葡萄糖參考方法

1、測定葡萄糖的推薦參考方法樣本處理、保存和儲藏a：在處理任何葡萄糖溶液中最基本的預防措施是防止糖分解。這種方法設(shè)計用 于無細胞的樣本。為了更好地保持葡萄糖的最初濃度必須避免微生物和細菌污 染，這是樣本分解的主要來源，少量樣本的蒸發(fā)也可能產(chǎn)生嚴重問題，由于化學 污染能在很短時間內(nèi)產(chǎn)生，因此，在處理和保存樣本時嚴格要求樣本瓶清潔、無 菌、密閉。b:葡萄糖標準溶解稀釋在1g/L安息香酸溶液中，可抗微生物污染，它在4P可長 期保存在室溫下可穩(wěn)定數(shù)周。葡萄糖標準的水稀釋液或其他稀釋液和復溶凍十品 對糖分解非常不穩(wěn)定，須經(jīng)過無菌或加入防腐劑處理。c：用于這個分析的樣本所使用的生物樣品嚴格限定為血清和血漿，兩

2、種標本在 制備與保存中要求特殊的防腐抗細菌學糖酵解以及細胞學傷害。凍干血清產(chǎn)品不 一定分離這些污染物，通常比新鮮收集的陰性血清糖酵解速度快。血液在無菌條 件下收集，即使使用了防腐劑，過期控制與校準品樣品也必須進行過濾以除掉組 織細胞和微生物，由于細胞糖酵解的完全抑制劑有限，許多這樣物質(zhì)存在干擾問 題，因此血漿與血清必須離心確保產(chǎn)生與細胞分離的血清。血清可以保存到任何 時間。在含有抗凝劑或收集的血清中加入足量防腐劑。肝素、草酸鹽、檸檬酸和 EDTA不干擾這項分析。NaF是安全防腐劑，但是作為高濃度的專用抗凝劑不可 避免的產(chǎn)生血漿不穩(wěn)定并干擾這項分析。肝素以外的抗凝劑導致血樣本中細胞內(nèi) 水和其他物

3、質(zhì)的滲透壓的改變，最終導致血漿葡萄糖濃度的改變。d.血中NaF在2.0mg/ml濃度是推薦防腐濃度。NaF最好與1mg/mlEDTA-Na2鹽 聯(lián)合使用，這個混合物在常規(guī)真空采血管中是可能的(加到收集的血清或血漿中， 1mg/ml NaF濃度足夠)。e：收集的新鮮樣本必須立即混勻，輕輕地溶解十的抗凝劑，防止冷凍血漿中Fb 的后期問題.f樣本長期儲藏的關(guān)鍵是無菌、密閉、低溫和遠離細胞或化學污染物。超過48h 的保存，即使已經(jīng)經(jīng)防腐處理，樣本也應在容器中冷凍，確保密閉和防止水蒸氣 滲入；選擇深色小玻璃瓶。通過特定的合適的螺旋帽可獲得一個很好的密封，在 小于30C的水容箱中冰凍樣本迅速融化。在同一瓶

4、反復溶解，樣本反復取樣， 增加樣本潛在分解、蒸發(fā)和污染的危險。要求和材料說明a:量值測量天平精密度天平準確度樣本轉(zhuǎn)移(量取)b:分光光度計測量比色杯系統(tǒng)固定位置單一杯子單一 1.0cm比色杯340nm分光光度計特性光譜溶液、波長和雜散光：340nm時半波寬8nm。重復測定340nm處 波長精密度和準確度在土2nm之間，340nm處雜散光0.1%，這些影響因素的總和 被消除時不降低儀器對超濃度NADH的溶液的線性反應性，NADH溶液吸光度的實 驗在340nm時，吸光度在正常設(shè)定狹縫寬度時為1.010%范圍內(nèi)。適當?shù)目瞻?溶液時在儀器半波寬2倍外時不改變超過0.5%。（b）穩(wěn)定性：低于噪音，每小時

5、吸光度漂移0.001Abs，在要求的狹縫和能 量水平時，在1.0 Abs時，每小時吸光度漂移0.003 Abs。（c）分光光度計不精密度，包括噪聲。對0.000-1.500 Abs范圍甚至更寬 時，重復讀數(shù)時的變異率（1SD）0.0005 Abs或任意吸光度讀數(shù)的0.25%。（d）分光光度計線性：在0.100-1.000 Abs之間的任何水平，測定吸光度 的線性斜率是最好的，通過調(diào)零后，應0.001 Abs或小于吸光度的0.5%。在葡萄糖分析或NADH的精確稀釋量的吸光度測量的定標反應曲線的測量 中，（分光光度計元件導致的）相應濃度吸光度的變化率的測量誤差，與 0.2-1.000 Abs之間的

