葡萄糖參考方法

1、測(cè)定葡萄糖的推薦參考方法樣本處理、保存和儲(chǔ)藏a：在處理任何葡萄糖溶液中最基本的預(yù)防措施是防止糖分解。這種方法設(shè)計(jì)用 于無(wú)細(xì)胞的樣本。為了更好地保持葡萄糖的最初濃度必須避免微生物和細(xì)菌污 染，這是樣本分解的主要來(lái)源，少量樣本的蒸發(fā)也可能產(chǎn)生嚴(yán)重問(wèn)題，由于化學(xué) 污染能在很短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生，因此，在處理和保存樣本時(shí)嚴(yán)格要求樣本瓶清潔、無(wú) 菌、密閉。b:葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶解稀釋在1g/L安息香酸溶液中，可抗微生物污染，它在4P可長(zhǎng) 期保存在室溫下可穩(wěn)定數(shù)周。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)的水稀釋液或其他稀釋液和復(fù)溶凍十品 對(duì)糖分解非常不穩(wěn)定，須經(jīng)過(guò)無(wú)菌或加入防腐劑處理。c：用于這個(gè)分析的樣本所使用的生物樣品嚴(yán)格限定為血清和血漿，兩

2、種標(biāo)本在 制備與保存中要求特殊的防腐抗細(xì)菌學(xué)糖酵解以及細(xì)胞學(xué)傷害。凍干血清產(chǎn)品不 一定分離這些污染物，通常比新鮮收集的陰性血清糖酵解速度快。血液在無(wú)菌條 件下收集，即使使用了防腐劑，過(guò)期控制與校準(zhǔn)品樣品也必須進(jìn)行過(guò)濾以除掉組 織細(xì)胞和微生物，由于細(xì)胞糖酵解的完全抑制劑有限，許多這樣物質(zhì)存在干擾問(wèn) 題，因此血漿與血清必須離心確保產(chǎn)生與細(xì)胞分離的血清。血清可以保存到任何 時(shí)間。在含有抗凝劑或收集的血清中加入足量防腐劑。肝素、草酸鹽、檸檬酸和 EDTA不干擾這項(xiàng)分析。NaF是安全防腐劑，但是作為高濃度的專用抗凝劑不可 避免的產(chǎn)生血漿不穩(wěn)定并干擾這項(xiàng)分析。肝素以外的抗凝劑導(dǎo)致血樣本中細(xì)胞內(nèi) 水和其他物

3、質(zhì)的滲透壓的改變，最終導(dǎo)致血漿葡萄糖濃度的改變。d.血中NaF在2.0mg/ml濃度是推薦防腐濃度。NaF最好與1mg/mlEDTA-Na2鹽 聯(lián)合使用，這個(gè)混合物在常規(guī)真空采血管中是可能的(加到收集的血清或血漿中， 1mg/ml NaF濃度足夠)。e：收集的新鮮樣本必須立即混勻，輕輕地溶解十的抗凝劑，防止冷凍血漿中Fb 的后期問(wèn)題.f樣本長(zhǎng)期儲(chǔ)藏的關(guān)鍵是無(wú)菌、密閉、低溫和遠(yuǎn)離細(xì)胞或化學(xué)污染物。超過(guò)48h 的保存，即使已經(jīng)經(jīng)防腐處理，樣本也應(yīng)在容器中冷凍，確保密閉和防止水蒸氣 滲入；選擇深色小玻璃瓶。通過(guò)特定的合適的螺旋帽可獲得一個(gè)很好的密封，在 小于30C的水容箱中冰凍樣本迅速融化。在同一瓶

