普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義(XXXX物理)

1、.PAGE ：.；PAGE 17普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義2021年版紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院普通生物學(xué)課程組編移液器的運(yùn)用方法按照以下步驟可以用移液器正確而準(zhǔn)確地移取液體：選擇一支量程適宜的移液器。大多數(shù)可調(diào)式移液器只能在特定量程范圍內(nèi)準(zhǔn)確移取液體，不能移取低于闡明書上最低的液體。一定不要試圖移取超越最大量程的液體，否那么會(huì)損壞移液器。常用移液器有三種量程：100l1ml，10l100l，0.5 l10l。設(shè)置移液量。經(jīng)過旋鈕設(shè)置刻度：刻度普通由三-四個(gè)數(shù)字組成，從上往下讀或從左往右讀，用黑色的調(diào)理輪調(diào)理容積圖2-4。這三個(gè)數(shù)字是容積的前三位數(shù)，由移液器的最大容積標(biāo)在推進(jìn)按鈕上面決議。將新的一次性槍

2、頭裝在吸液桿上。二者要相匹配，并且安裝正確。用力推進(jìn)，并悄然旋轉(zhuǎn)槍頭使之套緊，否那么，移取的液體體積將少于設(shè)定的體積，溶液也會(huì)從槍頭上往下滴。槍頭通常裝在盒子里，運(yùn)用方便。假設(shè)需求無菌條件，那么整個(gè)過程都要按無菌操作進(jìn)展。檢驗(yàn)移液量。用移液器汲取一定體積的去離子水，放在天平上稱重，假設(shè)1mg水體積為1ul 1mm3，丈量誤差應(yīng)在1%的范圍內(nèi)。對(duì)于微量液體，可多次移取，如移取20次50ul的去離子水，質(zhì)量應(yīng)為100mg。假設(shè)移液器不準(zhǔn)，吸液量顯著多于或少于設(shè)定體積，可改用校準(zhǔn)的移液器，或?qū)⒁埔嚎潭认鄳?yīng)地調(diào)大或調(diào)小，進(jìn)展校準(zhǔn)實(shí)踐移液量比移液器的顯示值更重要。假設(shè)移液器不準(zhǔn)確，每次移取的體積變化更大

3、，就要進(jìn)展維修，校準(zhǔn)。汲取一定體積的液體。手握移液器，按下推進(jìn)按鈕，直到遇到一個(gè)阻力第一止點(diǎn)，察看所吸液體頁面，將槍頭垂直浸入液體中留意不能過深以致液體沾到移液器，緩慢平穩(wěn)地松開拇指，同時(shí)察看吸入液體有無氣泡，停1S左右，待液體吸入后，取出移液器。槍頭外壁不應(yīng)附有液滴。目測(cè)吸入槍頭的液體體積能否合理。如100ul體積約占P20型槍頭容積的一半。假設(shè)移液器堅(jiān)持竽握取， 槍頭安裝正確，那么不應(yīng)有液滴滴下。釋放液體。將槍頭頭部靠在器壁上，約成1020傾角。漸漸按下推進(jìn)按鈕直到終點(diǎn)，完全排出液體，堅(jiān)持推進(jìn)按鈕至終點(diǎn)的形狀取出移液器。退下槍頭。按下卸槍頭按鈕有的移液器不帶卸槍頭器，退下槍頭。假設(shè)槍頭被污

4、染了，可直接退到盛有消毒液功廢液的容器里。假設(shè)不反復(fù)取液，改換新的槍頭，反復(fù)上面的第58步。移液器必需卸掉槍頭后才干放在移液器架上。實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、運(yùn)用方法及察看【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解顯微鏡的構(gòu)造和各部分的作用，掌握顯微鏡的運(yùn)用技術(shù)和保養(yǎng)措施2. 學(xué)會(huì)簡(jiǎn)易暫時(shí)玻片的制造方法和生物繪圖方法【實(shí)驗(yàn)原理】一顯微鏡的主要構(gòu)造普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造主要分為三部分：機(jī)械部分、照明部分和光學(xué)部分。1.機(jī)械部分1鏡座：是顯微鏡的底座，用以支持整個(gè)鏡體。2鏡柱：是鏡座上面直立的部分，用以銜接鏡座和鏡臂。3鏡臂：一端連于鏡柱，一端連于鏡筒，是取放顯微鏡時(shí)手握部位。4鏡筒：連在鏡臂的前上方，鏡筒上端裝有