6、測定的變異率0.5%沒有明顯不同，0.2 Abs時，相應影 響在均值變化率+0.001 Abs c：玻璃制品（1）所有玻璃制品必須化學清潔，清潔程序包括至少用（）沖洗2遍，蒸餾 水和在清潔環(huán)境中干燥。（2）（3）d：化學說明書：（1）試劑水：（2）無CO水：試劑水在敞開的長頸燒瓶中煮沸15分鐘，用透明的玻璃瓶蓋 或用堿石灰帽蓋住冷卻，直到使用前。（3）葡萄糖標準：用國家標物局有證D-葡萄糖標準品：SRM917配制，葡萄糖 標準液的原有尖頂瓶儲存于實驗室的充滿無水硫酸鈣的真空干燥容器中。（4）化學試劑（a）硫酸鋅，7個結(jié)品水，ACS說明書（b）Ba（OH） 2,8H2O, ACS 說明書（c）醋

7、酸Mg,4 H2O, ACS說明書（d）Tris base ， reagent grade（e）Tris -HCL reagent grade（f） B-NAD+（氧化型），2 H2O,純度98%，常規(guī)稱重。（g）ATP-Na2.3 H2O,純度98%，常規(guī)稱重。（h）牛血清AlB，第五部分，純度96-99%。（i） 葡萄糖-1-磷酸，二鈉鹽，4 HO，純度98%2（j）D-果糖，NAS/NRC說明書（k）安息香酸：見ACS說明書（5）酶說明：（a） HK（ATP:6-磷酸D-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；EC 2.7.1.1）,酶來源于酵母，要求 高純度，4.d中給出恰當?shù)拿笝z驗數(shù)據(jù)，注意4.d（2）.（b

8、）G6PDH（6-磷酸-D-葡萄糖：NAD（P）氧化還原酶；EC 1.1.1.49），酶來 源于腸膜明串珠菌，可以懸浮于硫酸胺液或為凍干粉，要求高純度，4.d 中給出恰當?shù)尿炞C數(shù)據(jù)，注意4.d（2）.血清或血漿中葡萄糖測定程序：a:原液標準液的配制：（1）安息香酸稀釋液（1g/l）：在大容量瓶中用2000ml熱的試劑水溶解 2.0gACS級安息香酸，徹底混勻，蓋蓋冷卻全室溫。全部液體倒進試 劑瓶，密閉保存于室溫。（2）葡萄糖標準貯存液（10g/l）：稱取5.0000.002gNBS無水D-葡萄糖， 放入500ml class A級容量瓶中，用安息香酸稀釋液沖洗和稀釋葡 萄糖全容量瓶的2/3瓶處

9、，旋轉(zhuǎn)使葡萄糖完全溶解，加安息香酸溶 液至500ml標記線下1cm處，把容量瓶放20C1C水槽中，水沒全 瓶頸處，密閉，用安息香酸稀釋液補足前平衡溶液30分鐘。塞緊顛 倒混勻至少10次，每一次顛倒、旋轉(zhuǎn)倒置容量瓶10秒。每125ml 一份，放入帶有螺旋蓋的硼硅酸鹽的瓶中，蓋緊并標記，還要注明 日期。保存在4C或-20C。一瓶用于制備1整套系列標準液。如果 處理得當，準備充分，這種標準原液可以長期穩(wěn)定，但還是建議每6 個月重新配制。在一個新批號開始使用之前，從新標準原液配一個 新的mg/dl（11.10ml/l）工作標準，與舊的系列標準在一批測試各雙 份比較它們的變異。（3）葡萄糖工作標準液（a

10、）配制一套純品葡萄糖的系列工作標準液：葡萄糖標準原液和安息香酸稀 釋液在20C+1C的水浴箱中平衡30分鐘，按下表轉(zhuǎn)移等份的葡萄糖原 液至100ml classA容量瓶中，用安息香酸稀釋液稀釋至接近刻度，在 水浴箱中平衡15分鐘后調(diào)至刻度線。為配制標準需準備一特殊系列的 CLASS A級100ml容量瓶和5、10、20ml加樣器。貯存標準（ml）用安息香酸稀釋液稀釋 的最終體積（ml）最終葡萄糖濃度Mg/dlmmol/L5.00100502.7810.001001005.5520.0010020011.1030.0010030016.6540.0010040022.20安息香酸稀釋液中一部分是