4、反復(fù)溶解，樣本反復(fù)取樣， 增加樣本潛在分解、蒸發(fā)和污染的危險(xiǎn)。要求和材料說(shuō)明a:量值測(cè)量天平精密度天平準(zhǔn)確度樣本轉(zhuǎn)移(量取)b:分光光度計(jì)測(cè)量比色杯系統(tǒng)固定位置單一杯子單一 1.0cm比色杯340nm分光光度計(jì)特性光譜溶液、波長(zhǎng)和雜散光：340nm時(shí)半波寬8nm。重復(fù)測(cè)定340nm處 波長(zhǎng)精密度和準(zhǔn)確度在土2nm之間，340nm處雜散光0.1%，這些影響因素的總和 被消除時(shí)不降低儀器對(duì)超濃度NADH的溶液的線性反應(yīng)性，NADH溶液吸光度的實(shí) 驗(yàn)在340nm時(shí)，吸光度在正常設(shè)定狹縫寬度時(shí)為1.010%范圍內(nèi)。適當(dāng)?shù)目瞻?溶液時(shí)在儀器半波寬2倍外時(shí)不改變超過(guò)0.5%。（b）穩(wěn)定性：低于噪音，每小時(shí)

5、吸光度漂移0.001Abs，在要求的狹縫和能 量水平時(shí)，在1.0 Abs時(shí)，每小時(shí)吸光度漂移0.003 Abs。（c）分光光度計(jì)不精密度，包括噪聲。對(duì)0.000-1.500 Abs范圍甚至更寬 時(shí)，重復(fù)讀數(shù)時(shí)的變異率（1SD）0.0005 Abs或任意吸光度讀數(shù)的0.25%。（d）分光光度計(jì)線性：在0.100-1.000 Abs之間的任何水平，測(cè)定吸光度 的線性斜率是最好的，通過(guò)調(diào)零后，應(yīng)0.001 Abs或小于吸光度的0.5%。在葡萄糖分析或NADH的精確稀釋量的吸光度測(cè)量的定標(biāo)反應(yīng)曲線的測(cè)量 中，（分光光度計(jì)元件導(dǎo)致的）相應(yīng)濃度吸光度的變化率的測(cè)量誤差，與 0.2-1.000 Abs之間的

6、測(cè)定的變異率0.5%沒(méi)有明顯不同，0.2 Abs時(shí)，相應(yīng)影 響在均值變化率+0.001 Abs c：玻璃制品（1）所有玻璃制品必須化學(xué)清潔，清潔程序包括至少用（）沖洗2遍，蒸餾 水和在清潔環(huán)境中干燥。（2）（3）d：化學(xué)說(shuō)明書(shū)：（1）試劑水：（2）無(wú)CO水：試劑水在敞開(kāi)的長(zhǎng)頸燒瓶中煮沸15分鐘，用透明的玻璃瓶蓋 或用堿石灰帽蓋住冷卻，直到使用前。（3）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)：用國(guó)家標(biāo)物局有證D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：SRM917配制，葡萄糖 標(biāo)準(zhǔn)液的原有尖頂瓶?jī)?chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室的充滿無(wú)水硫酸鈣的真空干燥容器中。（4）化學(xué)試劑（a）硫酸鋅，7個(gè)結(jié)品水，ACS說(shuō)明書(shū)（b）Ba（OH） 2,8H2O, ACS 說(shuō)明書(shū)（c）醋

7、酸Mg,4 H2O, ACS說(shuō)明書(shū)（d）Tris base ， reagent grade（e）Tris -HCL reagent grade（f） B-NAD+（氧化型），2 H2O,純度98%，常規(guī)稱重。（g）ATP-Na2.3 H2O,純度98%，常規(guī)稱重。（h）牛血清AlB，第五部分，純度96-99%。（i） 葡萄糖-1-磷酸，二鈉鹽，4 HO，純度98%2（j）D-果糖，NAS/NRC說(shuō)明書(shū)（k）安息香酸：見(jiàn)ACS說(shuō)明書(shū)（5）酶說(shuō)明：（a） HK（ATP:6-磷酸D-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；EC 2.7.1.1）,酶來(lái)源于酵母，要求 高純度，4.d中給出恰當(dāng)?shù)拿笝z驗(yàn)數(shù)據(jù)，注意4.d（2）.（b

