醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)基因功能研究的基本策略

1、基因功能研究的方法： 動物轉(zhuǎn)基因技術(shù) 基因打靶 基因沉默第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenic technology)：用重組DNA技術(shù)將外源基因?qū)氩⒄系剿拗骰蚪M內(nèi)，并使其在體內(nèi)表達(dá)和穩(wěn)定遺傳給后代。 細(xì)胞模型 轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因植物一. 轉(zhuǎn)基因生物的意義20 世紀(jì) 80 年代 (Brinster and Palmiter)：著名的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)：金屬硫蛋白基因啟動子驅(qū)動大鼠生長激素基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因生物的用途：研究手段：疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型。改良動物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。二、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本原理1. 外源目的基因分離；2. 轉(zhuǎn)基因與表達(dá)載體

2、重組；3. 重組的轉(zhuǎn)基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞；4. 轉(zhuǎn)基因胚胎的培養(yǎng)和移植；5. 胚胎發(fā)育和生長的鑒定及轉(zhuǎn)基因動物品系的篩選；6. 外源目的基因的整合率和表達(dá)效率檢測。（一）基本原理供體基因受體的受精卵（一）基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵（一）基本原理轉(zhuǎn)基因動物（二）基本過程上游基因改造和載體構(gòu)建中游基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系下游基因整合、表達(dá)的檢測與細(xì)胞篩選1. 上游基因改造和載體構(gòu)建外源基因: 完整的轉(zhuǎn)錄單位，由順式作用元件、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止信號組成。報告基因 : 在表達(dá)載體中引入易于檢測的報告基因。GFP、 LacZ、Apr。融合基因 (fusion gene): 將特定的目的基因與報告基因拼

3、接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉(zhuǎn)錄單位。動物轉(zhuǎn)基因常用的載體腺病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 非病毒類載體：如質(zhì)粒等。2. 中游基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 1) 顯微注射法（microinjection) 2) 胚胎干細(xì)胞法(embryonic stem cells, ES) 3) 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 4) 精子載體法1) DNA顯微注射法受精卵原核顯微注射法是最常用、最經(jīng)典基因轉(zhuǎn)移方法。持卵管DNA注射針精原核卵原核DNA 顯微注射DNA 顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出數(shù)倍，因而用

4、于顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常是去除載體序列的線狀 DNA。DNA 顯微注射法的特點(diǎn)DNA 大小無限制，最大可達(dá) 250Kb。隨機(jī)整合：在染色體上整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的，整合的拷貝數(shù)也不一定?？傂瘦^低(實(shí)際成功率1/1000)。提高顯微注射 DNA 表達(dá)的成功率轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表達(dá)，最好是可以誘導(dǎo)表達(dá)。轉(zhuǎn)入基因中應(yīng)該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列誘導(dǎo)表達(dá)啟動子外源基因2) 胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryo stem cells, ES 細(xì)胞)：可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細(xì)胞，當(dāng)把這種胚胎細(xì)胞重新導(dǎo)入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細(xì)

5、胞的能力。ES 細(xì)胞具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特性。胚胎干細(xì)胞法分離和培養(yǎng) ES 細(xì)胞。外源基因?qū)?ES 細(xì)胞。導(dǎo)入外源基因的 ES 細(xì)胞的子宮轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞胰蛋白酶消化解離加飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞外源 DNA 的導(dǎo)入DNA胚胎干細(xì)胞囊胚 原囊胚 轉(zhuǎn)基因動物磷酸鈣-DNA 共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法微注射外源 DNA 的整合用于 ES 細(xì)胞的 DNA 載體一般帶有定點(diǎn)整合元件, 避免了隨機(jī)整合。定點(diǎn)整合位點(diǎn)應(yīng)選擇在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對細(xì)胞正常功能的影響。定

6、點(diǎn)整合位點(diǎn)必須在基因組的可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的地方。胚胎干細(xì)胞法的特點(diǎn)定點(diǎn)整合。ES 細(xì)胞在體外培養(yǎng)，外源 DNA 導(dǎo)入后可用正-負(fù)選擇法篩選擇正確整合的 ES 細(xì)胞, 相對較簡單。目前只在小鼠身上獲得成功。3）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建獲得四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚外源 DNA 導(dǎo)入早期胚胎： 獲得病毒顆粒感染早期胚胎 包裝細(xì)胞與早期胚胎共培養(yǎng)感染后的胚胎植入受體動物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動物。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點(diǎn)通過病毒 DNA 插入宿主 DNA 的機(jī)制，將外源目的基因整合到宿主基因

7、組，整合效率高。反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(10kb)。對家禽類的轉(zhuǎn)基因研究有重要意義。4）精子載體法外源 DNA精子 卵細(xì)胞 受精卵 轉(zhuǎn)基因動物共育法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法電穿孔法DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法四細(xì)胞胚胎囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動物微注射顯微注射3. 下游基因整合與表達(dá)檢測及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)基因的 mRNA 的存在與否以及表達(dá)水平。蛋白水平：轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)以及功能檢測。鑒定方法PCRSouthern blot染色體原位雜交Northe

8、rn blotRT-PCRWestern blot基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細(xì)胞中不含轉(zhuǎn)入基因生殖系細(xì)胞中含轉(zhuǎn)入基因子代多次交配可得到純合轉(zhuǎn)基因鼠系分析動物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型?；虍a(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應(yīng)器。三. 轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用1. 人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimersdisease)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、肌肉營養(yǎng)缺乏癥(muscular distrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性疾病