11、用于配制試劑空白的，它用作“0”濃度標準液。 一次配制一套完整系列標準液，如果任何一個濃度減少或有懷疑，整批都將被替 換。舊的和新的系列標準通過一個分析批雙份分析測試進行比較。工作標準液貯存于4-ounce聚乙烯螺旋帽瓶中，放4。不超過1個月。塑料存貯瓶的清洗很關(guān)鍵，交叉污染不被發(fā)現(xiàn)，對測定的影響會從一種 溶液倒另一種溶液。盡管安息香酸是一種很好的抗常規(guī)糖酵解微生物的 防腐劑，它不能防御嚴重的細菌污染。在每一分析日中，要求平衡至25r的工作標準重新分到干凈管中，原液 瓶重新放回冰箱。b試劑配制沉淀蛋白試劑ZnSO4溶液(22g/l)：用剛配好的熱的無CO蒸餾水大約900ml溶解22g ZnSO

12、47 H2O，溶液冷卻全室溫后，移到1L容量瓶中，用無CO2水稀釋至1000ml充 分混勻，移至玻璃瓶，密閉保存。2飽和Ba(OH)2溶液，用剛配好的熱的無CO2蒸餾水約950ml溶解剛開瓶稱取的 80g Ba(OH)8H2O，溶液冷至室溫，移到、L容量瓶中，用無CO2蒸餾水稀釋 至1000ml，2充分混勻，轉(zhuǎn)移到存儲瓶中，存儲瓶用短圓柱形指示型SIO2凝 膠(硅膠)保護堿石灰咀，咀的壽命相當短，堿石灰必須經(jīng)常更換。允許超 量的Ba(OH)2和不溶解的碳酸鹽沉淀過夜或幾天，必要時，稀釋前清除它。Ba(OH)溶液，0.11N。如果不干擾沉淀，轉(zhuǎn)移245ml飽和Ba(OH)到1L 容量瓶；用無CO

13、蒸餾水稀釋至1000ml，用這個稀釋的Ba(OH)溶液滴 定10ml硫酸鋅裕2液用酚酞做指示劑(0.5%指示劑溶解于95%乙醇中，2 滴)滴至淡粉色為終點，結(jié)果應為10ml ZnSO溶液需要100.1ml Ba(OH) 溶液滴定。若超過這個范圍，在Ba(OH)溶液中根據(jù)大致計算量加入適 量Ba(OH)或無CO2水，重新滴定。轉(zhuǎn)移校正好的Ba(OH)溶液至使用堿 石灰咀和蘇打水瓶或細水瓶管試劑瓶中，每個月用滴定法檢查該溶液當 量濃度。25r 時，PH7.5 的 0.1m Tris buffer,含 5.0mmol/l 乙酸鎂(a) TRIS-HCL原液，在2.0L的容量瓶中用試劑水溶解31.52

14、g TRIS-HCL并 稀釋到2000ml。Tris base原液：在500ml容量瓶中用試劑水溶解6.06 g Tris base并 稀釋至500ml。配制酶試劑時需新鮮配制這個原液。PH7.5 Tris -Mg buffer，在一個大燒杯里，混合 800ml Tris -HCL 液和 200ml的Tris base溶液，然后在溶液里溶解1.1g醋酸鎂。在25C測定 混合液的PH,必要時，用Tris-HCL液或Tris base溶液調(diào)至PH7.50.1。 用0.45 “m濾菌膜過濾溶液，到一個無菌帶螺旋帽的硼硅酸鹽玻璃貯存瓶 中，配酶試劑時要新鮮配制，貯存于4C冰箱。C :酶試劑的準備與分析

15、(1)酶試劑成分的本質(zhì)分析(a)試劑Tris -白蛋白：在250ml容量瓶中用Tris -Mg buffer溶解0.5g牛血清 白蛋白，校正至250ml。儲存在大約4C冰箱。NAD+原液：在Tris -Mg緩沖液中溶解0.9952g氧化型NAD+，補足至250ml， 在4C冰箱保存，配制當天測定。ATP原液：在Tris -Mg buffer中溶解0.8268g ATP二鈉鹽，并補足全 250ml，保存于4C冰箱，配制當天測定。葡萄糖，用0.1%安息香酸稀釋60ml葡萄糖標準原液至100ml，保存在4C 冰箱。己糖激酶原液：在25 C稱量或用Darrow和Colowick的方法或使用6-磷 酸葡

