醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)：實(shí)驗(yàn)三 人類染色體標(biāo)本制備及核型分析

1、 人類染色體標(biāo)本制備及核型分析一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆杖旧w標(biāo)本制備的原理和實(shí)驗(yàn)過程理解染色體標(biāo)本制備的意義重點(diǎn)難點(diǎn) 染色體標(biāo)本制備的具體實(shí)驗(yàn)操作過程核型分析 染色體是細(xì)胞與分子聯(lián)系的重要橋梁，在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中被廣泛重視及應(yīng)用。尤其是染色體畸變有關(guān)的各類遺傳病的研究使臨床分析上了一個新的臺階。 染色體異常：數(shù)目異常 結(jié)構(gòu)異常人類染色體制備的應(yīng)用核型分析的前提：染色體顯帶、 非顯帶、 染色體脆性部位染色體畸變檢測：數(shù)目、結(jié)構(gòu)秋水仙素PHA二 實(shí)驗(yàn)原理外周血淋巴細(xì)胞大都處于G0或G1期，一般情況不分裂在有絲分裂原(如植物血凝素PHA)作用下，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞而開始進(jìn)行有絲分裂短期培養(yǎng)后，加秋水仙素作用

2、于細(xì)胞有絲分裂前期，抑制或破壞紡錘體、微管形成，將細(xì)胞阻滯于分裂中期對細(xì)胞再做低滲、固定、滴片和染色處理，制片后即獲得中期染色體標(biāo)本，用于顯微觀察低滲處理：使細(xì)胞核膜吸水膨脹，染色體分散，易于 觀察和統(tǒng)計(jì)，同時還能提高染色效果 （0.075mol/L氯化鉀溶液）固定處理：使染色體保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)、防止 染色體彌散、丟失 甲醇 對組織細(xì)胞具有脫水、固定、硬化作用 冰醋酸 穿透力強(qiáng)可加強(qiáng)固定效果（3:1）三 實(shí)驗(yàn)器材與實(shí)驗(yàn)分組每兩人一組10ml離心管 1支/小組細(xì)胞培養(yǎng)物 1瓶/2小組玻璃滴管 3支/小組低滲液、固定液 1瓶/2小組玻片 1張/人Giemsa染液 2瓶公用酒精燈 1個/小組廢液杯

3、 1個/小組離心機(jī)、水浴鍋 公用四 實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)步驟1. 取材與細(xì)胞培養(yǎng)（教學(xué)準(zhǔn)備組完成）采集人新鮮靜脈血無菌狀態(tài)下按22滴全血/8 mL培養(yǎng)液接種(培養(yǎng)基中含有PHA)輕搖勻后置37恒溫箱培養(yǎng)72h終止培養(yǎng)前2小時，加入秋水仙素，使 終濃度達(dá)到3ug/ml2.染色體標(biāo)本制備每離心一次，棄去上清后，均用指腹將沉淀彈勻！收集細(xì)胞：1瓶培養(yǎng)物均分到2支離心管中 2300rpm離心6min，去上清(不吸到細(xì)胞沉淀， 約留300ul液體，指腹彈勻)；低滲處理：離心管中加入37預(yù)溫的低滲液6ml，滴管吹吸 混勻(將滴管伸到液體下方，吸取液體，在液面 上方沿管壁緩慢吹出)，置37恒溫水浴鍋，水 浴30m

4、in后，每管加入8滴(約500ul)固定液預(yù)固定：在低滲液上方，沿管壁緩慢加入固定液(注 意觀察，液面上方會變成黑色)，用滴管輕輕吸取上層液體，在液面上方沿管壁緩緩吹出，兩三次后，再將滴管伸至液 面底部，吸取液體，沿管壁吹出；2300rpm，離心6分鐘，棄上清，將沉淀用指腹彈勻； 固定： 加入6ml固定液，吹吸混勻，2300rpm離心6 分鐘，棄上清，將沉淀用指腹彈勻，重復(fù)此 步驟(固定，吹吸，彈勻，加入6ml固定液)， 室溫放置30min；重懸：將固定后的細(xì)胞離心，2300rpm離心6min， 棄上清，指腹彈勻，加入0.2-0.4ml固定液， 滴管輕輕混勻成細(xì)胞懸液，用于下面的制片 3.制片

5、 1) 滴管吸取細(xì)胞懸液，左手持載玻片(磨砂面在左邊)，吸管管口距離載玻片約 4cm高度，從左到右迅速滴片， 第二滴蓋住第一滴，第三滴蓋住第二滴(一輪壓一輪)，滴5-6滴，不超出右邊玻璃，滴完后將玻片稍傾斜，在酒精燈上過火(因固定液易燃，所以將玻片稍傾斜置于酒精燈上即會出現(xiàn)藍(lán)色火焰)，迅速將火焰吹滅，再過一次火，吹滅，將玻片置于載玻臺上 第一滴第二滴第三滴第四滴第五滴2) 用滴管吸取姬姆薩染液，鋪滿整張玻片，染色5分鐘左右。3) 染色后在自來水下沖洗玻片，風(fēng)干，鏡下觀 察五 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)低滲液濃度與低滲的時間應(yīng)掌握適當(dāng)離心機(jī)使用注意配平，離心的速度不宜過高預(yù)固定和固定時，吹懸混勻動作要輕柔滴片

6、時，吸管距離載玻片的高度要控制好固定液含易燃成分，過火焰時防止手部燒傷第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部 人類染色體標(biāo)本核型分析 Karyotypes: describe the chromosome count of an organism and what these chromosomes look like under a light microscope. Attention is paid to their length, the position of the centromeres, banding pattern, any differences between the sex chromosomes, and any other physical characteristics. 一個體細(xì)胞中的全部染色體，按其大小、形態(tài)特征(著絲粒的位置）順序排列所構(gòu)成的圖像就稱為核型 實(shí)驗(yàn)分組與實(shí)驗(yàn)器材一人一組鏡油瓶、擦鏡紙 一套/二組顯微鏡 一臺/人染色體中期分裂相標(biāo)本片 一張/人實(shí)驗(yàn)步驟 1 將染色體標(biāo)本片置于顯微鏡載物臺上2 低倍鏡下選擇染色體形態(tài)和分散良好的中期分裂相，移到視野中心，換至高倍鏡3 高倍鏡下觀察染色體的形態(tài)特征，選取染色體形態(tài)清晰的分裂相，換至油鏡4 油鏡下計(jì)數(shù)約15個細(xì)胞的染色體數(shù)，選擇較好的核型，手繪染色體圖注意事項(xiàng)1 顯微鏡使用