細(xì)菌內(nèi)毒素經(jīng)典簡介以及檢測方法

1、關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素經(jīng)典簡介及檢測方法第一張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月內(nèi) 容基本概念實(shí)驗方法操作注意事項第二張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、概念及相關(guān)知識熱原反應(yīng)：病人在靜脈給藥15分鐘后發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。熱原：任何可以導(dǎo)致肌體發(fā)熱的物質(zhì)。機(jī)理：外源性熱原質(zhì)通過內(nèi)源性熱原質(zhì)起作用。外源性熱原質(zhì)吞噬性白細(xì)胞內(nèi)源性熱原質(zhì)體溫調(diào)節(jié)中心發(fā) 熱新蛋白合成新mRNA翻譯第三張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1942年，美國藥典首次收載熱原檢查法，中國藥典自第一版（1953年版）起收載。所有注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經(jīng)過熱原檢查

2、。熱原檢查法的局限性： 1、重現(xiàn)性差。 2、對藥物引起的增加、抑制作用無法控制。 3、不同細(xì)菌產(chǎn)生的熱原質(zhì)的致熱域有差別。 4、非定量反應(yīng)。雖然不排除有其他熱原物質(zhì)存在，但細(xì)菌內(nèi)毒素是最主要的熱原物質(zhì)。第四張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)： 肽聚糖 脂蛋白革蘭氏陽性菌 革蘭氏陰性菌 外膜細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。當(dāng)細(xì)胞磷壁酸 脂多糖細(xì)菌內(nèi)毒素：革蘭氏陰性壁外膜結(jié)構(gòu)完整時不具備生物活性，只有當(dāng)細(xì)菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內(nèi)毒素活性。脂多糖結(jié)構(gòu)：多糖O抗原核心多糖類脂A致熱活性部分第五張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月內(nèi)毒素的量值：1、內(nèi)毒素單位（EU） 19

3、82年FDA將當(dāng)時美國代號為EC2的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)定為5EU/ng。1983年內(nèi)毒素單位（EU）被USP正式引用。2、國際單位（IU） WHO先后兩次組織協(xié)作標(biāo)定，建立內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品，其中第二批內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品適用于所有內(nèi)毒素檢查法，且明確1IU1EU。第六張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。第七張

4、，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)機(jī)理內(nèi)毒素C因子活化的C因子凝膠B因子凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鱟凝血系統(tǒng)酶聯(lián)反應(yīng)第九張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 凝膠法 濁度法 光度法 顯色基質(zhì)法 重現(xiàn)性好 能定量 能控制藥物的增強(qiáng)/抑制干擾 操作簡便。節(jié)省時間方法分類方法特點(diǎn)第十張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測之凝膠法實(shí)驗程序1、試驗準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復(fù)核4、供試品干擾試驗（新藥或新方法）5、供試品內(nèi)毒素限量檢查

5、第十一張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗材料及用具1、儀器名稱要求天平感量0.1mg以下電熱干燥箱300恒溫水浴箱371 水銀或酒精溫度計100 1 漩渦混合器/計時器60min1min2、器具器具分類器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑1075mm）、試管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭其他酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號筆第十二張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月試劑1、鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號2、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品3、內(nèi)毒素檢查用水4、三效熱原滅火劑5、75乙醇常用英文縮寫B(tài)ET：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 BET水：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

6、 MVD：供試品最大有效稀釋倍數(shù) NC：陰性對照MVC：供試品最低有效濃度 PC：陽性對照：鱟試劑靈敏度 L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值第十三張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月靈敏度復(fù)核試驗：每批鱟試劑用于檢測前都必須進(jìn)行靈敏度復(fù)核。試驗舉例：內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為100EU/支； 待測鱟試劑靈敏度0.25EU/ml。1、制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用75酒精擦拭后啟開，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min后進(jìn)行稀釋，步驟如下(箭頭下方為加入BET水量)：100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.

7、25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.8ml0.2ml1.8ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml第十四張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月0.2ml0.2ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml水水溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品水水水水100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml（2 ）（ ）（0.5 ）（0.25 ）第十五張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml裝量，則取18支，每支加入0.1mlBET水溶解

8、；若鱟試劑裝量大于0.1ml，則取若干支，按標(biāo)示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分裝于標(biāo)準(zhǔn)玻璃試管（10mm75mm），將試管按如下形狀排列。3、加樣：每列每支加入相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。12230.540.25BET水22220.50.50.50.50.250.250.250.25第十六張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月反應(yīng)及結(jié)果判斷：加樣結(jié)束后用封口膜封口，輕振動混勻，置37 水浴中保溫602min，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180，凝膠不變形為“”，凝膠不能保持完整為“”。 當(dāng)2.0四支管都為陽性，0.25四支管都為陰性時，試驗成立，按下

