XXXX0809-膠體金快速免疫診斷技術(shù)

1、Colloidal Gold Lateral-Flow Diagnostic Technology膠體金免疫層析快速診斷技術(shù)-1快速檢測快速檢測是一種廉價的、一次性的、基于膜的檢測方法，它能提供分析物存在于液體樣品的視覺證據(jù)。這種檢測可以以獨立的試紙條，也可以以裝在塑料盒 中的形式進行。總的來說，做此項檢測至少需要200ul 的液體標本，可在2至5分鐘內(nèi)完成。在臨床檢測中，樣品可能有尿、血液、血清、唾液或其他體液。在非臨床檢測中，樣本可能是由土壤、粉塵、植物或者食品制備的微量溶液， 它們同樣可以直接應(yīng)用膜試紙條檢測。這種檢測方法無需儀 器操作，可應(yīng)用于臨床、實驗室、室外或者家庭通常為無操作經(jīng)驗

2、人員使用。 2快速膜檢測需求廣泛，可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域（見下表）。隨著靈敏度和特異性 的提升，大量的潛在應(yīng)用可能是作為替代昂貴儀器檢測方法的低成本選擇。 34為何使用金標記早期的快速檢測使用有色膠乳形成可視信號，目前的某些檢測仍使用此手 段。 過去和現(xiàn)在，乳膠法一直是凝集反應(yīng)主要的標記方法，這是因為它在結(jié)合 成分的存在下易于凝集。對于快速檢測而言，交聯(lián)物的穩(wěn)定性是避免假陽性的關(guān) 鍵，而易于凝集可能就是其產(chǎn)生假陽性的主要問題。 因為具有更好的潛在穩(wěn)定性，20 世紀 80 年代末，金標記被引入膜快速檢測 中。在適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)條件下，任何被精確大小的金顆粒都可以被重現(xiàn)性制造出來。 不同的大小可用于不同的用途

3、。其優(yōu)良的穩(wěn)定性、敏感性、精確性及可重復(fù)生產(chǎn) 性等特點使得金適合于在快速檢測中的應(yīng)用。金本性屬惰性元素，被適當(dāng)加工可 形成完整的球形顆粒。當(dāng)正確連接時，蛋白質(zhì)能牢固地結(jié)合在金顆粒表面，無論 是液態(tài)或固態(tài)都能保持長久的穩(wěn)定性。而且，若是在制造過程中蛋白被精確固定， 其與金交聯(lián)物的非特異性結(jié)合可被減至零。 5膠體金技術(shù)起源及現(xiàn)狀6起源1971年,Faulk 和Taytor引入7原理免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀

4、態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細胞生物學(xué)等領(lǐng)域。8現(xiàn)狀層析法(Lateral-Flow)滲濾法(Through)免疫金銀染色法膠體金的作用: 指示劑9與常規(guī)診斷方法相比 優(yōu)點缺點快速：全部檢測過程僅需 3-10分鐘。簡便：不需其它任何儀器設(shè)備，操作也極其簡單

5、，無需專業(yè)人員，攜帶方便，可隨時隨地進行。廉價：單個測試條成本極低可單份檢測：對標本既能成批檢測，又可單份檢測，可立刻拿到結(jié)果，不必等待。穩(wěn)定性好：金標試劑穩(wěn)定，可長期保存。檢測標本種類多：既可用于查血，又可用于檢尿或唾液，因而適合各種檢查定量問題靈敏度問題10技術(shù)應(yīng)用類別應(yīng)用領(lǐng)域檢測的物質(zhì)人類醫(yī)學(xué)各級醫(yī)院,血站,CDC,防疫站,診斷中心；家庭自檢；商檢系統(tǒng)；邊檢口岸；公安系統(tǒng).傳染?。ㄒ腋挝屙?HIV, SARS等）標志物（AFP、肌鈣蛋白、糞便血紅蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（嗎啡,K粉,搖頭丸,冰毒）農(nóng)牧業(yè)畜牧獸醫(yī)站, 商檢系統(tǒng),邊檢口岸,農(nóng)牧類院系和研究所傳染病

