齲病微生物學(xué)

1、齲病微生物學(xué)（Microbiology of dental caries）齲病（dental caries）是以細(xì)菌為病原體，多種因素參與，發(fā)生在牙齒硬組織的慢性、進(jìn)行性、破壞性疾病。從齲病的概念中我們可以看出齲病與微生物的關(guān)系密切，沒(méi)有微生物的參與牙齒不能形成齲樣破壞。多年的研究表明：齲的發(fā)生離不開(kāi)菌斑生物膜的環(huán)境，這其中牙冠部齲和根面齲關(guān)系密切的微生物是變異鏈球菌群中的變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌，其次是乳桿菌屬。 致齲微生物特點(diǎn)（Properties of cariogenic microorganisms）根據(jù)Robert-Koch發(fā)現(xiàn)病原菌原則： 1.必須有規(guī)則的從可疑病例中發(fā)現(xiàn)并分離同一

2、種病原體； 2.該病原體能在體外培養(yǎng)并傳代； 3.培養(yǎng)出的病原體能使易感動(dòng)物發(fā)??；4.并從發(fā)病的動(dòng)物分離培養(yǎng)出該病原體。Clarke于1924年成功分離出變形鏈球菌，確認(rèn)變鏈?zhǔn)驱x病的病原菌。現(xiàn)在的對(duì)于致齲菌的結(jié)論是：是否具有致齲的毒力因子，包括：對(duì)牙面的粘附性、產(chǎn)酸、耐酸，合成胞內(nèi)外多糖的能力；是否在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中致齲；流行病學(xué)調(diào)查是否證明該中細(xì)菌與齲的發(fā)生關(guān)系密切。相關(guān)性包括：齲病發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程中均存在； 在開(kāi)始脫礦的牙面其數(shù)量明顯增多； 能從齲的各個(gè)階段獲得分離培養(yǎng)； 在無(wú)齲牙面以及無(wú)齲者唾液中含量很低。致齲微生物特性描述：能夠粘附定居牙面致齲的先決條件；細(xì)菌通過(guò)鈣橋、氫鍵和疏水作用可逆性吸

3、附牙面；粘附素與受體的特異結(jié)合使細(xì)菌牢固粘附，以牙菌斑生物膜的形式抵抗食物的咀嚼和唾液機(jī)械沖洗的影響，為致齲創(chuàng)造條件。能迅速將糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，代謝糖產(chǎn)酸變異鏈球菌擁有兩套轉(zhuǎn)移糖進(jìn)入細(xì)胞系統(tǒng)：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）：與葡萄糖親和力高，在低糖濃度、高pH時(shí)，活性大；（淀粉類(lèi)食物短缺）透性酶系統(tǒng)（permease system）：與葡萄糖親和力低，高糖濃度、低pH時(shí)，活性大。（淀粉類(lèi)食物豐富） 相互彌補(bǔ)的兩套系統(tǒng)保證變異鏈球菌在不同環(huán)境中都能迅速攝取外界的糖，用于生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的糖成分經(jīng)固有糖分解途徑生成丙酮酸，經(jīng)無(wú)氧酵解產(chǎn)生有機(jī)酸。菌斑內(nèi)微

4、生物可以生成多種有機(jī)酸：乳酸、甲酸、丙酸、丁酸和琥珀酸。鏈球菌是產(chǎn)酸量最大，數(shù)量最多。變異鏈球菌能發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸，產(chǎn)酸速度也最快。酸的種類(lèi)影響齲病的發(fā)生。低pH值、低pK值的酸性產(chǎn)物和齲成正相關(guān)。各種有機(jī)酸的pH和pK值表具有耐酸性耐酸性（acid tolerance）是指細(xì)菌在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)和代謝的能力。在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，表明能進(jìn)一步代謝碳水化合物產(chǎn)酸，進(jìn)一步降低pH。 表能否合成細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外多糖細(xì)胞外多糖包括：葡聚糖、果聚糖和雜聚糖，其作用是參與菌斑基質(zhì)建設(shè)，促進(jìn)菌斑形成，有助于齲環(huán)境建立。菌斑基質(zhì)成分中1/3是細(xì)胞外多糖成分，葡聚糖占95%，果聚糖占1%。葡聚糖分為水溶性和水不溶性葡聚