8、）G6PDH（6-磷酸-D-葡萄糖：NAD（P）氧化還原酶；EC 1.1.1.49），酶來(lái) 源于腸膜明串珠菌，可以懸浮于硫酸胺液或?yàn)閮龈煞?，要求高純度?.d 中給出恰當(dāng)?shù)尿?yàn)證數(shù)據(jù)，注意4.d（2）.血清或血漿中葡萄糖測(cè)定程序：a:原液標(biāo)準(zhǔn)液的配制：（1）安息香酸稀釋液（1g/l）：在大容量瓶中用2000ml熱的試劑水溶解 2.0gACS級(jí)安息香酸，徹底混勻，蓋蓋冷卻全室溫。全部液體倒進(jìn)試 劑瓶，密閉保存于室溫。（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液（10g/l）：稱取5.0000.002gNBS無(wú)水D-葡萄糖， 放入500ml class A級(jí)容量瓶中，用安息香酸稀釋液沖洗和稀釋葡 萄糖全容量瓶的2/3瓶處

9、，旋轉(zhuǎn)使葡萄糖完全溶解，加安息香酸溶 液至500ml標(biāo)記線下1cm處，把容量瓶放20C1C水槽中，水沒(méi)全 瓶頸處，密閉，用安息香酸稀釋液補(bǔ)足前平衡溶液30分鐘。塞緊顛 倒混勻至少10次，每一次顛倒、旋轉(zhuǎn)倒置容量瓶10秒。每125ml 一份，放入帶有螺旋蓋的硼硅酸鹽的瓶中，蓋緊并標(biāo)記，還要注明 日期。保存在4C或-20C。一瓶用于制備1整套系列標(biāo)準(zhǔn)液。如果 處理得當(dāng)，準(zhǔn)備充分，這種標(biāo)準(zhǔn)原液可以長(zhǎng)期穩(wěn)定，但還是建議每6 個(gè)月重新配制。在一個(gè)新批號(hào)開(kāi)始使用之前，從新標(biāo)準(zhǔn)原液配一個(gè) 新的mg/dl（11.10ml/l）工作標(biāo)準(zhǔn)，與舊的系列標(biāo)準(zhǔn)在一批測(cè)試各雙 份比較它們的變異。（3）葡萄糖工作標(biāo)準(zhǔn)液（a

10、）配制一套純品葡萄糖的系列工作標(biāo)準(zhǔn)液：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)原液和安息香酸稀 釋液在20C+1C的水浴箱中平衡30分鐘，按下表轉(zhuǎn)移等份的葡萄糖原 液至100ml classA容量瓶中，用安息香酸稀釋液稀釋至接近刻度，在 水浴箱中平衡15分鐘后調(diào)至刻度線。為配制標(biāo)準(zhǔn)需準(zhǔn)備一特殊系列的 CLASS A級(jí)100ml容量瓶和5、10、20ml加樣器。貯存標(biāo)準(zhǔn)（ml）用安息香酸稀釋液稀釋 的最終體積（ml）最終葡萄糖濃度Mg/dlmmol/L5.00100502.7810.001001005.5520.0010020011.1030.0010030016.6540.0010040022.20安息香酸稀釋液中一部分是

11、用于配制試劑空白的，它用作“0”濃度標(biāo)準(zhǔn)液。 一次配制一套完整系列標(biāo)準(zhǔn)液，如果任何一個(gè)濃度減少或有懷疑，整批都將被替 換。舊的和新的系列標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)一個(gè)分析批雙份分析測(cè)試進(jìn)行比較。工作標(biāo)準(zhǔn)液貯存于4-ounce聚乙烯螺旋帽瓶中，放4。不超過(guò)1個(gè)月。塑料存貯瓶的清洗很關(guān)鍵，交叉污染不被發(fā)現(xiàn)，對(duì)測(cè)定的影響會(huì)從一種 溶液倒另一種溶液。盡管安息香酸是一種很好的抗常規(guī)糖酵解微生物的 防腐劑，它不能防御嚴(yán)重的細(xì)菌污染。在每一分析日中，要求平衡至25r的工作標(biāo)準(zhǔn)重新分到干凈管中，原液 瓶重新放回冰箱。b試劑配制沉淀蛋白試劑ZnSO4溶液(22g/l)：用剛配好的熱的無(wú)CO蒸餾水大約900ml溶解22g ZnSO