6、（禽流感,獸瘟疫等）病毒（煙草花葉病毒、犬細小病毒等）環(huán)境環(huán)保監(jiān)測部門,研究機構(gòu)有害物質(zhì)超標食品安全食品安全檢測中心,各監(jiān)管部門農(nóng)獸藥殘留（磺胺類、瘦肉精等）,大腸桿菌,黃曲霉素11膠體金層析法一個快速檢測的底層一般是硝酸纖維素膜，在它上面固 定了檢測蛋白，通常是抗體或抗原。 連接著膜的是包含有干燥金標的金標墊（通常是玻璃 纖維）。對于目前大多數(shù)可做的檢測項目，這種結(jié)合墊含有吸附了針對待檢分析 品的特異性抗體或抗原的 金粒子。樣品墊通常為紙 質(zhì)，附著著結(jié)合墊。當(dāng)使用 樣品墊時，液體樣品通過 毛 細擴散作用穿移過結(jié)合 墊，再水化金交聯(lián)物，使待 分析樣品與交聯(lián)物相互作 用。然后金交聯(lián)物與待分析 樣

7、品復(fù)合物轉(zhuǎn)移至膜條帶上再移向蛋白結(jié)合物，復(fù)合物在此處被固定后以一條細 細的紅線的形式產(chǎn)生明顯的信號。第二條線是控制線，由余下的金交聯(lián)物形成于 膜上，表明測試完成。 12試紙條組成結(jié)構(gòu)測試線 （T線）控制線（C線）膠體金墊吸水濾紙樣品墊NC膜（硝酸纖維素膜）層析方向PVC底板13層析法技術(shù)優(yōu)勢:簡單現(xiàn)場快速1.打開包裝取出試紙條2.直接插入待測樣品中3. 目測讀出結(jié)果（3-10分鐘內(nèi)）14免疫層析法檢測原理分類介紹（雙抗體夾心）（以HCG檢測為例）15免疫層析法檢測原理分類介紹（競爭反應(yīng)）（以嗎啡檢測為例）16免疫層析法檢測原理分類介紹（應(yīng)用proteinA金標）（以HIV檢測為例）17膠體金滲

8、濾法將蛋白質(zhì)抗原直接點樣在硝酸纖維膜上，在硝酸纖維膜下墊有吸水性強的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原（抗體）后，迅速加抗體（抗原），再加金標記第二抗體，由于有滲濾裝置，反應(yīng)很快，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng)。此方法已成功地應(yīng)用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測。18膠體金銀染色法膠體金銀染色法（DotIGSIGSS）是將斑點ELISA與免疫膠體金結(jié)合起來的一種方法。將蛋白質(zhì)抗原直接點樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應(yīng)后，再滴加膠體金標記的第二抗體，結(jié)果在抗原抗體反應(yīng)處發(fā)生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點，此稱為斑點免疫金染色法（DotIGS）。此反應(yīng)可通過銀顯影液增強，即

9、斑點金銀染色法（DotIGSIGSS）。19膠體金免疫層析系統(tǒng)技術(shù)路線20技術(shù)路線膠體金制備技術(shù)標記技術(shù)NC膜與溶液噴點膠體金墊與溶液噴點樣品墊吸水紙粘性底板干燥方法溶液體系分析裝配切條包裝21膠體金的制備22制備原理所有的生產(chǎn)方法 都是使用還原劑提供電子給溶 液中帶正電荷的金離子而產(chǎn)生 金原子，如下所示： 氯金酸還原劑膠體金 HAuCl4 + e = Au0 通常使用的還原劑包括檸 檬酸鈉、黃磷、硼氫化鈉、硫氰 酸鈉。2324根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1500nm的膠體金粒子，但做為免疫標記探針，其直徑應(yīng)在3-30nm范圍內(nèi)。在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形

