轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法材料

1、生命科學(xué)前沿講座論文轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法姓名：陳繼款系另上生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)：生物信息學(xué)年級(jí)：2008級(jí)學(xué) 號(hào)：080567011指導(dǎo)老師：薛李春總成績(jī)：2010年07月02日轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法自1983年世界第一例轉(zhuǎn)基因作物問(wèn)世以來(lái)，目前全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積已達(dá)到5 000萬(wàn)hm2以上， 大量的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品被直接或間接的制成人類的食品，呈迅猛發(fā)展的趨勢(shì)。但是轉(zhuǎn)基因作物作為一種新物種， 其對(duì)人體健康、生態(tài)平衡是否具有危害還未確定。許多國(guó)家以立法或其他形式要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)記。 我國(guó)于2001年5月23日頒布農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例，2002年3月20日開(kāi)始實(shí)行的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基 因生物標(biāo)識(shí)管

2、理辦法規(guī)定，國(guó)家對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)行檢驗(yàn)檢疫和標(biāo)識(shí)制度。世界各國(guó)均對(duì)轉(zhuǎn)基因食品及 其加工產(chǎn)品出具是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的認(rèn)定報(bào)告。因此轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)就顯得尤為重要。轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè) 主要從兩個(gè)方面人手，一是核酸水平，即檢測(cè)遺傳物質(zhì)中是否含有插入的外源基因；二是蛋白質(zhì)水平，即通 過(guò)插入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其功能進(jìn)行檢測(cè)，或者是檢測(cè)插入外源基因?qū)d體基因表達(dá)的影響，主 要檢測(cè)外源基因?qū)Σ迦胛稽c(diǎn)附近基因影響及對(duì)其代謝產(chǎn)物的影響，由于該類型檢測(cè)成本高，所需時(shí)間長(zhǎng)，且 被認(rèn)為重要性較低，目前該類檢測(cè)實(shí)際工作中較少涉及。本文分別對(duì)核酸和蛋白質(zhì)兩種水平上的檢測(cè)方法進(jìn) 行綜述。1核酸水平主要檢測(cè)報(bào)告基因、啟

3、動(dòng)子和終止子，是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的重要手段。椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟 動(dòng)子、胭脂堿合酶NOS終止子等10多種基因和基因片段廣泛存在于轉(zhuǎn)基因植物中，這就為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品提 供了便利。核酸水平的檢測(cè)可以分為定性和定量?jī)煞N。1定性檢測(cè)1. 1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)1996年德國(guó)伯恩斯坦大學(xué)的Meyer Rolf等論證了 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的可能性。利用該方法在鑒定轉(zhuǎn) 基因抗除草劑大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米系列標(biāo)準(zhǔn)品Btl76 Maxi maizer的實(shí)驗(yàn) 中，可以檢測(cè)到僅為0. 5%轉(zhuǎn)基因成分。Matsuoka等通過(guò)對(duì)7種轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)入

4、的外源基因的序列分析，設(shè) 計(jì)了 14對(duì)檢測(cè)該7種轉(zhuǎn)基因玉米啟動(dòng)子、終止子和結(jié)構(gòu)基因的引物，分別對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn) 基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)為檢測(cè)所設(shè)計(jì)引物的特異性，還對(duì)其他作物如水稻、大 麥、小麥等進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)結(jié)果表明該方法能夠快速有效地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品種。每一次實(shí)驗(yàn)均需要 設(shè)有陰性及陽(yáng)性對(duì)照以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。在樣品采集及處理過(guò)程中也需要注意防止污染。1. 2 多重 PCR多重PCR是常規(guī)PCR方法的改進(jìn)，它是在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因序列。這種方法具 有更大的可靠性和適應(yīng)性，并且能降低檢測(cè)成本。多重PCR可以同時(shí)針對(duì)幾個(gè)靶位

5、點(diǎn)進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè)。V. T. Forte等利用其設(shè)計(jì)的多重PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和Bt玉米樣品進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果表明該方法能夠 準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，其檢測(cè)結(jié)果可以精確到2%0. 1%的范圍。Permingeat等僅用兩 對(duì)引物就可同時(shí)檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米Btl76、MON810、Btll和T25的CrylA(b)和pat基因。多重PCR也可同 時(shí)準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出Roundup Ready大豆的NOS和epsps序列片段。1. 1. 3 巢式和半巢式 PCR(nested PCR and semi-nested PCR)巢式PCR(nested PCR)是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的

6、一種PCR技術(shù)。其原理是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一 對(duì)引物在另一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上，通過(guò)二次PCR反應(yīng)對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)。1. 1. 4 核酸印記法(southern blot)以放射性或熒光標(biāo)記的外源目的基因的同源序列作為探針與該食品原料農(nóng)產(chǎn)品的總DNA進(jìn)行雜交。首先 用限制酶消化受體總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片斷，隨后使DNA在原位發(fā)生變性，并從 凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持體上。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持體的過(guò)程中，各個(gè)DNA片斷的相對(duì)位置保持不變，用放射 性或熒光標(biāo)記的探針與各個(gè)DNA片斷雜交，經(jīng)放射自顯影確定與探針互補(bǔ)的電泳條帶的位置。核酸印記法技 術(shù)用于食品外源基因的檢測(cè)可檢測(cè)出

