脲酶定性的實(shí)驗(yàn)

1、脲酶定性的實(shí)驗(yàn)隨著膨化技術(shù)在飼料工業(yè)中推廣普及，越來(lái)越多的飼料生產(chǎn)商在配方中使用 膨化大豆粉,與其它蛋白資源一樣，大豆的適度熟化非常重要，熟化程度低會(huì)含抗 胰蛋白酶等營(yíng)養(yǎng)抑制因子，熟化度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致氨基酸利用率低.判斷膨化大豆粉是否合格的主要指標(biāo)是服酶活性服酶活性是指：在305C 和PH值等于7的條件下，每分鐘每克膨化大豆分解尿素所釋放的氨態(tài)氮的毫克數(shù). 服酶本身無(wú)營(yíng)養(yǎng)意義，但它與抗胰蛋白酶的含量接近,并且遇熱變性失活的程度與 抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用來(lái)作為膨化大豆加熱是否合適的間接估測(cè)指標(biāo) 服酶活性沒(méi)有負(fù)值,最低為0.在我國(guó)現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)推薦值為0.3,在美國(guó)一般認(rèn)為以 不超過(guò)0.2為宜

2、,并且針對(duì)日糧中有尿素的反芻動(dòng)物而言不得超過(guò)0.12，當(dāng)然對(duì)于 家禽和豬0.3或稍高都可以接受.國(guó)內(nèi)很多大企業(yè)一般均采用0.2.實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定服酶活性的方法較復(fù)雜，有滴定法和pH增值法兩種,已有研 究表明兩者對(duì)同一樣品測(cè)得的數(shù)值也不相等.目前國(guó)內(nèi)絕大部分企業(yè)都采用快速 而簡(jiǎn)單的簡(jiǎn)易判定方法定性地估測(cè)服酶活性，一般來(lái)說(shuō)，主要有如下兩種方法.液態(tài)法原理：大豆制品中的服酶可使尿素分解成氨,會(huì)使酚紅指示劑改變顏色.試劑2.1尿素:GB696，分析純.2.2酚紅指示劑2.2.1稱取0.1g酚紅，加1.43mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在研缽中研磨以促溶解； 2.2.2轉(zhuǎn)移至250mL定量瓶中，加蒸餾

3、水至刻度，搖勻備用.操作方法3.1取0.2g粉末樣品，置于25mL比色管中.3.2加0.02g尿素,加酚紅指示劑2滴,再加水20mL,充分搖勻15s.3.3記錄粉紅色出現(xiàn)時(shí)間，并根據(jù)時(shí)間判斷尿酶活性，顏色出現(xiàn)時(shí)間應(yīng)少于15min. 顏色出現(xiàn)時(shí)間 服酶活性1min極強(qiáng)15min強(qiáng)515min稍有15min 無(wú)同時(shí)作空白對(duì)照試驗(yàn).樣品空白（不加尿素）及試劑空白（不加樣品），只有上述空白正常時(shí),即酚紅指示劑 不改變顏色，試驗(yàn)結(jié)果才是可靠的.一般企業(yè)認(rèn)為7、8分鐘變色較為合適.二、半固態(tài)法原理：大豆制品中的服酶可使尿素分解成氨,會(huì)使酚紅指示劑改變顏色.試劑2.1 稀硫酸（H2SO4） 0.2N.2.2

4、尿素一酚紅試劑2.2.1將1.2克酚紅溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸餾水將之稀釋至約300mL；2.2.3加入90g尿素（分析純）并溶解之；2.2.4用蒸餾水稀釋至2L；2.2.5 加入 14mL 1.0N 的 H2SO4 或 70mL o.2N 的 H2SO4；2.2.6用蒸餾水稀釋至最后體積3L；2.2.7溶液應(yīng)具明亮的琥珀色.操作方法3.1在一個(gè)150ml的燒杯中倒入少量試劑，注意溶液必須呈明亮的琥珀色.若溶液 已轉(zhuǎn)變?yōu)樯罱奂t色，滴人稀硫酸溶液并攪拌之，直至溶液再度呈琥珀色.3.2量一匙粉末樣品，放置于培養(yǎng)皿中.在樣品上加入兩匙試劑，輕輕攪拌,將樣品平鋪于培養(yǎng)皿中.若

