綠色螢光蛋白

1、綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)，簡稱GFP,這種蛋白質(zhì)最早在一種學(xué)名Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)， 在藍色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光。這個發(fā)光的過程中還需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，且這個冷光蛋白質(zhì)與鈣離子(Ca+2) 可產(chǎn)生交互作用。由水母Aequorea victoria中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色螢光蛋白，395nm和475nm分別是最大和次大的激發(fā)波長，它的發(fā)射波長的峰點是在 509nm，在可見光綠光的范圍下是較弱的位置。由海腎(sea pansy)所得的綠色螢光蛋白，僅有在498nm有一個較高的激發(fā)峰

2、點。在細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色螢光蛋白基因常被用作為一個報導(dǎo)基因(reporter gene)。一些經(jīng)修飾過的型式可作為生物探針， 綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物(例如:兔子上進行表現(xiàn)，并拿來映證某種假設(shè)的實驗方法。我們這邊細胞組的基本上都在用這個東東。標(biāo)記細胞GFP的分子結(jié)構(gòu)和發(fā)光機制綠色熒光蛋白為一個由238個氨基酸殘基組成的單鏈，GFP有兩個吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，其熒光發(fā)射峰在509nm。GFP 的化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，其變性需要在90C或pH12的條件下用6mollL鹽酸胍處理，這一性質(zhì)與GFP的結(jié)構(gòu)特性相關(guān)。Yang等的研究表明，GFP是由兩個相當(dāng)規(guī)

3、則的內(nèi)含一個a -螺旋和外面包圍l1個月-折疊的月-桶狀結(jié)構(gòu)組成的二聚體，P -桶狀結(jié)構(gòu)直徑約 3nm，高約4nm。p折疊彼此緊密結(jié)合，象桶板一樣形成桶狀結(jié)構(gòu)的外圍，并且形成了一個規(guī)則的氫鍵帶。桶狀結(jié)構(gòu)和位于其末端的短a 螺旋以及環(huán)狀結(jié)構(gòu)一起組成一個單獨的致密結(jié)構(gòu)域，沒有可供擴散的配體進入縫隙。這種堅實的結(jié)構(gòu)保證了其穩(wěn)定和抗熱、抗變性的特點。GFP的生色基團附著于a -螺旋上，幾乎完美的包被于桶狀結(jié)構(gòu)中心。位于圓桶中央的a -螺旋含有一個由六肽組成的發(fā)光中心，而發(fā)光團 是由其中的三肽Ser65-Tyr66-Gly67經(jīng)過環(huán)化形成了對羥基苯咪唑啉酮。GFP的生色基團是蛋白質(zhì)自身催化環(huán)化的結(jié)果，環(huán)

4、化是一個有氧 過程，在嚴(yán)格厭氧條件下GFP不能形成熒光，因為GFP的生色團形成需要O2使Tyr66脫氫氧化。生色基團通過Tyr66的脫質(zhì)子(酚鹽)和 質(zhì)子化狀態(tài)(羥酚基)的轉(zhuǎn)換決定熒光發(fā)射，此模型為Yang等的晶體學(xué)證據(jù)所支持。GFP在生物技術(shù)中的應(yīng)用研究分子標(biāo)記作為一種新型的報告基因，GFP已在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用綠色熒光蛋白獨特的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(protein tagging)，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標(biāo)記的蛋 白質(zhì)進行細胞內(nèi)活體觀察。由于GFP相對較小，只有238個氨基酸，

5、將其與其他蛋白融合后不影響自身的發(fā)光功能，利用GFP的這一特 性已經(jīng)加深了我們對細胞內(nèi)一些過程的了解，如細胞分裂、染色體復(fù)制和分裂，發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。1996年，Ehrdardt等人首次報道了利 用GFP的特性研究細胞分化蛋白FtsZ的定位。研究顯示FtsZ在細胞分裂位點形成了一個環(huán)狀物，且至少有9種蛋白在細胞分裂中起重要 作用，盡管對這些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已經(jīng)搞清楚了它們聚合的順序以及在蛋白定位中的一些特征。利用 GFP來檢測目標(biāo)蛋白的定位已為我們提供了一種對細胞內(nèi)的一些基本的生理過程進行更詳盡觀察的新方法。除用于特定蛋白的標(biāo)記定位外，GFP亦大量用于各種細胞器的