5、目鏡，下端裝有物鏡轉(zhuǎn)換器。5物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)：接于棱鏡殼的下方，可自在轉(zhuǎn)動(dòng)，盤上有34個(gè)圓孔，是安裝物鏡部位，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，可以互換不同倍數(shù)的物鏡，當(dāng)聽到碰叩聲時(shí)，方可進(jìn)展察看，此時(shí)物鏡光軸恰好對(duì)準(zhǔn)通光孔中心，光路接通。6鏡臺(tái)(載物臺(tái))：在鏡筒下方，外形有方、圓兩種，用以放置玻片標(biāo)本，中央有一通光孔，我們所用的顯微鏡其鏡臺(tái)上裝有玻片標(biāo)本推進(jìn)器(推片器)，推進(jìn)器左側(cè)有彈簧夾，用以夾持玻片標(biāo)本，鏡臺(tái)下有推進(jìn)器調(diào)理輪，可使玻片標(biāo)本作左右、前后方向的挪動(dòng)。7調(diào)理器：是裝在鏡柱上的大小兩種螺旋，調(diào)理時(shí)使鏡臺(tái)作上下方向的挪動(dòng)。粗調(diào)理器(粗螺旋)：大螺旋稱粗調(diào)理器，挪動(dòng)時(shí)可使鏡臺(tái)作快速和較大輻度的升降，所

6、以能迅速調(diào)理物鏡和標(biāo)本之間的間隔 使物象呈現(xiàn)于視野中，通常在運(yùn)用低倍鏡時(shí)，先用粗調(diào)理器迅速找到物象。細(xì)調(diào)理器(細(xì)螺旋)：小螺旋稱細(xì)調(diào)理器，挪動(dòng)時(shí)可使鏡臺(tái)緩慢地升降，多在運(yùn)用高倍鏡時(shí)運(yùn)用，從而得到更明晰的物象，并借以察看標(biāo)本的不同層次和不同深度的構(gòu)造。2照明部分裝在鏡臺(tái)下方，包括反光鏡，集光器。1反光鏡：裝在鏡座上面，可向恣意方向轉(zhuǎn)動(dòng)，它有平、凹兩面，其作用是將光源光線反射到聚光器上，再經(jīng)通光孔照明標(biāo)本，凹面鏡聚光作用強(qiáng)，適于光線較弱的時(shí)候運(yùn)用，平面鏡聚光作用弱，適于光線較強(qiáng)時(shí)運(yùn)用。2集光器(聚光器)位于鏡臺(tái)下方的集光器架上，由聚光鏡和光圈組成，其作用是把光線集中到所要察看的標(biāo)本上。聚光鏡：由一

7、片或數(shù)片透鏡組成，起會(huì)聚光線的作用，加強(qiáng)對(duì)標(biāo)本的照明，并使光線射入物鏡內(nèi)，鏡柱旁有一調(diào)理螺旋，轉(zhuǎn)動(dòng)它可升降聚光器，以調(diào)理視野中光亮度的強(qiáng)弱。光圈(虹彩光圈)：在聚光鏡下方，由十幾張金屬薄片組成，其外側(cè)伸出一柄，推進(jìn)它可調(diào)理其開孔的大小，以調(diào)理光量。3.光學(xué)部分1目鏡：裝在鏡筒的上端，通常備有23個(gè)，上面刻有5、10或15符號(hào)以表示其放大倍數(shù)，普通裝的是10的目鏡。2物鏡：裝在鏡筒下端的旋轉(zhuǎn)器上，普通有34個(gè)物鏡，其中最短的刻有“10符號(hào)的為低倍鏡，較長(zhǎng)的刻有“40符號(hào)的為高倍鏡，最長(zhǎng)的刻有“100符號(hào)的為油鏡，此外，在高倍鏡和油鏡上還常加有一圈不同顏色的線，以示區(qū)別。在物鏡上，還有鏡口率(N.