10、成膠體金粒子。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。即粒子大小取決于反應(yīng)溶液中最初還原試劑和還原核的數(shù)量。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原中心開始，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。粒子直徑每增加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。25以檸檬酸鈉和單寧酸做還原劑，能夠制備大小相對一致、直徑316nm的膠體金。因此一般膠體金探針均使用該方法進行。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。此時在溶液中添加0.10.2的H2O2能夠去除這些殘基。雙標記或制備5-10 nm的膠體金時建議使用該方法。利

11、用檸檬酸為還原劑，可以制備12150 nm直徑的膠體金。但制備大體積的膠體金時，膠體金粒子的誤差也同時增加。因此做單標記時，建議使用該方法制備12-16 nm直徑的膠體金。除了上述方法外，也可以用磷作為還原劑來制備5 nm的膠體金，它避免了單寧酸殘基的問題，但所形成的金粒子體積變化較大。磷易燃且有毒，制備的殘液需進一步處理，故該方法已經(jīng)很少使用。26白磷還原法制備5 nm膠體金取250 ml三角瓶一個，加79 ml雙蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3將溶液調(diào)至中性（pH7.0）。取0.2 ml飽和磷/乙醚溶液加到1.5 ml試管中，再加0.8 ml乙醚，混勻。取0.7 m

12、l加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作請帶手套，多余的磷溶液用CuSO4進行中和)。室溫下輕輕搖勻15 min，然后加熱沸騰并保持5 min，自然冷卻。27單寧酸/檸檬酸鈉法制備316 nm膠體金取一250 ml三角瓶，加入79 ml雙蒸水和1 ml 1氯化金，預(yù)熱至6070。取一50 ml燒杯，加入4 ml 1檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小加入不同用量的單寧酸及等量的25 mM K2CO3。預(yù)熱至6070。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果單寧酸的量少于0.5 ml時，對pH的影響不大，K2CO3可以省略。將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘。自然冷卻。

13、檸檬酸鈉（ml）單寧酸（ml）膠體金（nm）4500034200044500641208470104101628檸檬酸三鈉法制備12-30 nm膠體金(Frens, 1973)取250 ml三角瓶一個，加100 ml雙蒸水及1 ml 1%氯化金，加熱沸騰；取不同量的1%檸檬酸鈉加入上述溶液中?；靹颍俦３址序v30 min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時，則顏色偏向紫色。檸檬酸鈉(ml)膠體金(nm)5124163242.83029制備高質(zhì)量膠體金的注意事項（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理（1雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時，烘干）的玻璃器皿，

14、或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45m）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進口的。（5）氯金酸配成1水溶液在4可保持數(shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解，暫時不用的可以用1.5 ml試管分裝為1 ml保存（-20）。30由于使

15、用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在制備完成后必須進行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。膠體金溶液最好保存在4冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存1-2個月。但決不可保存在0以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。31蛋白-金復(fù)合體的制備32必須了解蛋白與膠體金持久結(jié)合的物理及化學(xué)進程，僅僅把交聯(lián)物揉合到一起， 雖然成本低廉且簡易，卻通常會導(dǎo)致聚集體的形成。一種好的交聯(lián)物表現(xiàn)為蛋白吸附于金的表面上，與膠乳不同的是，蛋白是被 動地吸附于交聯(lián)物表面，因而不會出現(xiàn)共價結(jié)合。33一般認為膠體金粒子表

16、面為一層AuCl2，因此，粒子表面帶有負電荷，這種負電荷粒子之間相互排斥，形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。金顆粒表面可以包被一層生物大分子（如蛋白）來穩(wěn)定和保護這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。膠體金粒子對蛋白的吸附作用取決于pH值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的pH值，在pH=pI時為中性。由于在pH=pI時蛋白溶解度最小，因此這時它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在實際的膠體金探針制備中，一般膠體金調(diào)整為pH=PI+0.5，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。在接近蛋白質(zhì)的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，則會聚集