5、仍有干樣品斑點(diǎn)， 則再加入試劑，直至將樣品浸濕.放置5分鐘后觀察：沒(méi)有任何紅點(diǎn)出現(xiàn)：再任其放置25分鐘，若仍無(wú)紅點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明大豆粉過(guò)熟.有少量紅點(diǎn)：少量尿素酶活性,可用.樣品表面約有25%為紅點(diǎn)覆蓋：少量尿素酶活性，可用.豆餅表面約有50%為紅點(diǎn)覆蓋：尿素酶活性較高，不可以使用.豆餅表面的75% 100%為紅點(diǎn)覆蓋：尿素酶活性很高，樣品過(guò)生，不能使用. 以上兩種簡(jiǎn)易脲酶活性估測(cè)方法在國(guó)內(nèi)各飼料廠被廣泛采用，尤其是后者在膨化 大豆粉生產(chǎn)的在線檢測(cè)上很普遍.盡管這兩種方法原理一樣，但是，因其操作過(guò)程 差異,所以對(duì)膨化大豆粉品質(zhì)的反映內(nèi)容也不盡相同.三、液態(tài)法和半固態(tài)法之比較首先需要說(shuō)明的是,這兩種

6、脲酶活性快速檢測(cè)方法沒(méi)有行業(yè)約定俗成的名稱，筆者 接觸過(guò)的企業(yè)均只采用其中的一種方法，對(duì)前者可以稱之為“試管法”，后者稱之 為“表面皿法”，根據(jù)其實(shí)施的過(guò)程及樣品的狀態(tài)，筆者將其區(qū)分為“液態(tài)法”和“半固態(tài)法”.從實(shí)施方法來(lái)看，液態(tài)法是過(guò)程檢測(cè)，從開(kāi)始一直到規(guī)定時(shí)間段結(jié)束，而半固態(tài)法 屬于斷點(diǎn)檢測(cè)，是5分鐘后看結(jié)果；液態(tài)法通過(guò)控制各個(gè)體合格，總體自然合格, 而半固態(tài)法要求的是總體符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合格，即允許部分個(gè)體不合格.簡(jiǎn)單地說(shuō), 液態(tài)法要求每一個(gè)微粒的熟化程度均要滿足5分鐘以內(nèi)不變色，如果一個(gè)不合格, 整個(gè)批次為不合格；而半固態(tài)法允許部分微粒在5分鐘內(nèi)變色，部分不合格，總體 可以是合格的.從這

7、點(diǎn)上來(lái)說(shuō)，液態(tài)法對(duì)膨化大豆粉的品質(zhì)要求更高，控制更嚴(yán)格, 不僅要求熟化，而且要均勻熟化.舉例說(shuō)明,如果在熟化完全的大豆粉樣品中摻入 微量（可以是一粒）生大豆粉，液態(tài)法會(huì)立即變色從而判定為不合格，而半固態(tài)法 只是增加了一個(gè)變色點(diǎn),總體上仍是合格的.從上可以看出，這兩種檢測(cè)方法對(duì)膨化大豆粉品質(zhì)的反映內(nèi)容是不一樣的.半固態(tài) 法反映的是產(chǎn)品符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合格，而液態(tài)法反映的是完全合格.這兩種不同檢 測(cè)方法對(duì)膨化設(shè)備的要求也是有差別的,液態(tài)法要求設(shè)備能均勻熟化，而半固態(tài)法 允許產(chǎn)品出現(xiàn)部分不合格，只要總體上符合就可以，對(duì)膨化設(shè)備的要求自然要低.可能會(huì)有人疑問(wèn)，膨化大豆粉出來(lái)的不都應(yīng)該是均勻一致的嗎？其實(shí)

8、不然,物料在 膨化機(jī)內(nèi)受到濕、熱、機(jī)械剪切的共同作用從而熟化，機(jī)械剪切對(duì)膨化大豆粉所 起的作用大約能占三成多，如果結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上缺陷或部件磨損，就會(huì)導(dǎo)致熟化不均勻. 目前濕法膨化大豆粉的出料溫度大都在135度左右（對(duì)家禽和豬要求可能低點(diǎn)）， 六年前，筆者曾遇到過(guò)膨化大豆粉出料溫度在170度，用液態(tài)法檢測(cè)仍不合格，出來(lái) 的料有熟的，有褐變的，還有少許夾生的，如果用半固態(tài)法檢測(cè),估計(jì)就合格了 .次年, 一膨化廠使用某企業(yè)膨化機(jī)生產(chǎn)膨化大豆粉，因不熟被退貨六十噸,根據(jù)大部分企 業(yè)采用半固態(tài)法檢測(cè)的情況，將其以一定比例摻入熟化料中,最終符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的 合格.上述事件，大概就是這兩種不同測(cè)定方法的實(shí)踐意義吧