6、標(biāo)記如細胞骨架、質(zhì)膜、細胞核等等。Shi等人曾報道將GFP融合到大腸桿 菌細胞膜表面用作標(biāo)記蛋白，這一技術(shù)將有助于提高多肽庫的篩選效率、疫苗的研制、構(gòu)建細胞生物傳感器用作環(huán)境檢測以及探測信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)過程等等。這些都為傳統(tǒng)生物學(xué)研究提供了新思路和新方法，成為交叉學(xué)科研究的熱點。藥物篩選許多新發(fā)展的光學(xué)分析方法已經(jīng)開始利用活體細胞來進行藥物篩選，這一技術(shù)能從數(shù)量眾多的化合物中快速篩選出我們所感興趣的藥物。 基于細胞的熒光分析可分為三類：即根據(jù)熒光的密度變化、能量轉(zhuǎn)移或熒光探針的分布來研究目標(biāo)蛋白如受體、離子通道或酶的狀態(tài)的變 化。熒光探針分布是利用信號傳導(dǎo)中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子

7、相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子 的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細胞內(nèi)可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針。在細胞體內(nèi)分子之間的相互作用非常復(fù)雜，其中很多涉及到信號分子在細胞器之間的遷移。例如當(dāng)信號分子和某一特殊受體結(jié)合后常會導(dǎo) 致配體-受體復(fù)合物從某一細胞區(qū)域遷移到另一區(qū)域，而這一遷移過程通常會介導(dǎo)一重要的生理功能。因而，這些受體常常被用作藥物篩選 的目標(biāo)，若某一藥物具有與信號分子類似的功能，那么該藥物即具有潛在的醫(yī)藥價值。利用GFP熒光探針，將很容易從數(shù)量眾多的化合物 中判斷出那些化合物具有與信號分子相似的能引起配體一受體復(fù)合物遷移并介導(dǎo)

8、生理反應(yīng)的功能，且這一篩選過程簡單方便，所需成本也 很低。利用這一原理，已經(jīng)成功構(gòu)建了一個篩選模型用于研究藥物介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體(hGR)的遷移過程。在一 96孔板中培養(yǎng)細胞，并 以一編碼hGR GFP蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細胞。當(dāng)細胞用待篩選的藥物處理后，hGR-GFP從細胞質(zhì)遷移人細胞核的過程可實時或在某一時段 內(nèi)被證實，根據(jù)熒光分布即可推斷哪一種藥物具有與hGR配體相類似的功能。利用GFP來進行藥物篩選由于受其必須與遷移的信號分子 相偶聯(lián)，其篩選容量相對較低，但是由于GFP在細胞內(nèi)的穿透性強及獨特的發(fā)光機制，因而在藥物篩選中具有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。.融合抗體近二十年來，抗體生成技術(shù)有了飛速發(fā)展

9、，已經(jīng)從細胞工程抗體(雜交瘤技術(shù)一單克隆抗體)發(fā)展到了第三代抗體：基因工程抗體，尤其是 噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)，解決了人源抗體的研制問題，促進了各種性能優(yōu)良抗體以及具有多種功能的抗體融合蛋白的開發(fā)。單鏈抗體 (Single-chain variable fragment，ScFv)是研究得較多的一種小分子抗體，其優(yōu)越陛在于可在宿主細胞內(nèi)大量表達，易于基因工程操作，尤其 易于構(gòu)建抗體融合蛋白。近年來，關(guān)于綠色熒光蛋白融合單鏈抗體的報道很多，國內(nèi)也有相關(guān)報道，如程虹等報道將抗肝癌單鏈雙功能抗 體融合GFP真核表達載體并導(dǎo)人小鼠成纖維細胞NIH3T3表達并獲得成功。因融合抗體具有與抗原結(jié)合及發(fā)射熒光