8、A.)的標(biāo)志，它反響該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡 鏡口率(N.A.) 任務(wù)間隔 (mm)10 0.25 5.4040 0.65 0.39100 1.30 0.11表中的任務(wù)間隔 是指顯微鏡處于任務(wù)形狀(物象調(diào)理清楚)時(shí)物鏡的下外表與蓋玻片(蓋玻片的厚度普通為0.17mm)上外表之間的間隔 ，物鏡的放大倍數(shù)愈大，它的任務(wù)間隔 愈小。顯微鏡的放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)與目鏡的放大倍數(shù)的乘積，如物鏡為10，目鏡為10，其放大倍數(shù)就為1010=100。二顯微鏡的運(yùn)用方法1低倍鏡的運(yùn)用方法1取鏡和放置：顯微鏡平常存放在柜或箱中，用時(shí)從柜中取出，右手緊握鏡臂，左

9、一手托住鏡座,將顯微鏡放在本人左肩前方的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座后端距桌邊12寸為宜，便于坐著操作。2對(duì)光：用拇指和中指挪動(dòng)旋轉(zhuǎn)器(切忌手持物鏡挪動(dòng))，使低倍鏡對(duì)準(zhǔn)鏡臺(tái)的通光孔(當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)聽到碰叩聲時(shí)，闡明物鏡光軸已對(duì)準(zhǔn)鏡筒中心)。翻開光圈，上升集光器，并將反光鏡轉(zhuǎn)向光源，以左眼在目鏡上察看(右眼睜開),同時(shí)調(diào)理反光鏡方向，直到視野內(nèi)的光線均勻亮堂為止。3放置玻片標(biāo)本：取一玻片標(biāo)本放在鏡臺(tái)上，一定使有蓋玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器彈簧夾夾住，然后旋轉(zhuǎn)推片器螺旋，將所要察看的部位調(diào)到通光孔的正中。 4調(diào)理焦距：以左手按逆時(shí)針方向轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)理器，使鏡臺(tái)緩慢地上升至物鏡距標(biāo)本片約5毫米處，應(yīng)留意在上升鏡臺(tái)時(shí)

10、，切勿在目鏡上察看。一定要從右側(cè)看著鏡臺(tái)上升，以免上升過多，呵斥鏡頭或標(biāo)本片的損壞。然后，兩眼同時(shí)睜開，用左眼在目鏡上察看，左手順時(shí)針方向緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)理器，使鏡臺(tái)緩慢下降，直到視野中出現(xiàn)明晰的物象為止。假設(shè)物象不在視野中心，可調(diào)理推片器將其調(diào)到中心(留意挪動(dòng)玻片的方向與視野物象挪動(dòng)的方向是相反的)。假設(shè)視野內(nèi)的亮度不適宜，可經(jīng)過升降集光器的位置或開閉光圈的大小來調(diào)理，假設(shè)在調(diào)理焦距時(shí)，鏡臺(tái)下降已超越任務(wù)間隔 (5.40mm)而未見到物象，闡明此次操作失敗，那么應(yīng)重新操作，切不可心急而盲目地上升鏡臺(tái)。2高倍鏡的運(yùn)用方法1選好目的：一定要先在低倍鏡下把需進(jìn)一步察看的部位調(diào)到中心，同時(shí)把物象調(diào)理到最

11、明晰的程度，才干進(jìn)展高倍鏡的察看。2轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，互換上高倍鏡頭，轉(zhuǎn)換高倍鏡時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)速度要慢，并從側(cè)面進(jìn)展察看(防止高倍鏡頭碰撞玻片)，如高倍鏡頭碰到玻片，闡明低倍鏡的焦距沒有調(diào)好，應(yīng)重新操作。3調(diào)理焦距：轉(zhuǎn)換好高倍鏡后，用左眼在目鏡上察看，此時(shí)普通能見到一個(gè)不太清楚的物象，可將細(xì)調(diào)理器的螺旋逆時(shí)針挪動(dòng)約0.51圈，即可獲得明晰的物象(切勿用粗調(diào)理器!)假設(shè)視野的亮度不適宜，可用集光器和光圈加以調(diào)理，假設(shè)需求改換玻片標(biāo)本時(shí)，必需順時(shí)針(切勿轉(zhuǎn)錯(cuò)方向)轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)理器使鏡臺(tái)下降，方可取下玻片標(biāo)本。3油鏡的運(yùn)用方法1在運(yùn)用油鏡之前，必需先經(jīng)低、高倍鏡察看，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。2將集光器

