離1.無菌技術(shù)是防止微生物進入物品和機體，同時防止被檢物中可能存在的病原微生物污染周圍環(huán)境及工作人員的規(guī)范化操作技術(shù)。2.操作要點左手負責持平皿、試管等物品右手持接種工具取菌并劃種3.移種或接種的基本步驟（1）右手持接種工具，在火焰上燒灼滅菌。（2）左手拿起標本盒或平皿、試管等。（3） 用接種工具挑取適量標本或細菌。（4）根據(jù)目的選擇不同的接種方法（5） 接種完畢，在火焰上燒灼接種工具，放回原處。4.常用的接種方法（1）平板劃線法分區(qū)劃線法 用于雜菌量較多的標本連續(xù)劃線法 用于雜菌不多的標本（2）瓊脂斜面接種法純培養(yǎng)（3）穿刺法觀察細菌動力（4

10、）液體培養(yǎng)基接種法 增菌（5）傾注平板法計數(shù)細菌數(shù)量（6）涂布法 紙片法藥敏試驗（二）細菌的培養(yǎng)方法1.需氧培養(yǎng)法 普通培養(yǎng)2.二氧化碳培養(yǎng)（1）二氧化碳培養(yǎng)箱（2）燭缸法（3）化學法3.厭氧培養(yǎng)（三）細菌的生長現(xiàn)象1.固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象菌落：單個細菌在培養(yǎng)基上分裂繁殖成一堆肉眼可見的細菌集團。CFU：菌落形成單位，活菌計數(shù)用細菌菌落的描述 大小、形狀、突起或扁平、邊緣、顏色、表面、透明度（1）光滑型菌落（S型菌落）表面光滑、濕潤、邊緣整齊（2）粗糙型菌落（R型菌落）表面粗糙、干燥、邊緣不齊（3）粘液型菌落（M型菌落）菌落粘稠、有光澤、似水珠樣 卷發(fā)樣菌落 粗糙型菌落（L-J）粘液型菌落2

11、.液體培養(yǎng)基中的生長情況表面生長 均勻混濁生長 沉淀生長 三、細菌生化反應鑒定（一）碳水化合物的代謝試驗1. 糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗原理 各種細菌酶系不同，分解糖（醇、苷）的能力各異，產(chǎn)物也不同。培養(yǎng)基 單糖、雙糖、三糖、多糖應用 腸道桿菌科細菌的鑒定 Sugar Fermentation 2. 葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗（O/F）原理 氧化型 專性需氧菌 發(fā)酵型 產(chǎn)堿型 不分解葡萄糖 培養(yǎng)基 Hugh-Leifson二氏培養(yǎng)基結(jié)果 氧化管 發(fā)酵管 氧化型 變黃 不變 發(fā)酵型 變黃 變黃 產(chǎn)堿型 不變 不變 （陰性） 應用 鑒別腸桿菌科細菌與非發(fā)酵菌3. -半乳糖苷酶（ONPG ）試驗原理 ONPG

12、無色，經(jīng)-半乳糖苷酶水解后生成黃色的鄰硝基酚方法（1）在含ONPG的培養(yǎng)基中接種純種細菌（2）制成菌懸液，加入甲苯，再加ONPG試劑結(jié)果 陽性：變黃（2030min）應用 遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定4. 七葉苷水解試驗原理 葡萄糖七葉苷 七葉素+Fe2+ 黑色化合物培養(yǎng)基 七葉苷、膽汁七葉苷培養(yǎng)基結(jié)果 陽性：培養(yǎng)基變黑用途 鑒別腸球菌、G-桿菌及厭氧菌 5. 甲基紅（methyl red MR）試驗原理葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 甲基紅 -葡萄糖丙酮酸 各種酸 甲基紅 +培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水結(jié)果 陽性：紅色 陰性：黃色 應用 鑒別腸桿菌科細菌 6. VP（Voges-Proskauer）試驗原

13、理葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 二乙酰肌酸 萘酚紅色化合物 培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水結(jié)果 陽性：紅色應用 鑒別腸桿菌科細菌（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1.明膠液化試驗原理：某些細菌可產(chǎn)生明膠酶，分解明 膠，使其失去凝固能力。方法：將待檢物接種于明膠培養(yǎng)基22 培養(yǎng)7天結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性應用：腸桿菌科細菌鑒別2. 吲哚（indol）試驗原理色氨酸吲哚玫瑰吲哚 吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛）培養(yǎng)基 蛋白胨水培養(yǎng)基結(jié)果 陽性：紅色 3. 硫化氫試驗原理含硫氨基酸 H2S+硫酸亞鐵FeS黑色 醋酸鉛 PbS黑色培養(yǎng)基 醋酸鉛培養(yǎng)基結(jié)果 陽性：黑色沉淀用途 腸桿菌科菌屬間的鑒定 4. 尿素分解試驗