17、而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。34蛋白通過以下機制于幾秒之 內(nèi)吸附于金表面金粒子所帶負電荷與蛋 白內(nèi)氨基酸（如賴氨酸） 所帶陽性電荷的最初的 相互吸引 蛋白通過某些氨基酸殘 基包括色氨酸與金粒子 表面之間的疏水吸附作用 蛋白中的半胱氨酸的硫基與金粒子間的配價結(jié)合 35金顆粒大小的選擇 檢測信號是由金顆粒聚集于測試線或控制線而出現(xiàn)的信號。這些粒子必須足 夠大到能被看見，粒子的尺寸越大，這 些粒子聚集后就越容易被看見。隨著粒子尺寸的增大，位阻現(xiàn)象又 成了一個問題。此外，這些粒子的尺寸越大，它們在既定體積溶液中存在的數(shù)量越小。 這種可

18、見度的需要與位阻現(xiàn)象之間的矛盾現(xiàn)象表明，對于大多數(shù)的免疫檢測 應(yīng)用而言，最適的粒子大小是 40nm。在某些情況下當(dāng)位阻現(xiàn)象成為較大問題時 （如針對較小的抗原），20nm 的粒子則更為合適；當(dāng)希望出現(xiàn)更深顏色或當(dāng)分子表面較低的曲率提高了抗原抗體分子間的交互作用，較大一點的粒子則更為可 取。應(yīng)該由實驗決定確定多少顆粒大小能帶來高靈敏度、淺背景色和高穩(wěn)定性。 3637蛋白必須要經(jīng)過前處理（1）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進行。（2）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，

19、可同時與多個膠體金粒子結(jié)合，影響標記的靈敏度和定量分析。（3）使蛋白具有適當(dāng)?shù)姆肿恿?。蛋白分子量過?。?0 kD），形成的金-蛋白復(fù)合體往往是不穩(wěn)定，可短時間內(nèi)失活。而分子量過大時，被認為影響金-蛋白復(fù)合體的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心的情況下，去除對活性武影響的結(jié)構(gòu)部分是提高標記靈敏度，延長金-蛋白復(fù)合體壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的金-蛋白復(fù)合體。38抗體 Antibody來源差異: 鼠抗,兔抗和羊抗種類差異: 單抗,多抗腹水的處理: 飽和硫酸銨沉淀法特異性:親和層析柱濃度: 濃縮溶解液:不含鹽,例如

20、PB抗原抗體生物原料抗原 Antigen偶聯(lián)抗原物質(zhì): BSA, OVA等毒品檢測來源: 合成抗原39待標記蛋白溶液的制備 將待標記蛋白預(yù)先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4離心1h，去除聚合物。40確定膠體金與蛋白結(jié)合的最佳pH值對于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同pH值得膠體金結(jié)合后，只有某一特定pH值能夠形成結(jié)合最穩(wěn)定的金-蛋白復(fù)合體。在高濃度電解質(zhì)（如NaCl）作用下不會凝聚。不同蛋白的適宜pH范圍的寬窄大不相同。一般選擇最小適宜pH值為最佳pH值。但有些金-蛋白復(fù)合體的實際情況并不完全如此，最穩(wěn)

21、定金-蛋白復(fù)合體并不完全代表活性最好。這要靠實驗驗證。這里需要特別指出的是，使用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定變化。41由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時，采用精密pH試紙測定為宜。由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對低離子強度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對澄清無細小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因為它們都可吸附于顆粒表面而減弱膠體金對蛋白質(zhì)的吸附。42蛋白質(zhì)最適用量的選擇加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍的聚沉現(xiàn)

22、象；而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標記蛋白質(zhì)的最低用量，在實際工作中，可適當(dāng)增加1020。能夠形成穩(wěn)定金-蛋白復(fù)合體的蛋白的最小量。如果在制備金-蛋白復(fù)合體時加入太多的蛋白，不僅造成浪費，而且更為嚴重的是容易造成金-蛋白復(fù)合體凝聚，并嚴重影響標記活性。因為金-蛋白復(fù)合體溶液中的游離蛋白容易搶先與標記位點結(jié)合，起到“封閉”（Blocking）作用，而標記蛋白標記不上。在標記位點希少、被標記物含量較少的情況下要特別注意。43膠體金標記蛋白的純化超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金