12、47 H2O，溶液冷卻全室溫后，移到1L容量瓶中，用無(wú)CO2水稀釋至1000ml充 分混勻，移至玻璃瓶，密閉保存。2飽和Ba(OH)2溶液，用剛配好的熱的無(wú)CO2蒸餾水約950ml溶解剛開(kāi)瓶稱取的 80g Ba(OH)8H2O，溶液冷至室溫，移到、L容量瓶中，用無(wú)CO2蒸餾水稀釋 至1000ml，2充分混勻，轉(zhuǎn)移到存儲(chǔ)瓶中，存儲(chǔ)瓶用短圓柱形指示型SIO2凝 膠(硅膠)保護(hù)堿石灰咀，咀的壽命相當(dāng)短，堿石灰必須經(jīng)常更換。允許超 量的Ba(OH)2和不溶解的碳酸鹽沉淀過(guò)夜或幾天，必要時(shí)，稀釋前清除它。Ba(OH)溶液，0.11N。如果不干擾沉淀，轉(zhuǎn)移245ml飽和Ba(OH)到1L 容量瓶；用無(wú)CO

13、蒸餾水稀釋至1000ml，用這個(gè)稀釋的Ba(OH)溶液滴 定10ml硫酸鋅裕2液用酚酞做指示劑(0.5%指示劑溶解于95%乙醇中，2 滴)滴至淡粉色為終點(diǎn)，結(jié)果應(yīng)為10ml ZnSO溶液需要100.1ml Ba(OH) 溶液滴定。若超過(guò)這個(gè)范圍，在Ba(OH)溶液中根據(jù)大致計(jì)算量加入適 量Ba(OH)或無(wú)CO2水，重新滴定。轉(zhuǎn)移校正好的Ba(OH)溶液至使用堿 石灰咀和蘇打水瓶或細(xì)水瓶管試劑瓶中，每個(gè)月用滴定法檢查該溶液當(dāng) 量濃度。25r 時(shí)，PH7.5 的 0.1m Tris buffer,含 5.0mmol/l 乙酸鎂(a) TRIS-HCL原液，在2.0L的容量瓶中用試劑水溶解31.52

14、g TRIS-HCL并 稀釋到2000ml。Tris base原液：在500ml容量瓶中用試劑水溶解6.06 g Tris base并 稀釋至500ml。配制酶試劑時(shí)需新鮮配制這個(gè)原液。PH7.5 Tris -Mg buffer，在一個(gè)大燒杯里，混合 800ml Tris -HCL 液和 200ml的Tris base溶液，然后在溶液里溶解1.1g醋酸鎂。在25C測(cè)定 混合液的PH,必要時(shí)，用Tris-HCL液或Tris base溶液調(diào)至PH7.50.1。 用0.45 “m濾菌膜過(guò)濾溶液，到一個(gè)無(wú)菌帶螺旋帽的硼硅酸鹽玻璃貯存瓶 中，配酶試劑時(shí)要新鮮配制，貯存于4C冰箱。C :酶試劑的準(zhǔn)備與分析

15、(1)酶試劑成分的本質(zhì)分析(a)試劑Tris -白蛋白：在250ml容量瓶中用Tris -Mg buffer溶解0.5g牛血清 白蛋白，校正至250ml。儲(chǔ)存在大約4C冰箱。NAD+原液：在Tris -Mg緩沖液中溶解0.9952g氧化型NAD+，補(bǔ)足至250ml， 在4C冰箱保存，配制當(dāng)天測(cè)定。ATP原液：在Tris -Mg buffer中溶解0.8268g ATP二鈉鹽，并補(bǔ)足全 250ml，保存于4C冰箱，配制當(dāng)天測(cè)定。葡萄糖，用0.1%安息香酸稀釋60ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)原液至100ml，保存在4C 冰箱。己糖激酶原液：在25 C稱量或用Darrow和Colowick的方法或使用6-磷 酸葡