12、上升到最高位置，光圈開到最大。3轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭分開通光孔，在需察看部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后漸漸轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，從側(cè)面程度凝視鏡頭與玻片的間隔 ，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。4用左眼察看目鏡，并漸漸轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)理器至物象明晰為止。假設(shè)不出現(xiàn)物象或者目的不理想要重找，在加油區(qū)之外重找時(shí)應(yīng)按：低倍高倍油鏡程序。在加油區(qū)內(nèi)重找應(yīng)按：低倍油鏡程序，不得經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。5油鏡運(yùn)用終了，先用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。三顯微鏡運(yùn)用的本卷須知1持鏡時(shí)必需是右手握臂、左手托座的姿態(tài)，不可單手提取，以免零件零落或碰撞到其它地方。2

13、輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的邊緣，以免碰翻落地。3堅(jiān)持顯微鏡的清潔，光學(xué)和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，機(jī)械部分用布擦拭。4水滴、酒精或其它藥品切勿接觸鏡頭和鏡臺(tái)，假設(shè)沾污應(yīng)立刻擦凈。5放置玻片標(biāo)本時(shí)要對(duì)準(zhǔn)通光孔中央，且不能反放玻片，防止壓壞玻片或碰壞物鏡。6要養(yǎng)成兩眼同時(shí)睜開的習(xí)慣，以左眼察看視野，右眼用以繪圖。7不要隨意取下目鏡，以防止塵土落入物鏡，也不要恣意裝配各種零件，以防損壞。8運(yùn)用終了后，必需復(fù)原才干放回鏡箱內(nèi)，其步驟是：取下標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)器使鏡頭分開通光孔，下降鏡臺(tái)，平放反光鏡，下降集光器(但不要接觸反光鏡)、封鎖光圈，推片器回位，蓋上綢布和外罩，放回

14、實(shí)驗(yàn)臺(tái)柜內(nèi)。最后填寫運(yùn)用登記表。(注：反光鏡通常應(yīng)垂直放，但有時(shí)因集光器沒提至應(yīng)有高度，鏡臺(tái)下降時(shí)會(huì)碰壞光圈，所以這里改為平放)【儀器、資料與試劑】顯微鏡、擦鏡紙、鑷子、小剪、載玻片、蓋玻片、解剖針、外表皿、吸水紙、碘液、清水、香柏油、二甲苯； 洋蔥鱗莖?！緦?shí)驗(yàn)方法】1取一片干凈的載玻片，用滴管在其中央滴一滴蒸餾水。2取洋蔥鱗莖，把它切成八瓣，剝下一片新穎的肉質(zhì)鱗葉，用刀片在其內(nèi)外表劃一個(gè)邊長(zhǎng)為5mm的正方形，然后用鑷子撕下正方形塊內(nèi)表皮，將其置于載玻片上的水滴中留意表皮的外面應(yīng)朝上 ，假設(shè)內(nèi)表皮發(fā)生卷曲，應(yīng)細(xì)心用解剖針將其展平3蓋上蓋玻片，留意加蓋玻片時(shí)，應(yīng)該用鑷子夾住蓋玻片一側(cè)，使蓋玻片另

15、一側(cè)邊緣與水滴邊緣相接觸，然后漸漸放下，直到放平為止，這樣可使蓋玻片下的空氣逐漸被水?dāng)D出，以免產(chǎn)生氣泡，影響察看。假設(shè)水太多浸出蓋玻片外，可用吸水紙將多余的水吸去。4把裝好的片子放在顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍接物鏡察看，再換用高倍接物鏡察看細(xì)胞的詳細(xì)構(gòu)造，并用鉛筆繪制表示圖?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】 繪制洋蔥鱗葉內(nèi)表皮細(xì)胞表示圖。闡明：生物繪圖中繪出的圖要清楚，并正確的表示出形狀構(gòu)造的特點(diǎn)，繪圖本卷須知如下： (1) 繪圖要用黑色硬鉛筆，不要用軟鉛筆或有色鉛筆，普通用 2H 鉛筆為宜。 (2) 圖的大小及在紙上分布的位置要適當(dāng)。普通畫在接近中央稍偏左方，并向右方引出注明各部稱號(hào)的線條。各引出線條要整齊平列，

