細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用及前景講述

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用及前景講述概述 細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)是現(xiàn)代三大前沿生物科學(xué)，發(fā)展異常迅速。細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)研究中最常用的方法之一。由于在體外培養(yǎng)中和機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞行為的基本規(guī)律是一樣的，因此許多研究可以在體外進(jìn)行。更重要的是，在培養(yǎng)條件下，人們可以有目的的、有選擇地控制細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境，因此可以研究在某些特殊條件下的細(xì)胞生物學(xué)行為。本講主要目的是介紹動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用。一 分類1.組織培養(yǎng)(Tissue Culture)指的是從體內(nèi)取出組織摹擬體內(nèi)生理環(huán)境,在無(wú)菌 、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下,使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。2.細(xì)胞培養(yǎng)(Cell Culture):

2、培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。3.器官培養(yǎng)（Organ Culture）：培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官,使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法.組織培養(yǎng)的分類和基本概念 歷史 1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng),材料是雞胚神經(jīng)板,采用生理鹽水為培養(yǎng)液,并首次采用組織培養(yǎng)這個(gè)術(shù)語(yǔ)。1907年Harrison 和1912年Carrel開(kāi)始把組織培養(yǎng)作為一種方法,用于研究離體動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展大致可分三個(gè)時(shí)期：50年代之前是細(xì)胞培養(yǎng)在多個(gè)領(lǐng)域發(fā)展期；50年代是細(xì)胞培養(yǎng)迅猛發(fā)展期，多種培養(yǎng)技術(shù)相繼建立；50年代后是體外培養(yǎng)技術(shù)與生命科學(xué)其他技術(shù)結(jié)合發(fā)展的新時(shí)期，誕生了

3、多種培養(yǎng)的應(yīng)用技術(shù)。 由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，如抗病毒疫苗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細(xì)技術(shù)。許多細(xì)胞株、細(xì)胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細(xì)胞系，如Hela細(xì)胞系（Gey，1952），可用來(lái)進(jìn)行一系列研究，更加促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。1)細(xì)胞內(nèi)部的種種活動(dòng),如DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、能量代謝;2)細(xì)胞內(nèi)部的流動(dòng),如RNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)方向運(yùn)轉(zhuǎn),激素受體復(fù)合物的易位等;3)生態(tài)學(xué),如營(yíng)養(yǎng)、感染、病毒或化學(xué)誘變、藥物作用;4)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用,如胚胎誘導(dǎo)、細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)等.組織培養(yǎng)中感興趣的研究領(lǐng)域 1）理化環(huán)境可以調(diào)控 2）細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳

4、代培養(yǎng)形成細(xì)胞系，其特征基本相同，對(duì)外界影響因素的反應(yīng)也較為一致。 3）培養(yǎng)物可直接暴露在預(yù)測(cè)的試劑中，預(yù)測(cè)樣品用量少，并可直接觀測(cè)反應(yīng)。 4）可通過(guò)繁殖擴(kuò)增，提供大量均勻的細(xì)胞備用，供比較不同因素或同一因素不同劑量對(duì)同一細(xì)胞株的作用。 5）可以人工篩選具有一定特征變異的細(xì)胞株或細(xì)胞融合，有利于基因功能的研究。 6）組織培養(yǎng)結(jié)合縮時(shí)電影技術(shù)，可以直接觀察細(xì)胞的活動(dòng)和對(duì)外界作用的反應(yīng)。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)體內(nèi)外細(xì)胞的差異 當(dāng)人工條件和體內(nèi)實(shí)際情況不完全相同時(shí),細(xì)胞在體外培養(yǎng)后,一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響,生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中,發(fā)生變化則是必然.細(xì)胞最多見(jiàn)的表現(xiàn)是:返祖（Atavis

5、m）現(xiàn)象失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀。培養(yǎng)細(xì)胞的分化 不適應(yīng)（Deadaption）細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細(xì)胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性.脫分化和去分化（Dedifferentiation）由于基因變異而使細(xì)胞失去分化能力。如肝細(xì)胞失掉產(chǎn)生精氨酸酶及氨基酸轉(zhuǎn)移酶的特性后,儲(chǔ)存肝糖元的能力喪失,并很難再現(xiàn).所以說(shuō),不適應(yīng)和脫分化兩個(gè)概念不同.不適應(yīng)是因?yàn)樯鏃l件改變而使分化發(fā)生抑制;從分子水平考慮,脫分化很可能是基因變異所致. 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài) 1.貼附型： 1）成纖維細(xì)胞：心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等 2）上皮型細(xì)胞：消化管

6、外皮細(xì)胞，肝臟上皮細(xì)胞等 3）游走型細(xì)胞：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 4）多形型細(xì)胞：神經(jīng)組織細(xì)胞 2.懸浮型：如癌細(xì)胞和血液白細(xì)胞 組織培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖 1.原代培養(yǎng)（Primary Culture）階段：原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，嚴(yán)格的說(shuō)即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng) ，隨不同的組織時(shí)間長(zhǎng)短不一，一般為1-4w。2.傳代培養(yǎng)（Subculture）階段：或稱繼代培養(yǎng)。也就是細(xì)胞系（Cell line）階段。細(xì)胞增殖旺盛，一般細(xì)胞可傳代10-50代）。二倍體細(xì)胞系（Diploid cell line）：即細(xì)胞保持二倍體核型。 3.衰