16、萄糖脫H酶的方法測(cè)定酶含量獲得總活性1250U的己糖激酶，轉(zhuǎn)移至250ml 酶的容量瓶，用Tris -Mg buffer調(diào)至刻度，放在4C冰箱保存，配制當(dāng)天分 析。6-磷酸葡萄糖脫H酶原液：在25 C稱量或用olive和Levy的方法或用己 糖激酶分析的一組相似的方法獲得總活性1250U的6-磷酸葡萄糖脫H酶。用Tris -Mg buffer溶解至250ml，保存于4C冰箱，配制當(dāng)天測(cè)定。注意：己糖激酶或脫H酶的活性可從廠家說(shuō)明書(shū)提供的分析資料獲得，這些信息 包括U/瓶(凍干或懸浮)，U/ml (懸浮)，U/mg (凍十)或U/mg蛋白和U/ml (懸 浮)，懸浮的液體最好通過(guò)稱重法測(cè)定體積量

17、或直接稱量1250U的酶，精確測(cè)量 1250U不是絕對(duì)必要的，但應(yīng)盡可能測(cè)準(zhǔn)。假如不能評(píng)估酶濃度，僅配制基本的 10ml酶原液并分析它。(b)己糖激酶分析(i )將上述試劑i -vi和0.1MTris - Mg緩沖液放在25C0.2C的水浴箱中，放 20分鐘，使液體達(dá)到預(yù)定溫度(原液放冰箱保存，除非需移液時(shí))。己糖激酶實(shí)驗(yàn)試劑：在一個(gè)帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的NAD+原液， ATP原液、葡萄糖、脫氫酶原液和Tris -Mg緩沖液，10ml可滿足最初的和重 復(fù)三次分析量。己糖激酶稀釋液:取1ml己糖激酶原液用0.2%Tris - ALB液稀釋至100ml。分析：將己糖激酶實(shí)驗(yàn)試劑、5ml己糖

18、激酶稀釋液和含有5ml 0.2%Tris -ALB液的密閉的試管放在25C0.2t的水浴箱中大約10分鐘使液體達(dá)到預(yù)定 溫度。空白測(cè)定Tris-ALB (ml)1.0HK稀釋液(ml)1.0HK實(shí)驗(yàn)試劑(ml)5.05.0混勻，立即轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25C0.2C樣本的分光光度計(jì)的2個(gè)檢測(cè) 反應(yīng)杯中，在340nm連續(xù)測(cè)定5分鐘內(nèi)空白和試驗(yàn)管的吸光度，對(duì)5分鐘內(nèi)任意 1分鐘吸光度變化應(yīng)基本一致，在0.005A/分以內(nèi)，對(duì)這個(gè)分析而言NAD+的下降 表示分析偏差。己糖激酶原液催化活性的計(jì)算。HK 原液活性量= (dA/dt)/(EXb) XVr/Vs=dA/dt X (1/6.23 X 103

19、 l.cm/mol.cm) X Vr/Vs=dA/dt X (0.0001605mol/l) X (10ep mol/mol) X (1/ 103ml ) X (6/Vs)= Atest(3 分)*.2 分) X ( 0.963|J mol/mol )X (1/Vs)=p mol/min.ml=U/ml(25CHK 原液)dA=吸光度變化率(本次分析用3分鐘和2分鐘讀數(shù)的變化)dt=測(cè)定時(shí)間變化E=摩爾吸光度(本次分析條件下，值為6.23X103l/mol.cm)b=光徑(用厘米表示)仁用毫升表示的總的反應(yīng)體積（上面給出的程序，體積為6ml： 5ml HK試驗(yàn)試 劑+1ml稀釋HK）Vs=用m