16、各部稱號(hào)寫在線條右邊 畫圖時(shí)先用輕淡小點(diǎn)或輕線條畫出輪廓，再按照輪廓一筆畫出與物象相符的線條。線條要明晰，比例要準(zhǔn)確。較長(zhǎng)的線條要向隨手的方向運(yùn)筆，或把紙轉(zhuǎn)動(dòng)再畫。同一線條粗細(xì)一樣，中間不要有斷線或開叉痕跡，線條也不要涂抹。 (4) 繪出的圖要正確，察看時(shí)要把混雜物、破損、重疊等景象區(qū)別清楚，不要把這些景象繪上。 (5) 圖的明暗及濃淡，運(yùn)用細(xì)點(diǎn)表示，不要采用涂抹方法。點(diǎn)細(xì)點(diǎn)時(shí)，要點(diǎn)成圓點(diǎn)，不要點(diǎn)成小撇。 (6) 整個(gè)圖要美觀、整潔，還要特別留意準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)二 線粒體超活染色與察看【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 察看活細(xì)胞內(nèi)線粒體的形狀、發(fā)育和分布2. 了解細(xì)胞和細(xì)胞器的超活染色技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】詹納斯綠可專

17、注性地對(duì)對(duì)線粒體進(jìn)展活染,這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料一直堅(jiān)持氧化形狀(即有色形狀),呈藍(lán)綠色?！緝x器、資料與試劑】1 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、剪刀、鑷子、解剖刀、載玻片、蓋玻片、吸管、牙簽、吸水紙2 試劑：Ringer液、1/5000詹納斯綠、1/3000中性紅3 資料：人口腔上皮細(xì)胞【實(shí)驗(yàn)步驟】在載玻片上滴1/5000詹納斯綠1-2滴取口腔上皮細(xì)胞牙簽刮取，與染液混合后于恒溫染色10-15min顯微鏡下察看，并繪制表示圖【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】繪出人口腔上皮細(xì)胞示線粒體的形狀與分布并簡(jiǎn)要分析。實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞膜的浸透性【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解溶血景象及其發(fā)活力制。2了解細(xì)胞膜的浸透性及各類

18、物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度?！緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)展物質(zhì)交換的選擇通透性屏障，是一種半透膜，可選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi)，可使細(xì)胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液，這種景象稱為溶血。將紅細(xì)胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細(xì)胞膜對(duì)各種溶質(zhì)的通透性不同，有的溶質(zhì)可進(jìn)入，有的溶質(zhì)不能進(jìn)入，進(jìn)入紅細(xì)胞的溶質(zhì)能提高紅細(xì)胞的浸透壓，使水進(jìn)入紅細(xì)胞，引起溶血。由于溶質(zhì)透入速度不同，溶血時(shí)間也不同，因此，發(fā)生溶血景象所需時(shí)間長(zhǎng)短可作為丈量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種目的。本實(shí)驗(yàn)選用紅細(xì)胞作為細(xì)胞膜透性的實(shí)驗(yàn)資料，將其放入不同的介

19、質(zhì)溶液中，察看紅細(xì)胞的變化。【儀器、資料與試劑】1器材：50ml燒杯、10ml移液管、滴管、試管12支、試管架2試劑： 0.9%生理鹽水；2種低滲溶液：0.017mol/L氯化鈉和0.032mol/L葡萄糖；10種等滲溶液：0.17mol/L氯化鈉、0.32mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化銨、0.17mol/L醋酸銨、0.17mol/L硝酸鈉、0.12mol/L草酸銨、0.12mol/L硫酸鈉、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮3資料：鴨血【實(shí)驗(yàn)步驟】低滲溶液處置：試管一支：鴨血紅細(xì)胞液ml蒸餾水 10ml等滲溶液處置0.17mol/L氯化鈉、0.1

20、7mol/L氯化銨、0.17mol/L醋酸銨、0.17mol/L硝酸銨、0.12mol/L草酸銨、0.12mol/L硫酸銨、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮等種溶液進(jìn)展同樣實(shí)驗(yàn)，步驟同上。3.察看實(shí)驗(yàn)結(jié)果【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】記錄在各種不同溶液中的溶血情況實(shí)驗(yàn)四 堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)利用堿裂解法獲得大腸桿菌質(zhì)粒DNA的原理與技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】用SDS處置細(xì)菌，使細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。釋放出來的DNA在強(qiáng)堿性NaOH條件下發(fā)生變性。再用酸性乙酸鉀來中和，使溶液處于中性，質(zhì)粒