16、萄糖脫H酶的方法測定酶含量獲得總活性1250U的己糖激酶，轉(zhuǎn)移至250ml 酶的容量瓶，用Tris -Mg buffer調(diào)至刻度，放在4C冰箱保存，配制當天分 析。6-磷酸葡萄糖脫H酶原液：在25 C稱量或用olive和Levy的方法或用己 糖激酶分析的一組相似的方法獲得總活性1250U的6-磷酸葡萄糖脫H酶。用Tris -Mg buffer溶解至250ml，保存于4C冰箱，配制當天測定。注意：己糖激酶或脫H酶的活性可從廠家說明書提供的分析資料獲得，這些信息 包括U/瓶(凍干或懸浮)，U/ml (懸浮)，U/mg (凍十)或U/mg蛋白和U/ml (懸 浮)，懸浮的液體最好通過稱重法測定體積量

17、或直接稱量1250U的酶，精確測量 1250U不是絕對必要的，但應盡可能測準。假如不能評估酶濃度，僅配制基本的 10ml酶原液并分析它。(b)己糖激酶分析(i )將上述試劑i -vi和0.1MTris - Mg緩沖液放在25C0.2C的水浴箱中，放 20分鐘，使液體達到預定溫度(原液放冰箱保存，除非需移液時)。己糖激酶實驗試劑：在一個帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的NAD+原液， ATP原液、葡萄糖、脫氫酶原液和Tris -Mg緩沖液，10ml可滿足最初的和重 復三次分析量。己糖激酶稀釋液:取1ml己糖激酶原液用0.2%Tris - ALB液稀釋至100ml。分析：將己糖激酶實驗試劑、5ml己糖

18、激酶稀釋液和含有5ml 0.2%Tris -ALB液的密閉的試管放在25C0.2t的水浴箱中大約10分鐘使液體達到預定 溫度?？瞻诇y定Tris-ALB (ml)1.0HK稀釋液(ml)1.0HK實驗試劑(ml)5.05.0混勻，立即轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25C0.2C樣本的分光光度計的2個檢測 反應杯中，在340nm連續(xù)測定5分鐘內(nèi)空白和試驗管的吸光度，對5分鐘內(nèi)任意 1分鐘吸光度變化應基本一致，在0.005A/分以內(nèi)，對這個分析而言NAD+的下降 表示分析偏差。己糖激酶原液催化活性的計算。HK 原液活性量= (dA/dt)/(EXb) XVr/Vs=dA/dt X (1/6.23 X 103

19、 l.cm/mol.cm) X Vr/Vs=dA/dt X (0.0001605mol/l) X (10ep mol/mol) X (1/ 103ml ) X (6/Vs)= Atest(3 分)*.2 分) X ( 0.963|J mol/mol )X (1/Vs)=p mol/min.ml=U/ml(25CHK 原液)dA=吸光度變化率(本次分析用3分鐘和2分鐘讀數(shù)的變化)dt=測定時間變化E=摩爾吸光度(本次分析條件下，值為6.23X103l/mol.cm)b=光徑(用厘米表示)仁用毫升表示的總的反應體積（上面給出的程序，體積為6ml： 5ml HK試驗試 劑+1ml稀釋HK）Vs=用m

20、l表示的總反應量中的酶原液量（上面給出的程序：1ml被稀釋HK加到 反應混合液中（包含0.01ml酶原液），因此Vs是0.01ml。（vi）例如：配制一個HK原液：用廠家報告的含有1395U/ml的商業(yè)的懸浮于硫 酸銨溶液的HKlml,用Darrow和Colowick的方法在30C測定，用Tris - Mg buffer稀釋至250ml。HK分析中使用1mlHK原液，3分鐘時吸光度是0.203，在 2分鐘時，吸光度是0.166HK U/原液的 ml 數(shù)=（0.203-0.166） /minX 0.963 mol/ml X 1/0.01=3.56U/ml（在 25C）（c）6-磷酸葡萄糖脫氫酶分