20、l表示的總反應(yīng)量中的酶原液量（上面給出的程序：1ml被稀釋HK加到 反應(yīng)混合液中（包含0.01ml酶原液），因此Vs是0.01ml。（vi）例如：配制一個(gè)HK原液：用廠家報(bào)告的含有1395U/ml的商業(yè)的懸浮于硫 酸銨溶液的HKlml,用Darrow和Colowick的方法在30C測(cè)定，用Tris - Mg buffer稀釋至250ml。HK分析中使用1mlHK原液，3分鐘時(shí)吸光度是0.203，在 2分鐘時(shí)，吸光度是0.166HK U/原液的 ml 數(shù)=（0.203-0.166） /minX 0.963 mol/ml X 1/0.01=3.56U/ml（在 25C）（c）6-磷酸葡萄糖脫氫酶分

21、析（i）將（a）中 i-vi試劑和 0.1MTris -Mg buffer 放在 25C0.2C的水浴 箱中，放20分鐘，使液體達(dá)到預(yù)定溫度（原液放冰箱保存，除非需移液時(shí)）。（ii）6-磷酸葡萄糖脫氫酶試驗(yàn)試劑：在一個(gè)帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的 NAD+原液，ATP原液、葡萄糖、HK原液和Tris -Mg緩沖液，10ml可滿足最初 的和重復(fù)三次分析量。（iii）6-磷酸葡萄糖脫氫酶稀釋液：取1ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液用0.2%Tris -ALB液稀釋至100ml。（iv）分析：將6-磷酸葡萄糖脫氫酶實(shí)驗(yàn)試劑、5ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶稀釋 液和含有5ml 0.2%Tris -ALB

22、液的密閉的試管放在25C0.2C的水浴箱中大 約10分鐘使液體達(dá)到預(yù)定溫度。空白測(cè)定Tris-ALB(ml)1.0G6PDH稀釋液（ml）1.0G6PDH實(shí)驗(yàn)試劑（ml）5.05.0混勻，立即轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25C0.2C樣本的分光光度計(jì)的2個(gè)檢測(cè) 反應(yīng)杯中，在340nm連續(xù)測(cè)定5分鐘內(nèi)空白和試驗(yàn)管的吸光度，對(duì)5分鐘內(nèi)任意 1分鐘吸光度變化應(yīng)基本一致，在0.005A/分以內(nèi)，對(duì)這個(gè)分析而言NAD+的下降 表示分析偏差。（V）6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液活性的計(jì)算 6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液活性二*知(3分)-Atest (2分) X ( 0.963仇mol/mol)X (1/Vs)test t

23、est=U/ml（25C6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液）Vs=在總反應(yīng)量中，酶原液的量（用ml表示）（上面給出的程序中，被加到反應(yīng) 混合液中的1ml稀釋的6-磷酸葡萄糖脫氫酶包含 0.01ml酶原液，因此 Vs=0.01ml）。其他因素的解釋見(jiàn)（b） （v）。（d）NAD+分析（i）將（a）中足量的 ii-vi 試劑和 0.1MTris -Mg buffer 放在 25C1C 的 水浴箱中，放20分鐘，使液體達(dá)到預(yù)定溫度（原液放冰箱保存，除非需移液時(shí)）。（n） NAD+試驗(yàn)試劑：在一個(gè)帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的ATP原液、葡萄 糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液和Tris -Mg緩沖液，10