21、DNA將迅速復(fù)性，而基因組DNA因分子較大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA未能充分復(fù)性，而且分子體積較大，那么與細(xì)胞碎片一同沉淀至離心管底部。經(jīng)過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。各試劑的作用：1溶液I：葡萄糖：添加溶液粘度，有助菌體懸浮，防止因機(jī)械剪切而DNA降解；EDTA： 螯合Ca2+、Mg2+等金屬離子，降低離子濃度，可抑制DNase的作用。2溶液II：0.2M NaOH：pH值 近12.6，使細(xì)胞破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性；1 SDS：陰離子型外表活性劑，作用有：解膜蛋白，破壞細(xì)胞膜；聚DNA結(jié)合蛋白；與蛋白質(zhì)構(gòu)成復(fù)合物，使蛋白量變性沉淀。3溶液III：

22、3M KAc與HAc：作用有：pH4.8，中和溶液II，使質(zhì)粒DNA復(fù)性；3M高鹽溶液，中和核酸的電荷，利于變性基因組DNA、RNA聚合沉淀；構(gòu)成溶解度更小的鉀鹽方式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，有助于蛋白等大分子的沉淀。4酚/氯仿/異戊醇的作用：酚和氯仿：外表變性劑，非極性分子，而水是極性分子，當(dāng)兩者與蛋白水溶液混合時(shí)，會(huì)擠去蛋白質(zhì)分子間的水分子，使蛋白質(zhì)失水變性；離心后因三者的比艱苦小不同，分為上層水相、中層蛋白相、下層酚和氯仿的有機(jī)溶劑相。兩者在去除蛋白質(zhì)時(shí)各有利弊：酚變性作用較強(qiáng)，但與水有一定程度的互溶，因此普通預(yù)先添加pH8.0的Tris.Cl水溶液使酚飽和，減少DNA的損失；堿性環(huán)境中D

23、NA比RNA更容易游離至水相；氯仿變性作用沒有酚強(qiáng)，但與水不相溶，而與酚相溶。因此經(jīng)酚抽提后，再用氯仿抽提，可在使蛋白量變性的同時(shí)一并去除剩余的酚。普通兩者以25：24的比例再參與1份異戊醇以降低分子外表張力，防止泡沫產(chǎn)生并有助于穩(wěn)定地分相。5乙醇：乙醇極性較低，可與水以恣意比相互溶，而DNA不溶于乙醇，是實(shí)驗(yàn)室最常用的DNA沉淀劑。無水乙醇：以22.5倍的體積與DNA溶液相混合，使乙醇的終濃度到達(dá)67以上，使DNA失水而易于聚合；同時(shí)結(jié)合Kac或NaAc等中和電荷作用，并低溫放置一段時(shí)間，使DNA沉淀下來。70乙醇：洗去DNA沉淀中的鹽類和有機(jī)溶劑等。6、無菌水與TE緩沖溶液：溶解DNA，其

24、中TE緩沖液有助于維持DNA的穩(wěn)定性。【儀器、資料與試劑】一儀器臺(tái)式離心機(jī) 混勻器 生化培育箱 冷凍離心機(jī) 移液器 制冰機(jī)二試劑1LB液體培育基；2LB固體培育基；3氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)；50mg/ml4溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH 8.0)。 成批配制,100ml每份,高壓滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4冰箱。5溶液：0.2 mol/L NaOH，1 SDS。6溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml,溶液終濃度為: K+

25、3mol/L, Ac- 5mol/L，高壓滅菌。7飽和酚：經(jīng)TrisClpH8.0飽和。 8酚/氯仿/異戊醇:按氯仿:異戊醇24:1體積比參與異戊醇。運(yùn)用時(shí)按體積/體積1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)。9TE緩沖液：10mmo/L TrisCl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲(chǔ)存于4冰箱中。三資料含質(zhì)粒的大腸桿菌槍頭，離心管，牙簽【實(shí)驗(yàn)方法】1取1.5ml培育液12000rpm離心1-2min，棄上清，搜集菌體。 2參與100l溶液I，振蕩或槍頭吹打混勻，使菌體充分懸浮。 3參與200l溶液II，溫暖上下顛倒2-3次，溶液轉(zhuǎn)

26、變?yōu)槔逋该鳌?參與150l溶液III，上下顛倒混勻數(shù)次，靜置2-3min。512000 rpm離心5min。6用牙簽挑出沉淀，上清加400l的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，12000 rpm離心5min。7汲取上層水相，參與1ml無水乙醇，混勻。留意不要吸到酚和中間層固體物質(zhì)84，12000rpm離心10min。9棄上清，參與0.5 ml 70乙醇，4，12000 rpm離心5 min。 10 棄上清，沉淀自然枯燥10 min后，加20l無菌水或TE緩沖液pH8.0溶解。114 保管備用【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理，留意察看實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的景象實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)