21、析（i）將（a）中 i-vi試劑和 0.1MTris -Mg buffer 放在 25C0.2C的水浴 箱中，放20分鐘，使液體達到預定溫度（原液放冰箱保存，除非需移液時）。（ii）6-磷酸葡萄糖脫氫酶試驗試劑：在一個帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的 NAD+原液，ATP原液、葡萄糖、HK原液和Tris -Mg緩沖液，10ml可滿足最初 的和重復三次分析量。（iii）6-磷酸葡萄糖脫氫酶稀釋液：取1ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液用0.2%Tris -ALB液稀釋至100ml。（iv）分析：將6-磷酸葡萄糖脫氫酶實驗試劑、5ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶稀釋 液和含有5ml 0.2%Tris -ALB

22、液的密閉的試管放在25C0.2C的水浴箱中大 約10分鐘使液體達到預定溫度?？瞻诇y定Tris-ALB(ml)1.0G6PDH稀釋液（ml）1.0G6PDH實驗試劑（ml）5.05.0混勻，立即轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25C0.2C樣本的分光光度計的2個檢測 反應杯中，在340nm連續(xù)測定5分鐘內(nèi)空白和試驗管的吸光度，對5分鐘內(nèi)任意 1分鐘吸光度變化應基本一致，在0.005A/分以內(nèi)，對這個分析而言NAD+的下降 表示分析偏差。（V）6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液活性的計算 6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液活性二*知(3分)-Atest (2分) X ( 0.963仇mol/mol)X (1/Vs)test t

23、est=U/ml（25C6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液）Vs=在總反應量中，酶原液的量（用ml表示）（上面給出的程序中，被加到反應 混合液中的1ml稀釋的6-磷酸葡萄糖脫氫酶包含 0.01ml酶原液，因此 Vs=0.01ml）。其他因素的解釋見（b） （v）。（d）NAD+分析（i）將（a）中足量的 ii-vi 試劑和 0.1MTris -Mg buffer 放在 25C1C 的 水浴箱中，放20分鐘，使液體達到預定溫度（原液放冰箱保存，除非需移液時）。（n） NAD+試驗試劑：在一個帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的ATP原液、葡萄 糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液和Tris -Mg緩沖液，10

24、ml足夠。（iii）稀釋NAD+：取5ml NAD+原液，用Tris -Mg緩沖液稀釋到100ml。（iv）分析：將NAD+實驗試劑、5ml稀釋NAD+和含有5ml Tris -Mg緩沖液的密 閉的試管放在25C1C的水浴箱中大約10分鐘使液體達到預定溫度?？瞻诇y定Tris-Mg 緩沖液(ml)1.0NAD+稀釋液（ml）1.0NAD+實驗試劑（ml）5.05.0混勻，立即轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25C1C樣本的分光光度計的2個檢測反 應杯中，加入NAD+實驗試劑10分鐘后，在340nm測定空白和試驗管的吸光度。 反應在10分鐘內(nèi)達到平衡。（v）NAD+原液中NAD+濃度的計算：C=A/ (EX

25、b)XVr/Vs=A (10 分)/ (6.23 X 103 l.cm/mol.cm) X (6ml/0.05ml)=* t(10 分)X0.01926mmol/ml=mmol/ ml(NAD+原液)C=濃度( mmol/ml)A=吸光度E=摩爾吸光系數(shù)(對于本試驗：值是6.23X 103l/mol.cm)b=用cm表示的光徑Vr=用ml表示的總反應體積Vs=在總反應體積中NAD+原液體積(用ml表示)本試驗中NAD+原液濃度至少應在0.005mmol/ml之上，否則該來源NAD+不 能用于測定葡萄糖。ATP 分析：將(a)中足量的 ii-vi 試劑和 0.1MTris -Mg buffer

26、放在 25C1C 的 水浴箱中，放20分鐘，使液體達到預定溫度(原液放冰箱保存，除非需移液時)。(n) ATP試驗試劑：在一個帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的NAD+原液、葡萄 糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液和Tris -Mg緩沖液，10ml足夠。稀釋ATP：取5mlATP原液，用Tris - Mg緩沖液稀釋到100ml。分析：將ATP實驗試劑、5ml稀釋ATP和含有5ml Tris - Mg緩沖液的密 閉的試管放在25C1C的水浴箱中大約10分鐘使液體達到預定溫度?？瞻诇y定Tris-Mg 緩沖液(ml)1.0ATP稀釋液(ml)1.0ATP實驗試劑(ml)5.05.0混勻，立即轉(zhuǎn)移到已