14、原理尿素 NH3+CO2+H2O (NH4)2CO3培養(yǎng)基尿素肉湯或尿素瓊脂培養(yǎng)基結(jié)果 陽性：紅色用途 腸桿菌科中變形桿菌的鑒定 5. 苯丙氨酸脫氨酶試驗原理苯丙氨酸 苯丙酮酸+10%氯化鐵 綠色化合物培養(yǎng)基 苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基 結(jié)果 陽性：綠色用途 腸桿菌科中變形桿菌的鑒定 6. 氨基酸脫羧酶試驗原理氨基酸 胺+ CO2 培養(yǎng)基變堿培養(yǎng)基 氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照結(jié)果 陽性：紫色 陰性：黃色用途 腸桿菌科細菌鑒定（三） 碳源和氮源利用試驗1. 枸櫞酸鹽利用試驗原理銨鹽 碳酸鈉+氨培養(yǎng)基 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基結(jié)果 陽性：藍色 陰性：綠色2.丙二酸鹽利用試驗利用枸櫞酸鹽生長 + 不能利用 - I

15、MViC試驗I - 吲哚（indol）試驗M - 甲基紅（methyl red）試驗V - VP（Voges-Proskauer）試驗C -枸櫞酸鹽利用（citrate utilization）試驗 I M Vi C試驗 大腸埃希菌 + + - - 產(chǎn)氣桿菌 - - + + （四） 各種酶類試驗1. 氧化酶試驗原理方法 菌落法 濾紙法 試劑紙片法 結(jié)果 深紫色為陽性2. 過氧化氫酶試驗3. 硝酸鹽還原試驗4. 脂酶試驗5. 卵磷脂酶試驗6. DNA酶試驗7. 凝固酶試驗8.CAMP試驗9. 膽汁溶菌試驗（五）抑菌試驗1.O/129試驗用于弧菌科的屬間鑒別2.桿菌肽試驗用于A群鏈球菌與其他鏈球菌

16、間的鑒別3.奧普托欣試驗用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別第四節(jié) 細菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學檢測利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，用已知抗原檢測未知抗體，或用已知抗體檢測未知抗原。（一）抗原檢測1. 凝集反應直接凝集、間接凝集、SPA協(xié)同凝集試驗2.免疫熒光技術(shù)用熒光標記抗體，顯微鏡觀測結(jié)果3.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)用酶標記抗體，根據(jù)顏色變化判斷結(jié)果反向間接血凝試驗免疫熒光技術(shù)1.直接法：熒光素標記抗體2.間接法：熒光素標記二抗（抗抗體）3.免疫熒光 菌球法酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA1. 雙抗體夾心法2. 競爭法 陽性-無色（二）抗體檢測用已知的細菌或其特異性抗原檢測病人 血清中有無相應抗體及其效

17、價的動態(tài)變 化，輔助診斷某些傳染病。二、分子生物學檢測（一）核酸雜交來自兩個不同個體的單鏈DNA 相互結(jié)合成互補的DNA雙鏈的過程（二）聚合酶鏈反應（PCR）是一項簡便、快速的特異性DNA體外擴增技術(shù)（三）生物芯片技術(shù)常用的芯片：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片三、細菌毒素的檢測（一）內(nèi)毒素1.內(nèi)毒素的致熱作用（體內(nèi)實驗）原理：內(nèi)毒素產(chǎn)生于G-菌，菌體死亡后釋放，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱。方法：（1）將家兔分成兩組，每組4只，測量基 礎(chǔ)體溫并記錄。（2）用無菌注射器抽取待檢物注入一組家兔耳靜脈，另一組注射等量生理鹽水。（3）觀察動物反應，并間隔30min測量兩組家兔體溫。結(jié)果 ：陽性 試驗組體溫升高

18、對照組體溫正常應用：無菌的生物制品2.鱟試驗（體外實驗）原理：鱟血液中含有一種變形細胞，此細胞裂解物可與微量內(nèi)毒素起凝膠反應，即細胞裂解物中的一種酶被激活，使細胞裂解物中的蛋白質(zhì)形成凝膠。鱟試劑：鱟變形細胞裂解物方法（1）打開3支鱟試劑安瓶，各加0.1ml無菌蒸餾水使之溶解，同時編號。（2）向3支安瓶中分別加待測物、標準內(nèi)毒素、無熱原生理鹽水各0.1ml。（3）輕輕搖勻，垂直放37 水浴，1530min后觀察結(jié)果。鱟試驗結(jié)果- 不形成凝膠+ 形成凝膠，但不牢固+ 形成牢固凝膠，倒持安瓶凝膠不動。應用鱟試驗（二）外毒素1.體內(nèi)毒力試驗原理：細菌外毒素對機體具有強烈毒性 作用，但可被相應抗毒素中和，中和后， 實驗動物不產(chǎn)生中毒