7、退階段： 細(xì)胞增殖減慢或不增殖，甚至最后凋亡。但少數(shù)情況下，在這三期的任何一點(diǎn)，由于某種因素影響，細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性轉(zhuǎn)化。（物理 化學(xué) 病毒等因素1）潛伏期（Latent phase）：細(xì)胞從接種到貼壁生長(zhǎng)繁殖的一段時(shí)間。2倍體細(xì)胞該期時(shí)間長(zhǎng)（24-96h），連續(xù)細(xì)胞系時(shí)間短（10-30min）。一代周期內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的三個(gè)時(shí)期2) 指數(shù)生長(zhǎng)期（Logarthmic growth phase）：細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，一般用細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitotic index MI）表示：即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.1-0.5%，且受細(xì)胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。指數(shù)生

8、長(zhǎng)期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contact inhibition）。而惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。但癌細(xì)胞則由于營(yíng)養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Density inhibition）。3）停滯期（Stagnate phase）：即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)液的交換面積減少,代謝產(chǎn)物積累,PH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。在此時(shí)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行換液傳代，否則因細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細(xì)

9、胞才能恢復(fù)。 細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題 1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物:一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長(zhǎng),不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度. 2）PH:7.2-7.4 7.6或6.0 細(xì)胞損傷、退變或死亡3）培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空間:一般培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10.4）容積、深度、表面面積:培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為5）去除死細(xì)胞: 6) 溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度波動(dòng)較為敏感。溫度低于36.5C，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，高于38C，細(xì)胞失去活力。 1.據(jù)CCTV4報(bào)道，13年10月中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)臺(tái)北榮民總醫(yī)院在干細(xì)胞研究方面有重大突破，研究人員利用干細(xì)胞已分化出網(wǎng)膜和心肌細(xì)胞，目前該研究正

10、處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，未來(lái)有望生產(chǎn)干細(xì)胞藥品有效治療失明、心臟病等。 細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用2.一口好牙不但能給出一個(gè)美麗的笑容，還是健康的標(biāo)志。但由于疾病或意外事故，我們可能失去牙齒。鑲顆金牙吧，有損整體美觀?，F(xiàn)在好了，科學(xué)家成功利用人的尿液衍生的細(xì)胞誘導(dǎo)形成干細(xì)胞獲得再生牙齒雛形。7月30日，這項(xiàng)研究成果刊登在學(xué)術(shù)期刊細(xì)胞再生上，同時(shí)也引發(fā)國(guó)際社會(huì)廣泛討論。 3. 中化新網(wǎng)訊 科學(xué)家13年8月表示，他們已利用干細(xì)胞，培養(yǎng)出能在培養(yǎng)皿上自發(fā)收縮的人類心臟組織，意味在尋求制造移植器官方面獲致進(jìn)展。 美國(guó)賓州匹茲堡大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用取自人類皮膚細(xì)胞得出的誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（iPS），制作出名為MCPs的心臟前

11、驅(qū)細(xì)胞。4. 2013年7月，利用誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（iPSCs），日本科學(xué)家首次成功培育出具有功能的人類肝臟。這項(xiàng)發(fā)表在自然上的研究結(jié)果轟動(dòng)了整個(gè)科學(xué)界。當(dāng)前急需器官移植的患者眾多，器官的捐獻(xiàn)率卻常年處于低位。iPS細(xì)胞培養(yǎng)的器官有望成為移植臟器的新來(lái)源，減少患者對(duì)于捐贈(zèng)器官的依賴。研究小組利用人類誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（iPSCs），在體外培育出簡(jiǎn)單的人類肝臟，移植到小鼠體內(nèi)后，這些肝臟成功血管化并正常行使功能。這是科學(xué)界首次用誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（iPSCs）培育出具有功能的人類器官。 5. CLS生物治療的原理是利用自身免疫殺滅腫瘤細(xì)胞。2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者斯坦曼博士在1973年發(fā)現(xiàn)了激活免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞DC細(xì)胞。在20世紀(jì)80年代，科學(xué)家又培養(yǎng)出了具有腫瘤強(qiáng)殺傷效應(yīng)的CIK細(xì)胞。這兩種細(xì)胞是腫瘤生物治療的關(guān)鍵。CLS生物治療通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)萬(wàn)倍擴(kuò)增這兩類細(xì)胞，再輸回患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)腫瘤大面積殺傷治療。CLS多細(xì)胞生物免疫治瘤-有效延長(zhǎng)生命長(zhǎng)度 3-5年,保證提升生物質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)瘤自我康復(fù) .細(xì)胞培養(yǎng)前景 胚胎干細(xì)胞是人體發(fā)展的初始階段，胚胎干細(xì)胞被認(rèn)為是治療修復(fù)人體的最好材料。美國(guó)奧巴馬總統(tǒng)上任后的第一個(gè)科技政策就是支持鼓勵(lì)胚胎干細(xì)