27、含有溫度控制在25C1C樣本的分光光度計的2個檢測反 應杯中，加入ATP實驗試劑10分鐘后，在340nm測定空白和試驗管的吸光度。 反應在10分鐘內(nèi)達到平衡。ATP原液中ATP濃度的計算C= * t(10 分)X0.01926mmol/ml=mmol/ml(ATP 原液)各因素來源解釋見(d) (v)如果ATP原液濃度0.005mmol/l，則該ATP來源不適用于葡萄糖測定。酶試劑準備(a)如果ATP、NAD+、HK和6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液按上述方法檢測合格， 酶試劑按下列方法配制：(i)在1L容量瓶中加200mlATP原液。()加 200ml NAD+原液()加入相當于總活性800U的6-

28、磷酸葡萄糖脫氫酶原液，例如：6-磷酸葡萄 糖脫氫酶原液4U/ml，則需在這個容量瓶中加入200ml，如果原液2.7 U/ml， 則應加入300ml。對于配制200ml的酶原始儲存溶液而言，加入純酶量相當于起 始試劑量的4/5體積合適，這個新要求的原液量是計算起始量的一半。加入相等于總活性800U的HK原液到1L容量瓶中，例如：原液活性4U/ml， 則需在這個容量瓶中加入 200ml，如果酶原液含量2.7U/ml，則應加入酶 量300ml，應配制更高濃度的酶原液。對于200ml的起始的酶溶液而言，加入純 酶量相當于起始試劑的4/5體積合適。用Tris - Mg緩沖液稀釋到1L，輕輕顛倒混勻，不要

29、用力振蕩。酶試劑配好后，立即取100ml (100ml相當19個實驗)放入清潔、干燥、 帶螺旋帽的125ml深棕色的硼硅酸鹽玻璃瓶中，使用前保存于-20C。配制和保 存的酶試劑在這種條件下可穩(wěn)定大約6個月，分析當天，從冰箱取出酶試劑放 25C水浴大約1小時或平衡至25C1C。d酶試劑驗證試驗(1)酶試劑穩(wěn)定性：取100mg/dl(5mmol/L的葡萄糖標準6ml，稀釋成相當于 600mg/dl(33mmol/L)標準的上清液，與15ml試劑水混合，用1ml這個稀釋液混 合5ml酶試劑，立即轉(zhuǎn)移到分光光度計的比色杯中，第二個比色杯不放試劑水(以 試劑水為空白)，在340nm紀錄30分鐘溶液吸光度

30、變化。如果酶試劑與葡萄糖稀 釋液混合后的溶液在6分鐘吸光度讀數(shù)在1.6-1.8A，在8和30分鐘時吸光度值 0.010A，表明酶試劑質(zhì)量沒有問題。酶污染檢驗：加100mg果糖和50mgG-1-P到50ml容量瓶中，用安息香酸稀釋到50ml，充分混 勻，這是碳水化合物溶液。在一個錐形瓶上標明“碳水化合物-葡萄糖”，加1ml 碳水化合物溶液和1ml200mg/dl(11.10mmol/L)葡萄糖標準，混合后加40ml試劑 水，再混勻，在標有“空白”和“試驗”的2個試管中各加入5山1酶試劑，空白 管加1.0ml安息香酸稀釋液，試驗管加1.0ml碳水化合物-葡萄糖溶液，充分混 勻各管，不要劇烈震蕩，立

31、即轉(zhuǎn)移到經(jīng)過光徑標準的分光光度計的反應杯中，在 340nm波長以試劑水為空白測定并記錄各管吸光度。以碳水化合物溶液加入酶試 劑的杯為零點。如果(a)試驗管在6和30分鐘時吸光度的差值0.010A(b)空 白管在6和30分鐘時吸光度的差值0.005A(c)30分鐘吸光度的差值 0.08A(d)30分鐘時試驗吸光度的茶汁再用相同方法或規(guī)定試驗程序檢測是 100mg/dl葡萄糖標準吸光度-0標準吸光度的差值的4%以內(nèi)時，酶試劑證明是有 效的，如果一臺分光光度計檢測和記錄一種溶液一試劑水的性能是可以接受的， 首先進行試驗杯的測定，緊接著測定“空白杯”，假如一臺分光光度計檢測和記 錄三種溶液一試劑水的性能是可接受的，實驗(1)和(2)可以同時進行，假如 有多個反應杯，監(jiān)視和測定同時進行，在進行大量試驗前先確定吸光度在 0.100 + 0.01A時，平均被校正地讀數(shù)不超過這批平均吸