5、糖；能合成水不溶性葡聚糖的變鏈菌株致齲力強(qiáng)；齲損表面菌斑基質(zhì)中含有更多的水不溶性葡聚糖；由于這些成分的改變導(dǎo)致菌斑中鈣、磷、氟濃度降低；空隙的增多導(dǎo)致大分子及帶電物質(zhì)（如唾液中緩沖物質(zhì)）不能進(jìn)入菌斑深層中和酸性或其他代謝產(chǎn)物；一些小分子糖和非帶電顆粒容易進(jìn)入，維持深層微生物生存條件，產(chǎn)酸致齲。水溶性葡聚糖、果聚糖和雜聚糖是細(xì)胞外能量貯備形式，當(dāng)外源性糖短缺時(shí)，這些能源儲(chǔ)備的水溶性多糖可降解為單糖，參與細(xì)菌代謝產(chǎn)酸。菌斑內(nèi)部分微生物，如變鏈、乳酸和放線菌等在外源性糖供應(yīng)充足時(shí)，能利用這些糖合成以糖原和支鏈淀粉形式的胞內(nèi)多糖，作為胞內(nèi)儲(chǔ)能形式，一旦外源性糖短缺，可以利用胞內(nèi)多糖作為能量來(lái)源，同時(shí)產(chǎn)

6、酸，降低pH。實(shí)驗(yàn)證明：產(chǎn)胞內(nèi)多糖的鏈球菌：位于菌斑深層、齲活性區(qū)域、致齲毒力強(qiáng)。致齲微生物種類(lèi)、致齲性鏈球菌及其致齲特性鏈球菌（Strepcococcus）是口腔中正常菌群，所占比例最大，接近50%，口腔中產(chǎn)酸最多的微生物。包括：變異鏈球菌群（mutans streptococci或Streptococcus mutans-group）、唾液鏈球菌群（Streptococcus salivarius-group） 、咽峽炎鏈球菌群（Sterptococcus anginosus-group）和輕緩鏈球菌群（Streptococcus mitis-group）變異鏈球菌群是一群表型特征相似，但

7、血清型、遺傳型各異的鏈球菌，因在不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)形態(tài)變異得名，包括：（表）變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌與人類(lèi)齲病的發(fā)生關(guān)系密切。變異鏈球菌的檢出率高于遠(yuǎn)緣鏈球菌；有變異未必有遠(yuǎn)緣，有遠(yuǎn)緣常?？蓹z出變鏈；口腔中二者同時(shí)檢出其患齲程度嚴(yán)重。遠(yuǎn)緣產(chǎn)酸速度和產(chǎn)乳酸量大于變鏈；耐酸強(qiáng)于變鏈；能合成水不溶性葡聚糖，不合成胞內(nèi)多糖。感染性疾病，窗口期，變鏈數(shù)量流行病學(xué)（表）變異鏈球菌致齲特性表現(xiàn)為牙面定植；產(chǎn)酸和耐酸，發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸，主要產(chǎn)物是乳酸，產(chǎn)酸力強(qiáng)，迅速，耐酸，耐酸力第二，合成胞外、胞內(nèi)多糖多糖。粘附能力變鏈對(duì)牙面有高親和力，對(duì)牙面的粘附包括蔗糖非依賴性粘附（sucrose-independent ad

8、hesion）和蔗糖依賴性粘附（sucrose-dependent adhesion）。蔗糖非依賴性粘附：是指變異鏈球菌通過(guò)表面的粘附素與牙面獲得性膜中的受體特異結(jié)合，使得細(xì)菌對(duì)牙面的粘附；粘附素包括表面蛋白和壁相關(guān)蛋白A（WapA）；參與變鏈粘附的受體來(lái)自唾液，包括：粘蛋白、淀粉酶、富脯蛋白；變鏈對(duì)牙面獲得性膜的粘附是粘附素和受體共同作用的結(jié)果。表面蛋白表面蛋白是變異鏈球菌的主要粘附素，主要毒力因子之一；存在于除b血清型外的所有變異鏈球菌細(xì)胞膜表面；多種命名，混亂：AgI/II、P1、Pac、SpaP、Sr、AgB和IF；遠(yuǎn)緣表面蛋白命名為：SpaA、PAg；二者高度同源。結(jié)構(gòu)：圖一個(gè)信號(hào)肽

9、區(qū)域；兩個(gè)保守區(qū)域A區(qū)和P區(qū)，之間是可變區(qū)域；SBR是唾液糖蛋白結(jié)合區(qū)，P區(qū)附近是另一粘附區(qū)；粘附區(qū)是疫苗選擇的好點(diǎn)。表面蛋白粘附區(qū)和獲得性膜中受體以共價(jià)鍵方式結(jié)合，定植于牙表面；也可在釋放酶作用下脫離細(xì)胞壁與受體結(jié)合，抑制細(xì)菌粘附。壁相關(guān)蛋白WapA參與對(duì)牙面的附著；也被稱為AgA或AgIII蔗糖依賴性粘附蔗糖存在蔗糖為底物，在酶作用下形成葡聚糖，帶負(fù)電荷的葡聚糖粘附到牙面或獲得性膜；變鏈表面葡聚糖酶受體與葡聚糖結(jié)合，完成粘附；受體是葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTF）和葡聚糖結(jié)合蛋白（glucan-banding proteins，Gbps），葡糖基轉(zhuǎn)移酶具有活性，利用蔗糖為底物，合成葡聚糖；細(xì)菌表面葡

