第21流控分析芯片13.4分子發(fā)光

1、2022/8/7第十三章 分子發(fā)光分析法13.4.1 基本原理 13.4.2 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型13.4.3 裝置與技術(shù)13.4.4 化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用第四節(jié) 化學(xué)發(fā)光分析法Molecular luminescence analysisChemiluminescence analysis2022/8/7化學(xué)與生物發(fā)光現(xiàn)象化學(xué)發(fā)光是如何產(chǎn)生的？又是如何用于分析？浪漫的大連發(fā)光海灘美景2022/8/713.4.1 化學(xué)發(fā)光分析基本原理1. 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程(1) 能夠發(fā)光的化合物多為有機(jī)化合物(芳香族)；(2) 多為氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)能與激發(fā)能相當(dāng) E=1504000 kJ/mol；位于可見光區(qū)；

2、(3) 發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行； (4) 具有較高的發(fā)光效率。如何定義？ 在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量（？）而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長的光（？）。 A + B = C + D* ；D* D + h2022/8/72.化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：時(shí)刻t 的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt ：分析物參加反應(yīng)的速率。2022/8/73.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù) 在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測物濃度成線性。定量常用。圖：發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線 曲線下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測物濃度成線性：定量依據(jù)：2022/8/74.抑制化學(xué)發(fā)光分

3、析 抑制化學(xué)發(fā)光分析是利用某物質(zhì)對(duì)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的抑制作用進(jìn)行定量分析的方法。 如在魯米諾-KMnO4發(fā)光體系中，Cu2+對(duì)該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，使發(fā)光強(qiáng)度顯著降低，發(fā)光強(qiáng)度的降低量與Cu2+的濃度有關(guān)。 該方法已用于水中微量銅的定量測定。 2022/8/713.4.2 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型與發(fā)光分析1.氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與發(fā)光分析(1) 一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng) 與發(fā)光分析 NO + O3 NO2* ； NO2* NO2 + h 發(fā)射的光譜范圍：600875nm，靈敏度1ng/mL-1；(2) 氧原子與SO2，NO，CO的發(fā)光反應(yīng)與發(fā)光分析 O3 O2 + O （1000 C石英管中進(jìn)行） SO

4、2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2 + h 最大發(fā)射波長：200 nm；靈敏度1 ng/m-1。 2022/8/7 O3 O2 + O （1000 C石英管中進(jìn)行） NO + O NO2* ；NO2 * NO2 + h 發(fā)射光譜范圍：4001400nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)與發(fā)光分析： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 發(fā)射光譜范圍：300500 nm；靈敏度1ngmL-1。 氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)與發(fā)光分析：2022/8/7(3) 乙烯與O3的發(fā)光反應(yīng)與發(fā)光分析 乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛： CH2O* CH2O + h

5、 最大發(fā)射波長：435 nm；對(duì)O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1 ngcm-3 1 gcm-3。2022/8/72.火焰中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與發(fā)光分析 在富氫火焰中，也存在著很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；（1） 一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 發(fā)射光譜范圍：660770 nm； 最大發(fā)射波長：690 nm。 在富氫火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 該反應(yīng)十分迅速。2022/8/7（2）硫化物 揮發(fā)性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3 等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（藍(lán)色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2

6、 * S2 + h發(fā)射光譜范圍：350460 nm；最大發(fā)射波長：394 nm；靈敏度： 0.2 ngmL-1。 發(fā)射光強(qiáng)度與硫化物濃度的平方成正比。2022/8/73.液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與發(fā)光分析 機(jī)理研究較多，應(yīng)用最多；可測痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過程： 化學(xué)發(fā)光效率：0.150. 05；反應(yīng)速率慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。2022/8/7化學(xué)發(fā)光試劑2022/8/7 草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應(yīng)

7、體系，可發(fā)出很強(qiáng)的可見光，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光(冷光源)。2022/8/74. 生物發(fā)光反應(yīng)2022/8/74. 生物發(fā)光反應(yīng) 生物發(fā)光是涉及生物或酶反應(yīng)的一類化學(xué)發(fā)光 ，有很高的發(fā)光效率(50%)。 著名的螢火蟲發(fā)光反應(yīng)的過程為：式中，LH2 為螢光素，E是螢光素酶，PPi是焦磷酸鹽，ATP是三磷酸腺苷，AMP是單磷酸腺苷。 利用上述反應(yīng)可測定ATP。最大發(fā)射波長562nm。對(duì)10g樣品，檢出限可低達(dá)10-14g。 2022/8/7生物發(fā)光分析 許多生化反應(yīng)通常都涉及到H2O2的生成或有H2O2參與反應(yīng)，可利用魯米諾發(fā)光體系來測定許多生化試劑或組分。例： 202

8、2/8/713.4.3 裝置與技術(shù)特點(diǎn)：簡單 裝置流程：發(fā)光反應(yīng)室光檢測器信號(hào)放大器顯示與記錄 發(fā)光反應(yīng)可采用靜態(tài)或流動(dòng)注射的方式進(jìn)行： 靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應(yīng)器中混合， 測最大光強(qiáng)度或總發(fā)光量；試樣量小，重復(fù)性差。 流動(dòng)注射方式：用蠕動(dòng)泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時(shí)通過測量室，連續(xù)發(fā)光，測定光強(qiáng)度；試樣量大。2022/8/72022/8/713.4.4 化學(xué)與生物發(fā)光分析的應(yīng)用1. 發(fā)光反應(yīng)速率慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)； 利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子?？蓽y痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Hg2+等。2. 可檢測低至 1

9、0-9 molL-1 的H2O2。3. 間接測定某些生物試樣： 氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2 葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通過測定生成的H2O2 ，確定氨基酸、葡萄糖含量。2022/8/7生物發(fā)光分析應(yīng)用 1 在pH 78；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與三磷酸腺苷(ATP)的反應(yīng)，生成磷酸腺苷(AMP)熒光素和熒光素酸的復(fù)合物和鎂的焦磷酸鹽(PPi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg PPi + 2H+pH7 - 8復(fù)合物與氧反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光： AMP LH2 E + O2 氧化熒光素*

10、+ AMP+CO2 + H2O氧化熒光素* 氧化熒光素 + h最大發(fā)射波長562 nm。2022/8/7生物發(fā)光分析應(yīng)用 2 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在細(xì)菌中的黃素酶作用下，在氧化型黃素單核苷酸(FMA)存在下，發(fā)生發(fā)光反應(yīng) ：NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2NADH脫氫酶FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h黃素酶 最大發(fā)射波長495 nm。2022/8/7化學(xué)發(fā)光分析的特點(diǎn)1. 靈敏度極高 例：熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學(xué)發(fā)光分析，可測定210-17 molL-1ATP，可檢出一個(gè)細(xì)菌中的ATP含量。2. 儀器設(shè)備簡單 不需要光源、單色器和背景校正。3. 發(fā)射光強(qiáng)度測量無干擾