24、ml足夠。（iii）稀釋NAD+：取5ml NAD+原液，用Tris -Mg緩沖液稀釋到100ml。（iv）分析：將NAD+實(shí)驗(yàn)試劑、5ml稀釋NAD+和含有5ml Tris -Mg緩沖液的密 閉的試管放在25C1C的水浴箱中大約10分鐘使液體達(dá)到預(yù)定溫度。空白測(cè)定Tris-Mg 緩沖液(ml)1.0NAD+稀釋液（ml）1.0NAD+實(shí)驗(yàn)試劑（ml）5.05.0混勻，立即轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25C1C樣本的分光光度計(jì)的2個(gè)檢測(cè)反 應(yīng)杯中，加入NAD+實(shí)驗(yàn)試劑10分鐘后，在340nm測(cè)定空白和試驗(yàn)管的吸光度。 反應(yīng)在10分鐘內(nèi)達(dá)到平衡。（v）NAD+原液中NAD+濃度的計(jì)算：C=A/ (EX

25、b)XVr/Vs=A (10 分)/ (6.23 X 103 l.cm/mol.cm) X (6ml/0.05ml)=* t(10 分)X0.01926mmol/ml=mmol/ ml(NAD+原液)C=濃度( mmol/ml)A=吸光度E=摩爾吸光系數(shù)(對(duì)于本試驗(yàn)：值是6.23X 103l/mol.cm)b=用cm表示的光徑Vr=用ml表示的總反應(yīng)體積Vs=在總反應(yīng)體積中NAD+原液體積(用ml表示)本試驗(yàn)中NAD+原液濃度至少應(yīng)在0.005mmol/ml之上，否則該來(lái)源NAD+不 能用于測(cè)定葡萄糖。ATP 分析：將(a)中足量的 ii-vi 試劑和 0.1MTris -Mg buffer

26、放在 25C1C 的 水浴箱中，放20分鐘，使液體達(dá)到預(yù)定溫度(原液放冰箱保存，除非需移液時(shí))。(n) ATP試驗(yàn)試劑：在一個(gè)帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的NAD+原液、葡萄 糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液和Tris -Mg緩沖液，10ml足夠。稀釋ATP：取5mlATP原液，用Tris - Mg緩沖液稀釋到100ml。分析：將ATP實(shí)驗(yàn)試劑、5ml稀釋ATP和含有5ml Tris - Mg緩沖液的密 閉的試管放在25C1C的水浴箱中大約10分鐘使液體達(dá)到預(yù)定溫度?？瞻诇y(cè)定Tris-Mg 緩沖液(ml)1.0ATP稀釋液(ml)1.0ATP實(shí)驗(yàn)試劑(ml)5.05.0混勻，立即轉(zhuǎn)移到已

27、含有溫度控制在25C1C樣本的分光光度計(jì)的2個(gè)檢測(cè)反 應(yīng)杯中，加入ATP實(shí)驗(yàn)試劑10分鐘后，在340nm測(cè)定空白和試驗(yàn)管的吸光度。 反應(yīng)在10分鐘內(nèi)達(dá)到平衡。ATP原液中ATP濃度的計(jì)算C= * t(10 分)X0.01926mmol/ml=mmol/ml(ATP 原液)各因素來(lái)源解釋見(jiàn)(d) (v)如果ATP原液濃度0.005mmol/l，則該ATP來(lái)源不適用于葡萄糖測(cè)定。酶試劑準(zhǔn)備(a)如果ATP、NAD+、HK和6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液按上述方法檢測(cè)合格， 酶試劑按下列方法配制：(i)在1L容量瓶中加200mlATP原液。()加 200ml NAD+原液()加入相當(dāng)于總活性800U的6-

28、磷酸葡萄糖脫氫酶原液，例如：6-磷酸葡萄 糖脫氫酶原液4U/ml，則需在這個(gè)容量瓶中加入200ml，如果原液2.7 U/ml， 則應(yīng)加入300ml。對(duì)于配制200ml的酶原始儲(chǔ)存溶液而言，加入純酶量相當(dāng)于起 始試劑量的4/5體積合適，這個(gè)新要求的原液量是計(jì)算起始量的一半。加入相等于總活性800U的HK原液到1L容量瓶中，例如：原液活性4U/ml， 則需在這個(gè)容量瓶中加入 200ml，如果酶原液含量2.7U/ml，則應(yīng)加入酶 量300ml，應(yīng)配制更高濃度的酶原液。對(duì)于200ml的起始的酶溶液而言，加入純 酶量相當(dāng)于起始試劑的4/5體積合適。用Tris - Mg緩沖液稀釋到1L，輕輕顛倒混勻，不要