9、(neurodegenenerative disorder)、內(nèi)分泌功能障礙(endocrinological disfunction)、動脈硬化癥及其他很多疾病。2. 利用轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器：乳腺、膀胱、血液生物反應(yīng)器抗凝血酶 III：轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中。乳球蛋白紅細(xì)胞生成素凝血因子 VIII凝血因子 IX生長激素3. 轉(zhuǎn)基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體器官或組織的移植。1997 年起，利用遺傳改良的轉(zhuǎn)基因豬肝做為嚴(yán)重肝病患者的離體生命支持物。4. 動物的克隆1996 年，首次實(shí)現(xiàn)動物的無性生殖。由綿羊的乳腺細(xì)胞提供細(xì)胞核，卵細(xì)胞提供細(xì)胞質(zhì)

10、發(fā)育而來。核移植技術(shù)（Nuclear Transfer)核移植技術(shù)（Nuclear Transfer)第二節(jié) 基因打靶基因打靶(Gene Targeting) ：通過 DNA 定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。基因敲除(gene knockout): 刪除靶基因的重要功能區(qū)，使靶基因失活。基因敲入(gene knockin): 將外源基因整合到特定靶位點(diǎn)，進(jìn)行特異性表達(dá)。一、基因打靶的基本程序打靶載體的構(gòu)建。打靶載體導(dǎo)入 ES 細(xì)胞及其鑒定?；蚯贸?ES 細(xì)胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。1. 打靶載體的構(gòu)建同源

11、基因片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因2. 打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA 共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法顯微注射法（1）打靶載體的正-負(fù)選擇與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段 DNA 序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗 G418 的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor基因）。2個不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來自I 型II型單純皰疹病毒。打靶載體的正篩選 tk1 HB1 neor HB2 tk2載體載體同源重組neorG418正篩選，細(xì)胞存活染色體染色體打靶載體的負(fù)篩選 tk1 HB1 neor HB2 tk2染色體染色體非特異性整合

12、 GCV負(fù)篩選，細(xì)胞死亡（2）PCR 鑒定在打靶載體的 HB1 和 HB2 之間，加上一個載體和鼠的基因組中都沒有的獨(dú)特DNA 序列（US）。如發(fā)生隨機(jī)整合，PCR 無法擴(kuò)增出預(yù)期的DNA 片段。如果整合于特定位點(diǎn)時，則 PCR 可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段。PCR 鑒定：特異整合 tk1 HB1 US neor HB2 tk2P2P1PCR反應(yīng)有特異條帶特異整合3. 基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮嵌合體的雜交育種：同源重組只發(fā)生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子。第三節(jié) 基因沉默在RNA水平上研究基因功能的方法：（一）反

13、義RNA（二）RNA干擾技術(shù) （二）RNA 干擾1990 年，Jorgense 等通過 轉(zhuǎn)基因改造牽?；伾?。外源基因不但不能加深花的顏色，反而造成內(nèi)源基因表達(dá)的降低。 RNA 干擾是dsRNA 導(dǎo)致的基因沉默1998 年，F(xiàn)ire 等在 C. elegans 中用 antisense RNA 抑制基因表達(dá)。ds RNA 比 sense 或 antisense RNA 都好。注射甚至口服 dsRNA 都能誘發(fā)基因沉默。很少量的ds RNA 就能誘發(fā) C. elegans 整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。 RNA 干擾：RNA interference (RNAi) RNAi 是真核生物中廣

14、泛存在的現(xiàn)象植物：干擾因素自葉脈向外擴(kuò)散，綠色熒光蛋白(GFP)基因被抑制，顯露出紅色。 線蟲：左側(cè)為 GFP 轉(zhuǎn)基因線蟲；右側(cè)線蟲則經(jīng) GFP dsRNA 處理。部分細(xì)胞 RNAi 相關(guān)蛋白表達(dá)較低，仍有綠色熒光。 Hela 細(xì)胞：經(jīng) ORC6 siRNA 作用后，細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。綠色為 tubulin，紅色為 DNA。ORC6 細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白。 果蠅：右側(cè)果蠅為野生型，左側(cè)為 shRNA 造成的色素缺乏的缺陷型。 1. RNA 干擾RNA 干擾 (RNAi)：由短雙鏈 RNA 誘導(dǎo)的同源 mRNA 降解，抑制基因表達(dá)。RNA 干擾技術(shù)可以用于基因敲除，選擇性關(guān)閉特定細(xì)胞基因。（1）si

15、RNA 的產(chǎn)生Dicer：RNase III 的一種，可降解 dsRNA 成 siRNA。siRNA(Short interfering RNA )：2123nt （2）siRNA 誘導(dǎo)同源序列的降解RNA-Induced Silencing Complex（RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）產(chǎn)生兩種后果：同源 mRNA 的降解。同源 mRNA 翻譯受阻。2. 基因沉默的機(jī)制是多方面的dsRNA 造成的 mRNA 降解。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-translational gene silencing)dsRNA 造成同源性基因的甲基化和表達(dá)關(guān)閉。dsRNA 造成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。dsRNA 對蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生影響。RNAi 和基因敲除在基因組 DNA 上，通過同源重組進(jìn)行的基因敲除。在 mRNA 水平進(jìn)行的基因敲除：反義RNA核酶 ( Ribozyme )RNAi：dsRNA; siRNA; shRNA基因敲除和 RNA 干擾基因敲除是在基因水平將某個基因定點(diǎn)去除，動物整體水平。RNA 干擾不是敲除基因，而是誘導(dǎo) RNA 的特異性降解，干擾基因的表達(dá)。一般是在細(xì)胞水平。3. ds