27、瓊脂糖凝膠電泳,及利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒及分析質(zhì)粒構(gòu)型?！緦?shí)驗(yàn)原理】瓊脂糖凝膠電泳法：是核酸檢測(cè)最常規(guī)的方法之一，其操作簡(jiǎn)便快速，所需樣品量很少。原理是根據(jù)插入DNA分子中的熒光染料溴化乙錠(Ethidium bromide, EB) 在紫外光的激發(fā)下發(fā)射的熒光，其強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將知濃度的規(guī)范樣品作為電泳對(duì)照，即可估計(jì)出待測(cè)樣品的濃度。如電泳后成像察看，僅需510ng的DNA；肉眼察看，可檢察0.050.1g的DNA。不同大小的DNA片段遷移率不同，遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比，分子量越大，在凝膠中遷移越慢。利用這一特性不同濃度的瓊脂糖凝膠可以分別從200bp至近50kb的D

28、NA片段在瓊脂糖凝膠電泳中，DNA分子的遷移率還與DNA分子構(gòu)型有關(guān)。質(zhì)粒DNA有三種構(gòu)型：1, 超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)DNAcovalently closed circular DNA，ccc DNA；2, 開環(huán)DNAopen circular DNA,oc DNA，雙鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂；3, 線狀DNAlinear DNA，兩條鏈在同一處斷裂；同一質(zhì)粒的不同構(gòu)型在電場(chǎng)中的遷移率不同，普通超螺旋型ccc最快，其次是線狀L，最慢的是開環(huán)型OC。同時(shí)，在抽提的質(zhì)粒DNA中，假設(shè)還有染色體DNA或RNA，或較多的蛋白質(zhì)，在瓊脂糖凝膠上也可分別察看到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度?！緝x器、資

29、料與試劑】一儀器冰箱，移液器，微波爐或電爐，程度電泳槽及電源，紫外分析成像系統(tǒng)二試劑150 xTAE：每1 L Tris 242 g 冰醋酸 57 mL 0.5molL EDTA 200 mL HCl調(diào)pH 至8.02凝膠加樣緩沖液(6x) 溴酚藍(lán) 0.25 蔗糖 40 3溴化乙錠EB溶液：配成10mg/ml，鋁箔或黑紙包裹容器,室溫儲(chǔ)存。 4瓊脂糖三資料質(zhì)粒，槍頭，離心管【實(shí)驗(yàn)方法】1用膠帶將洗凈、枯燥的程度板的邊緣封住，構(gòu)成一個(gè)膠模并程度放置，插入梳子。2用1TAE配置1的瓊脂糖凝膠，微波爐加熱至沸騰，瓊脂糖完全融解。3等凝膠溫度降至大約5060以下時(shí)，參與1mg/L溴化乙錠EB至終濃度為

30、0.5ug/mL或?qū)㈦娪竞蟮哪z浸入溴化乙錠溶液中染色；搖勻并平穩(wěn)倒入程度板中，防止產(chǎn)生氣泡。 4凝固后，將梳子悄然拔出。5去掉膠帶，將程度板放入加有1TAE電泳緩沖液的電泳槽中，并且使電泳緩沖液高出凝膠約1mm。6按以下比例混合： 6上樣緩沖液 2ul 質(zhì)粒DNA 10ul實(shí)驗(yàn)一抽提得到混勻后參與上樣孔，記錄點(diǎn)樣次序。7蓋好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)?shù)碾娪倦妷?V/cm及電泳方向(DNA由陰極向陽極)，通電，開場(chǎng)電泳。8約30分鐘后，停頓電泳，樣品在紫外燈下察看、成像?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】照實(shí)繪制察看到的電泳圖，并分析各條帶所代表的物質(zhì)【本卷須知】在紫外燈下察看，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡，以防紫外線損傷眼睛。溴化乙錠為致癌物，須戴一次性手套操作，并留意防止環(huán)境污染?！靖剑翰煌愋图皾舛拳傊欠謩eDNA片段大小范圍】實(shí)驗(yàn)六 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹拷?jīng)過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)