29、用力振蕩。酶試劑配好后，立即取100ml (100ml相當(dāng)19個(gè)實(shí)驗(yàn))放入清潔、干燥、 帶螺旋帽的125ml深棕色的硼硅酸鹽玻璃瓶中，使用前保存于-20C。配制和保 存的酶試劑在這種條件下可穩(wěn)定大約6個(gè)月，分析當(dāng)天，從冰箱取出酶試劑放 25C水浴大約1小時(shí)或平衡至25C1C。d酶試劑驗(yàn)證試驗(yàn)(1)酶試劑穩(wěn)定性：取100mg/dl(5mmol/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)6ml，稀釋成相當(dāng)于 600mg/dl(33mmol/L)標(biāo)準(zhǔn)的上清液，與15ml試劑水混合，用1ml這個(gè)稀釋液混 合5ml酶試劑，立即轉(zhuǎn)移到分光光度計(jì)的比色杯中，第二個(gè)比色杯不放試劑水(以 試劑水為空白)，在340nm紀(jì)錄30分鐘溶液吸光度

30、變化。如果酶試劑與葡萄糖稀 釋液混合后的溶液在6分鐘吸光度讀數(shù)在1.6-1.8A，在8和30分鐘時(shí)吸光度值 0.010A，表明酶試劑質(zhì)量沒(méi)有問(wèn)題。酶污染檢驗(yàn)：加100mg果糖和50mgG-1-P到50ml容量瓶中，用安息香酸稀釋到50ml，充分混 勻，這是碳水化合物溶液。在一個(gè)錐形瓶上標(biāo)明“碳水化合物-葡萄糖”，加1ml 碳水化合物溶液和1ml200mg/dl(11.10mmol/L)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)，混合后加40ml試劑 水，再混勻，在標(biāo)有“空白”和“試驗(yàn)”的2個(gè)試管中各加入5山1酶試劑，空白 管加1.0ml安息香酸稀釋液，試驗(yàn)管加1.0ml碳水化合物-葡萄糖溶液，充分混 勻各管，不要?jiǎng)×艺鹗?，?/p>

31、即轉(zhuǎn)移到經(jīng)過(guò)光徑標(biāo)準(zhǔn)的分光光度計(jì)的反應(yīng)杯中，在 340nm波長(zhǎng)以試劑水為空白測(cè)定并記錄各管吸光度。以碳水化合物溶液加入酶試 劑的杯為零點(diǎn)。如果(a)試驗(yàn)管在6和30分鐘時(shí)吸光度的差值0.010A(b)空 白管在6和30分鐘時(shí)吸光度的差值0.005A(c)30分鐘吸光度的差值 0.08A(d)30分鐘時(shí)試驗(yàn)吸光度的茶汁再用相同方法或規(guī)定試驗(yàn)程序檢測(cè)是 100mg/dl葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)吸光度-0標(biāo)準(zhǔn)吸光度的差值的4%以內(nèi)時(shí)，酶試劑證明是有 效的，如果一臺(tái)分光光度計(jì)檢測(cè)和記錄一種溶液一試劑水的性能是可以接受的， 首先進(jìn)行試驗(yàn)杯的測(cè)定，緊接著測(cè)定“空白杯”，假如一臺(tái)分光光度計(jì)檢測(cè)和記 錄三種溶液一試劑水的性能是可接受的，實(shí)驗(yàn)(1)和(2)可以同時(shí)進(jìn)行，假如 有多個(gè)反應(yīng)杯，監(jiān)視和測(cè)定同時(shí)進(jìn)行，在進(jìn)行大量試驗(yàn)前先確定吸光度在 0.100 + 0.01A時(shí)，平均被校正地讀數(shù)不超過(guò)這批平均吸