10、兩種特性，故這一人工 分子可用做免疫染色的檢測試劑，直接應(yīng)用于流式細胞儀和免疫熒光的標(biāo)記及腫瘤的檢測等等。由于技術(shù)上的的原因，一般融合抗體均置于原核表達系統(tǒng)如E.coli中表達。為便于表達蛋白的分離純化，一般在單鏈抗體的N端或C端插 入一 6XHis序列，便于用Ni-NTA親和層析柱純化目標(biāo)蛋白。但這一技術(shù)也存在一些問題。由于抗體分子內(nèi)存在二硫鍵，而在原核表達系 統(tǒng)內(nèi)由于抗體不能正確折疊，容易形成包涵體，表達出來的目標(biāo)蛋白無活性，需要在氧化還原體系中進行復(fù)性。但近來也有報道在動物細 胞細胞質(zhì)中成功表達出具有抗原結(jié)合活性的單鏈抗體。若能成功解決融合抗體的表達問題，則在免疫染色及腫瘤檢測這一領(lǐng)域融

11、合抗體將 扮演極為重要的角色。.生物傳感器蛋白質(zhì)工程技術(shù)已經(jīng)開始采用將一具有信號傳導(dǎo)功能分子識別位點的分子結(jié)合到另一分子上來設(shè)計生物感受器。綠色熒光蛋白由于其獨特 的光信號傳導(dǎo)機制，以及在表達后易被周圍化學(xué)環(huán)境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適于用做活細胞體內(nèi)的光學(xué)感受器。第 一個基于GFP的生物感受器為Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki幾乎同時提出。這一感受器原理是利用鈣調(diào)蛋白結(jié)合鈣離子后引起 的空間構(gòu)象變化導(dǎo)致兩種GFP突變體間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。但是由于大多數(shù)蛋白不能像鈣調(diào)蛋白那樣承受較大的空間構(gòu)象變化，為克 服這一缺點，人們開始提出利用基因融合技術(shù)將一新的分子

12、識別位點結(jié)合到GFP上以構(gòu)建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根據(jù)這一原 理將TEM1 P -內(nèi)酰胺酶(Bla)融合到GFP上。當(dāng)缺少目標(biāo)分子時，GFP處于靜止?fàn)顟B(tài)不會產(chǎn)生熒光。但是當(dāng)目標(biāo)分子月-內(nèi)酰胺酶抑制蛋 白(BLIP)與Bla結(jié)合后，即使GFP活化產(chǎn)生熒光，而這一變化很容易被檢測到。將受體蛋白插入到GFP表面的技術(shù)已經(jīng)成為構(gòu)建分子感 受器的有力工具，這種GFP感受器能被用來檢測多種分子，如蛋白質(zhì)、核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應(yīng) 用前景極為廣闊。GFP在細胞方面的應(yīng)用生物發(fā)光Protein taggingGFP蛋白首先被應(yīng)用在觀察活體細胞中蛋白的位置及動

13、態(tài)的變化.使用GFP進行此類研究的好處是細胞在實驗之前不需要進行固定或破壞， 如此便能在幾乎不影響細胞的正常生理作用下進行即時的觀察及分析.主要可以應(yīng)用在Biological screen及Drug screen上.GFP蛋白除了能在細胞中標(biāo)定特定fusion protein的位置及存在，另外也能利用生物分子之間的特殊作用力標(biāo)定特定DNA序列的位置.例如有 研究就利用bacterial lac repressor protein(lac I)跟其DNA目標(biāo)之間的特殊強結(jié)合力來標(biāo)定lacI的目標(biāo)基因.GFP的barrel-like structure能確保GFP在fusion protein中的

14、結(jié)構(gòu)及其發(fā)光的性質(zhì)，使其適宜接在不同fusion protein中表現(xiàn).但利用GFP有期 限制性，因為要將GFP折疊成具有活性(會發(fā)光)的形狀可能會花較長的時間，這使得應(yīng)用GFP在短生命周期的蛋白研究中相形困難.Monitoring of gene expression將GFP當(dāng)作報告子基因在生醫(yī)研究上有很多的應(yīng)用,主要分成下列兩種：1、測知 transcriptase 或 reverse transcriptase 的存在在文獻報道，利用具有hTERT (human Tolemerase Reverse Transcriptase)作用之promoter及擁有在此promoter下游 GFP報告子基因的 adenovirus來感染細胞,進而利用螢光的發(fā)光位置來辨認(rèn)出腫瘤細胞的存在及其位移,發(fā)展的過程.2、Promoter強度之研究Promoter強度及其作用之研究對於有用到Molecular Cloni