9、面底公式計算復(fù)核的靈敏度c ： clg-1(X/4)（X:反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值。） 當(dāng)0. 5c 2.0時，鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，檢測時仍以標(biāo)示靈敏度為準(zhǔn)。第十七張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月舉例：設(shè)待復(fù)核的鱟試劑標(biāo)示靈敏度為0.125EU/ml:平行管數(shù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（EU/ml）NC反應(yīng)終點(diǎn)濃度CX(lgC)0.250.1250.060.031+-0.06-1.222+-0.125-0.9033+-/0.125-0.9034+-/0.125-0.903clg-1(X/4) lg-1（-1.22）（-0.903）（ -1.22 ）（ -1.22 ）/4 0.104（EU/ml

10、） c在0. 52.0范圍內(nèi)，符合規(guī)定。第十八張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月樣品內(nèi)毒素檢查1、供試品最大有效稀釋倍數(shù)的計算： CL MVD ：測試用鱟試劑靈敏度標(biāo)示值(EU/ml)。L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值。C：供試品濃度或供試品復(fù)溶后所得樣品濃度。當(dāng)L單位為EU/ml（溶液）時，C的單位為1ml/ml；當(dāng)L單位為EU/mg或者EU/u時（抗生素原料），C的單位為mg/ml或者u/ml。第十九張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、供試品溶液稀釋：將供試品稀釋，稀釋倍數(shù)為MVD。 含2內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的供試品溶液（PPC）的制備：3、加樣：取鱟試劑8支，每支加入BET水0.1ml

11、溶解。2支為樣品管，加入樣品液0.1ml；2支加入陰性對照管，加入BET水0.1ml；2支為陽性對照管，加入2 2濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml；2支為樣品陽性管，加入0.1ml含2內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液。 371水浴中保溫601min。稀釋0.5MVD倍的供試品1.0ml4濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0ml混合含2內(nèi)毒素的供試品溶液第二十張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月示意圖：結(jié)果判斷： 陽性對照為陽性 陰性對照為陰性 試驗結(jié)果成立 樣品陽性對照為陽性 2支樣品管均為陰性時，樣品符合規(guī)定； 2支樣品管均為陽性時，樣品不符合規(guī)定； 樣品管1支為陽性1支為陰性時，需復(fù)試。 復(fù)試時做4支

12、樣品管，有1支為陽性則樣品不符合規(guī)定。樣品陽性陰性樣品陽性第二十一張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月例：硫酸慶大霉素注射液 規(guī)格：4000U/ml內(nèi)毒素限值L：參考獸藥典“每1000慶大霉素單位含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5EU”，即 L0.5EU/1000U=0.0005EU/U鱟試劑標(biāo)示靈敏度：0.125EU/U供試品最大稀釋倍數(shù) CL 4000U/ml0.0005EU/U MVD 160（倍） 0.125EU/U 第二十二張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月供試品溶液制備：含2內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的供試品溶液的制備：取500U/ml的樣品溶液1.0ml0.5EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液混

13、合。供試品4000U/ml1000U/ml500U/ml250U/ml0.4ml3.6ml1.0ml3.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml稀釋10倍稀釋40倍稀釋80倍稀釋160倍用量多第二十三張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果判斷：結(jié)果判斷樣品管陰性對照陽性對照樣品陽性對照符合規(guī)定不符合規(guī)定需復(fù)試符合規(guī)定不符合規(guī)定第二十四張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、操作注意事項試驗前準(zhǔn)備：1、玻璃器具應(yīng)規(guī)范化，便于除熱原、計量準(zhǔn)確、清洗操作方便。洗凈 去污去內(nèi)毒素 去洗滌劑 精洗 除外源性熱原：250 干烤至少1小時。2、盡量用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后

14、250 干烤至少1小時。3、用于內(nèi)毒素檢測的稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且保證無內(nèi)毒素。第二十五張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，保證環(huán)境溫度、濕度及通風(fēng)穩(wěn)定。實(shí)驗人員：用適宜的洗滌劑洗手，用75酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。實(shí)驗過程：1、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)嚴(yán)格按要求低溫保存；工作標(biāo)準(zhǔn)品開封后盡快使用且應(yīng)一次性用完，不再保存。2、溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；進(jìn)一步稀釋時每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s。第二十六張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十七張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月振蕩前振蕩后內(nèi)毒素分子在水溶液中的狀態(tài)第二十八張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3、每一步稀釋液所用的移液器不能反復(fù)、交叉使用。4、鱟試劑復(fù)溶時應(yīng)將檢查用水順著瓶壁加入，避免產(chǎn)生氣泡。5、操作時間的長短。環(huán)境溫度變化都會影響實(shí)驗結(jié)果，故操作應(yīng)盡量熟練、快速。6、恒溫器的溫度變化應(yīng)1，鱟試劑與樣品混勻后應(yīng)立即移入水浴槽，嚴(yán)格控制保溫時間在602min，保溫期間不得移動試管架，桌面保持平穩(wěn)，周圍不能有振顫因素。7、使用的試管為10mm7