10、聚糖受體與之結(jié)合粘附牙面葡聚糖結(jié)合蛋白是指有葡聚糖結(jié)合活性，無(wú)葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；有四種Gbps：GbpA、GbpB、GbpC和GbpD；GbpA、GbpD與GTF粘附序列高度同源。產(chǎn)酸變異鏈球菌能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蜜二塘、棉子糖、麥芽糖等多種糖產(chǎn)酸，產(chǎn)酸力強(qiáng)，產(chǎn)酸迅速，終末pH3.95-4.1 。變鏈利用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）合成乳酸，主要酸性產(chǎn)物，導(dǎo)致菌斑內(nèi)pH降低；LDH被認(rèn)為是主要的毒力因子。 耐酸所謂耐酸是指變異鏈球菌能在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)和代謝，并在酸性環(huán)境中有繼續(xù)產(chǎn)酸的能力。變鏈最低生長(zhǎng)繁殖pH是4.8.耐酸基質(zhì)：能將H+泵

11、出細(xì)胞，維持胞內(nèi)合適的pH環(huán)境質(zhì)子移位酶（proton-translocating membrane ATPase，H+-ATPase）完成這項(xiàng)工作，為跨膜蛋白，不受外界環(huán)境影響；消耗ATP，將H+泵出細(xì)胞，維持胞內(nèi)外pH梯度；這一過(guò)程稱為組成型耐酸性（constitutive acid tolerance）；不同微生物H+-ATPase最適活性pH不同（表） 誘導(dǎo)表達(dá)酸應(yīng)激蛋白（acid-stress proteins）在酸誘導(dǎo)下，變異鏈球菌上調(diào)表達(dá)一些酸應(yīng)激蛋白，這些蛋白是變異鏈球菌能夠耐受酸作用；這種現(xiàn)象是耐酸反應(yīng)性（acid tolerance response，ATR），指處于生長(zhǎng)曲

12、線指數(shù)期的細(xì)菌在亞致死性pH生長(zhǎng)一段時(shí)間后能產(chǎn)生酸適應(yīng)性，從而抵抗致死性低pH的損傷作用（圖解釋?zhuān)?；?yīng)激蛋白：Ffh：參與蛋白易位；與H+-ATP酶等耐酸相關(guān)蛋白結(jié)合，協(xié)助完成蛋白生物功能，將H+-ATP酶易位至細(xì)胞膜；Dgk:參與細(xì)胞膜磷脂酸的合成，維持膜結(jié)構(gòu)完整性；DnaK:催化新合成蛋白折疊，并使變形蛋白重新折疊；GluA: 催化磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為細(xì)胞膜糖磷脂前體，影響細(xì)胞膜；DltC：參與丙胺?；妆谒岷铣?，形成阻止H+流入細(xì)胞內(nèi)屏障。胞漿內(nèi)有酸性環(huán)境中保持活性的酶：維持糖酵解最低pH4.4，提供ATP，為H+-ATPase提供能量，泵出H+；合成水不溶性葡聚糖可阻礙H+擴(kuò)散，起屏障作

13、用。合成胞內(nèi)外多糖胞外多糖包括葡聚糖和果聚糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，GTF）合成葡聚糖的酶，變鏈固有酶；只能利用蔗糖做底物；最適pH5.5，pH5.2-7.0均有活性；具有蔗糖酶活性，裂解蔗糖為葡萄糖和果糖，隨后將葡萄糖分子連接為葡聚糖；合成葡聚糖有水溶性葡聚糖（water-soluble glucan）和水不溶性葡聚糖（water-insoluble glucan），又稱為變聚糖（mutan）；變異鏈球菌有三種GTF，分別有g(shù)tfB、gtfC和gtfD基因編碼，不同GTF合成不同葡聚糖；gtfB對(duì)應(yīng)GTF-I,位于細(xì)胞表面，是結(jié)合型蛋白，合成水不溶性葡聚糖；gt

14、fC對(duì)應(yīng)GTF-SI，為結(jié)合型蛋白或游離型蛋白，存在與培養(yǎng)上清液中，合成水不溶性葡聚糖和少量低分子水溶性葡聚糖；gtfD編碼GTF-S，為游離型GTF，合成水溶性葡聚糖；三組基因均存在于變鏈DNA中，gtfB、gtfC串聯(lián)排列；gtfC編碼GTF-SI對(duì)于變鏈形成的蔗糖依賴型粘附起重要作用；三種GTF氨基酸序列高度同源(圖)，解釋功能；遠(yuǎn)緣鏈球菌gtfI基因合成水不溶性葡聚糖，gtfS基因合成水溶性葡聚糖；血清型d的遠(yuǎn)緣鏈球菌合成水不溶性葡聚糖能力最強(qiáng)。胞外多糖圖講解變鏈產(chǎn)生胞外多糖致齲的特點(diǎn)（圖）胞外多糖： 變鏈合成最多； 齲活性患者變鏈合成水不溶性葡聚糖多； 水不溶性葡聚糖與鄰面齲相關(guān)，蔗

