固定化酶課件

1、一、什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第二章 固定化酶1二、固定化酶的特點優(yōu)點：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；可裝塔連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好。 缺點： -固定化過程中往往會引起酶的失活 -首次投入成本高 -大分子底物較困難2（一） 吸附法（二） 結(jié)合法（三） 交聯(lián)法（四） 包埋法三、固定化酶的方法3（一） 吸附法物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。 選擇載體的原則: - 要有巨大的比表面積 - 要有活潑的表面 - 便于裝柱進行連續(xù)反應(yīng) 物理吸附法: -靜止法 -電沉積法 -反應(yīng)器上直接吸附法 -混合浴或振蕩浴吸附法4優(yōu)點：固定化時酶分

2、子的構(gòu)象很少或基本不發(fā)生變化。缺點：結(jié)合力弱，易解吸附。載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸石及硅膠等。5（二）結(jié)合法1 離子鍵結(jié)合法2 共價鍵結(jié)合法61 離子鍵結(jié)合法酶分子含有離子交換基團的固相載體第一個離子結(jié)合法固定化酶：DEAE Cellulose固定化過氧化氫酶第一個工業(yè)化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基?；赋Ｓ幂d體:DEAE-纖維素， DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強度、溫度72 共價鍵結(jié)合法（1）概念（2）可以形成共價鍵的基團： 游離氨基， 游離羧基， 巰基， 咪唑基， 酚基， 羥基， 甲硫基， 吲哚基，二硫鍵（3）常用載體：天然高分子、人工合成的

3、高聚物、無機載體8共價鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”首先載體上引進活潑基團 然后活化該活潑基團 最后此活潑基團再與酶分子上某一基團形成共價鍵9（4）載體活化的方法A重氮法(需載體具有芳香族氨基)B疊氮法C烷基化反應(yīng)法D硅烷化法E溴化氰法10（三）交聯(lián)法交聯(lián)法:借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。常用試劑:戊二醛、異氰酸酯、N，N乙烯馬來亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。11雙功能試劑：常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第一篇報道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶戊二醛的兩個醛

4、基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff)。12圖 酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián) 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶。13交聯(lián)法有2種形式： 酶直接交聯(lián)法：在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強度、溫度和反應(yīng)時間之間的平衡。 酶輔助蛋白交聯(lián)：為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學修飾而引起酶失活，可使用第二個載體蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。14雙重固定法

5、：（1） 吸附交聯(lián)法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。15（2）交聯(lián)包埋法把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細的集合體，然后用高分子或多糖一類物質(zhì)進行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細的缺點，同時制得的固定化酶穩(wěn)定性好。16（四） 包埋法（entrapping method） 定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中使酶固定化的方法。分為：網(wǎng)格型和微囊型171網(wǎng)格型 將酶或含酶菌體包埋在凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶的方法。也稱為凝膠包埋法。182微囊型包埋法將酶包埋在各種高分子聚

6、合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。19各類固定化方法的特點比較: 比較項目吸附法結(jié)合法 交聯(lián)法包埋法物理吸附.共價鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合 制備難易易難易 較難較難固定化程度弱強中等 強強活力回收率較高低高 中等高載體再生可能不可能可能 不可能不可能費用低高低 中等低底物專一性不變可變不變 可變不變適用性酶源多較廣廣泛 較廣小分子底物、藥用酶20固定化后酶的考察項目：（1） 測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率。（2） 考察固定化酶穩(wěn)定性。（3） 考察固定化酶最適反應(yīng)條件。211. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具

7、有的酶活力單位。 或：單位面積（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標。 連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2）評價固定化酶的指標:223. 4. 或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分數(shù)。5.相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力。 23四、影響固定化酶性質(zhì)的因素1酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。2載體的影響（1） 分配效應(yīng)（2） 空間障礙效應(yīng)（3） 擴散限制效應(yīng)3. 固定化方法的影響24五、固定化后酶性質(zhì)的變化1 固定化對酶活性的影響：酶

8、活性下降，反應(yīng)速度下降原因：酶結(jié)構(gòu)的變化 空間位阻252 固定化對酶穩(wěn)定性的影響（1） 操作穩(wěn)定性提高。（2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。（3） 對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些 反而降低。（4） 對分解酶的穩(wěn)定性提高。（5） 對變性劑的耐受力升高。26固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：a. 固定化后酶分子與載體多點連接。b. 酶活力的釋放是緩慢的。c. 抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。273 pH的變化PH對酶活性的影響：（1） 改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團的解離（3）影響酶的結(jié)合基團的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié) 合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。28pH對固定化酶的影響1） 載體帶

9、負電荷，pH向堿性方向移動。 微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。292）載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。3）產(chǎn)物性質(zhì)對體系pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低。304最適溫度變化一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。5底物特異性變化作用于低分子底物的酶 特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特異性往往會變化。316米氏常數(shù)Km的變化Km值隨載體性質(zhì)變化（1） 載體與底物帶相同電荷，KmKm固定化酶降低了酶的親和力。（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，KmKm32六、固定化酶（細胞）的應(yīng)用1

10、. 固定化酶（細胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用2 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用3 固定化酶在分析化學中應(yīng)用4 固定化酶和親和色譜5 固定化酶與環(huán)境保護6 新能源開發(fā)中的應(yīng)用7 固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用331固定化酶（細胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶固定化酵母細胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類熱點：固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用342 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用例1固定化青霉素?；福灰淖僷H值等條件，就可以生成不同的產(chǎn)物。35青霉素酰化酶催化合成頭孢類抗生素 7-ACA as nucleus36青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素7-A

11、CCA or 7-ADCA as nucleus37例2：制造人工腎利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的體外循環(huán)裝置，大大提高了療效。383固定化酶在分析化學中應(yīng)用酶柱和酶管，可與分光光度計、熒光計或電量計結(jié)合，形成酶電極，進行某些物質(zhì)的自動分析。39酶電極40酶電極特點：快速、方便、靈敏、精確范圍：糖類、抗生素、氨基酸、甾體化合物、有機酸、脂粉、醇類、胺類以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等要求：酶必須有較強的專一性，并且要有一定的純度。414固定化酶和親和色譜親和技術(shù)的基礎(chǔ)：是生物活性化合物生物特異信息的綜合。利用了生命現(xiàn)象中生物分子間特有的高親和力、高專一性，可逆結(jié)合而設(shè)計的純化方法。是唯一能夠體現(xiàn)待分離物質(zhì)間生物學功能差異的分離方法。425 固定化酶與環(huán)境保護一、環(huán)境監(jiān)測二、污染物處理436新能源開發(fā)中的應(yīng)用H2是重要的能源物質(zhì)，雖然有許多微生物可以產(chǎn)生H2，但產(chǎn)氫系統(tǒng)不穩(wěn)定。有人利用固定化丁酸梭菌連續(xù)產(chǎn)氫，穩(wěn)定性比天然細胞好。 將植物的葉綠體中的鐵氧還原蛋白氧化酶系統(tǒng)用膠原膜包被，可用于水的光介產(chǎn)生氫氣和氧氣。447固定化酶在基礎(chǔ)理論研究