9、.月尿酶urease （水解酶）:脲酶試驗(yàn)原理：存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里.它是一種酰胺酶、能酶促有機(jī)物質(zhì)分子 中酶鍵的水解.尿酶的作用是極為專性的，它僅能水解尿素,水解的最終產(chǎn)物是氨 和碳酸.土壤尿酶活性,與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效磷含量 呈正相關(guān).根際土壤尿酶活性較高，中性土壤尿酶活性大于堿性土壤.人們常用土 壤尿酶活性表征土壤的氮素狀況.土壤中尿酶活性的測(cè)定是以尿素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量，也可以通 過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得.本方法是測(cè)定生成的氨量.試劑：1）甲苯2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100ml.3） 檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：

10、184克檸檬酸和147.5克氫氧化鉀溶于蒸餾水.將 兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋至1000毫升.4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）： 62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫 升丙酮，用乙醇稀釋至100毫升（A）,存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）.將AB溶液保存在冰箱中.使用前將2溶液各20毫升混合，用蒸餾水稀釋至 100毫升.5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%,溶液穩(wěn)定.6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：a精確稱取0.4717克硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml，得到1ml 含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：吸取配置好的氮

11、溶液10ml，定容至100ml,即稀釋了 10倍，吸取 1,3,5,7,9,11,13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml,再加入4ml苯酚鈉，仔細(xì)混合，加 入3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘，用水稀釋至刻度.將著色液在紫外分光光 度計(jì)上于578nm處進(jìn)行比色測(cè)定,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),以光密度值為縱坐標(biāo) 繪制曲線圖.取新鮮土壤7份，每份30g，裝于棕色廣口瓶中，先將1,3 二氯丙烯溶于丙酮（定 量），6份分別加入不同濃度均為1.5ml的1,3 二氯丙烯，使之在土壤中的濃度分 別為1、10、50、100、200、500jig/g,另1份相應(yīng)加入1.5ml的丙酮作為對(duì)照，然 后調(diào)節(jié)土壤

12、的含水量至最大田間持水量的60% （記錄此時(shí)重量，以便補(bǔ)充水分）. 放置于25C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)后第0d、1d,5d,10d （前10d密封,后來(lái)測(cè)定的敞口）、 20d,30d,40d,50d分別取土樣檢測(cè)尿酶的活性.取樣前，反復(fù)旋轉(zhuǎn)廣口瓶，混勻土樣, 一個(gè)處理隨機(jī)取3個(gè)重復(fù).1）稱取5g過(guò)1mm篩的風(fēng)干土樣于100ml容量瓶中.2）向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土樣濕潤(rùn)為度）并放置15分鐘3）之后加入10ml 10%尿素溶液和20ml檸檬酸緩沖液（PH6.7），并仔細(xì)混合4）將容量瓶放入37攝氏度恒溫箱中，培養(yǎng)24h5）培養(yǎng)結(jié)束后,用熱至38攝氏度水稀釋至刻度，仔細(xì)搖蕩，并將懸液用致密

13、濾紙過(guò) 濾于三角瓶中.6）顯色：吸取3ml濾液于50ml容量瓶中,加入10ml蒸餾水，充分震蕩,然后加入 4ml苯酚鈉，仔細(xì)混合，再加入3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘,用水稀釋至刻 度，溶液呈現(xiàn)（青定）酚的藍(lán)色.7）1h內(nèi)在（青定）酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）在分光光度計(jì)上用1cm液槽, 于578nm處將顯色液進(jìn)行比色測(cè)定.8）無(wú)土對(duì)照:不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同.以檢驗(yàn)試劑純度,整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置 一個(gè)對(duì)照9）無(wú)基質(zhì)對(duì)照：以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同.每個(gè)土樣都設(shè) 此對(duì)照.結(jié)果計(jì)算：土壤脲酶活性以24小時(shí)后100g 土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示.M=（X樣品一X無(wú)土一X無(wú)基質(zhì)）*100*10式中：M-土壤脲酶活性值X樣品一一樣品實(shí)驗(yàn)的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3-N毫克數(shù)X無(wú)土一一無(wú)土對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3-N毫克數(shù)X無(wú)基質(zhì)一一無(wú)基質(zhì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線