15、糖依賴性粘附； 水不溶性葡聚糖促進(jìn)微生物共聚； 水不溶性葡聚糖形成生物膜結(jié)構(gòu)，阻礙物質(zhì)交換，維持生物膜內(nèi)低pH； 致齲重要因素。果糖基轉(zhuǎn)移酶（fricpsuamsferase，F(xiàn)TF）為變鏈固有酶；蔗糖為底物產(chǎn)生果聚糖；果聚糖為水溶性，與水溶性葡聚糖共同作為變鏈細(xì)胞外能源儲(chǔ)備形式；外源糖不足時(shí)被降解產(chǎn)酸，致齲。 其他鏈球菌變鏈?zhǔn)侵饕慢x菌，但不是唯一的致齲菌。牙釉質(zhì)早期脫礦可以在沒(méi)有變鏈的情況下發(fā)生，非變異鏈球菌族（non-mutans streptococci）所致。牙菌斑內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)酸圖，均可產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH降低，造成釉質(zhì)脫礦。血鏈球菌 牙菌斑先驅(qū)菌；形成水溶性葡聚糖；變異鏈球菌增多，血鏈球菌減

16、少；血鏈球菌檢出率相同，但數(shù)量與齲呈負(fù)相關(guān)；推遲變異鏈球菌定植時(shí)間；變異鏈球菌數(shù)量/血鏈球菌數(shù)量預(yù)測(cè)齲風(fēng)險(xiǎn) 乳桿菌（Lactobacillus） 致齲有利證據(jù)： 產(chǎn)酸、耐酸； 齲洞中發(fā)現(xiàn)大量嗜酸、干酪、發(fā)酵乳桿菌； 誘發(fā)窩溝齲； 齲損程度與乳桿菌數(shù)量呈正相關(guān)； 口腔環(huán)境惡略，乳桿菌數(shù)量增加； 碳水化合物增加，乳桿菌數(shù)量增加。 致齲無(wú)利證據(jù)： 與牙面親和力低； 不具感染性； 動(dòng)物致齲實(shí)驗(yàn)失敗。 放線菌（Actinomyces） 致齲證據(jù)： 發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸； 能粘附牙面； 牙菌斑中比例高； 合成胞內(nèi)多糖、水溶性胞外多糖； 流行病學(xué)證明與根面齲相關(guān)。 發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸； 能粘附牙面； 牙菌斑中比例高；

17、 合成胞內(nèi)多糖、水溶性胞外多糖； 流行病學(xué)證明與根面齲相關(guān)。 內(nèi)氏放線菌基因II 菌毛I(xiàn)：與富脯蛋白和富酪蛋白結(jié)合； 菌毛I(xiàn)I凝集素樣成分，共聚； 產(chǎn)生涎酶-粘蛋白釋放涎酸-暴露半乳糖-菌毛I(xiàn)I粘附； 利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖產(chǎn)酸； 代謝產(chǎn)物乙酸、乳酸、甲酸、琥珀酸、乙醇等； 有氧代謝，生成乙酸； 無(wú)氧酵解，產(chǎn)生乳酸； 儲(chǔ)存多糖，外源糖原不足時(shí)，多糖酵解產(chǎn)酸； 實(shí)驗(yàn)證實(shí)根面齲 第三節(jié) 致齲機(jī)制非特異菌斑學(xué)說(shuō) Miller提出：化學(xué)細(xì)菌學(xué)理論 產(chǎn)酸菌+碳水化合物酸 無(wú)機(jī)物溶解、有機(jī)物支架水解 齲 是菌斑內(nèi)所有細(xì)菌作用結(jié)果，與菌斑組成無(wú)關(guān) 預(yù)防方法：去除菌斑 特異菌斑學(xué)說(shuō) 不同部位牙菌斑、細(xì)菌組成不同 特異菌斑學(xué)說(shuō) 分離出齲相關(guān)微生物 流行病學(xué)證明：變異鏈球菌多的牙面易患齲 非致齲菌 齲流行病學(xué)研究：釉質(zhì)齲、根面齲、牙本質(zhì)齲細(xì)菌組成不同 不同部位牙菌斑、細(xì)菌組成不同 分離出齲相關(guān)微生物 流行病學(xué)證明：變異鏈球菌多的牙面易患齲 菌斑中存在非致齲菌 針對(duì)特