7、外源基因與內(nèi)源基因有高度同源性的DNA片斷，且準(zhǔn)確可靠，但對(duì)樣品 的純度要求較高，費(fèi)用也較高。1.2定量檢測(cè)1. 2. 1競(jìng)爭(zhēng)性PCR通過(guò)比較要擴(kuò)增的樣品中目標(biāo)DNA和在同一體系中進(jìn)行擴(kuò)增的已知量的競(jìng)爭(zhēng)性DNA而得到的，競(jìng)爭(zhēng)性DNA 必須與目標(biāo)DNA具有相同的引物和不同的分子量，以便二者既能同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)又能使擴(kuò)增后的兩種產(chǎn)物 通過(guò)凝膠電泳區(qū)分開(kāi)來(lái)。Anastasia k等在競(jìng)爭(zhēng)性PCR的基礎(chǔ)上，對(duì)雙競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR(Double cmantitative competitive PCR，DCPCR)進(jìn)行了研究，并與實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行了比較，證明競(jìng)爭(zhēng)性PCR具有靈敏度高、探針價(jià)格 更低廉的優(yōu)點(diǎn)。

8、1. 2. 2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time Fluorescence Quantitative PCR)這是在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中非常重要的一種檢測(cè)技術(shù)。在該體系中，除了兩條普通的引物外，還有一條在 5和3端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光染料基團(tuán)(R)、粹滅熒光染料基團(tuán)(Q)，并與PCR產(chǎn)物特異片段結(jié)合的寡核苷 酸探針。熒光染料也有報(bào)道用SYBR Green021。陳穎等利用該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米Mon 810和Event 176的定 量檢測(cè)低限均小于0. 01%031。劉冰峰等利用該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草K358進(jìn)行了檢測(cè)。它通過(guò)分析起始拷 貝數(shù)的方式以標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而判定待檢產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因含量

9、。在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中閉管操作，使用 熒光染料特異標(biāo)記PCR產(chǎn)物，實(shí)時(shí)顯示PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)積累，且沒(méi)有繁雜的后續(xù)處理過(guò)程，避免了產(chǎn)物的污 染，方法快捷、靈敏、有效。2. 3多重?zé)晒釶CR多重PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)合，劉光明等利用該技術(shù)對(duì)馬鈴薯、大豆、玉米、甜椒、番茄共11份 實(shí)物樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示馬鈴薯樣品2份及大豆、玉米、甜椒樣品各l份中檢出35S和Nos雙組分，另 6份樣品均未檢出。2蛋白質(zhì)水平上的檢測(cè)1蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)蛋白質(zhì)印跡法將電泳較高的分離能力、抗體的特異性和顯色酶反應(yīng)的靈敏性結(jié)合起來(lái)，是檢測(cè)復(fù)雜混合 物中特異蛋白質(zhì)的最有力的工具之一。普遍用于分離、

10、檢測(cè)特異的目的蛋白質(zhì)，靈敏度為1 ng5 ng。它可 確定一個(gè)樣品中是否含有低于或超過(guò)預(yù)定限值水平的目的蛋白質(zhì)，特別用于不可溶蛋白質(zhì)的分析。vanDuijn 等用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Roundup Ready大豆中的CP4合成酶，檢測(cè)限在0. 5% 1%。驗(yàn)證該方法可對(duì)大豆 蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)Rogan等用ELISA法檢測(cè)出傳統(tǒng)大豆加工產(chǎn)品中混有2%Roundup Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白質(zhì)。這 種蛋白質(zhì)檢測(cè)方法具有商業(yè)可利用性并具有高度選擇性和靈敏性。免疫測(cè)定的主要缺點(diǎn)之一

11、是復(fù)雜基質(zhì)對(duì)它 的準(zhǔn)確性和精確度有干擾，如加工的蔬菜和食品。某些導(dǎo)入蛋白質(zhì)并不是在植物的所有組織中均有表達(dá)，例 如在玉米中一些蛋白質(zhì)大部分表達(dá)在葉子中，而不在谷粒中。3其它檢測(cè)方法隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)研究的深入以及各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)要求的提高，迫切地需要更準(zhǔn)確、 快速、安全、高效且成本低廉的檢測(cè)技術(shù)的問(wèn)世。除了上面介紹的方法外，還有一些其它的檢測(cè)方法。目前， 色譜技術(shù)(HPLC)、近紅外波譜技術(shù)(NIR)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)、超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(HRCA)以及基于一些成 熟技術(shù)建立起來(lái)的試劑盒技術(shù)、試紙條技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品的實(shí)際檢測(cè)中都有所應(yīng)用。4結(jié)束語(yǔ)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法多種多樣，

12、各有其優(yōu)缺點(diǎn)。在實(shí)際的檢測(cè)中，并非任何一種檢測(cè)方法對(duì)某種轉(zhuǎn)基 因食品的檢測(cè)都行之有效。應(yīng)該根據(jù)食品種類和加工類型的不同，以及食品中可能含有的轉(zhuǎn)基因片段的不同， 選擇最有效的檢測(cè)方法。同時(shí)，現(xiàn)有的檢測(cè)方法也在不斷的改進(jìn)中，隨著各國(guó)有關(guān)轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)簽法的建立 和不斷完善，對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的準(zhǔn)確定量檢測(cè)顯得日趨重要。這就要求，轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法向著高質(zhì)量、 高靈敏度、高準(zhǔn)確性、自動(dòng)化和低成本的方向發(fā)展。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)儀器轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，就是檢測(cè)產(chǎn)品中有否外源基因，其實(shí)是檢測(cè)啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因片斷、目的 基因片斷、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的豐度等。就方法而言，又分為基因水平的檢測(cè)(各種PCR擴(kuò)增、定性、定量 方法和基因芯片技術(shù))和基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)(酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)以及Southen雜交Western 印跡法等)，主要使用儀器按檢測(cè)程序分三部份：1、用于DNA樣品制備的儀器設(shè)備：試劑盒、微量