豬腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的組織特異性及發(fā)育變化

1、豬腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的組織特異性及發(fā)育變化華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 馮定遠(yuǎn) 2022/8/111氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)控 蛋白或氨基酸利用率在傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)中是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。日糧中氨基酸和蛋白水平影響小腸氨基酸和肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)，這觀(guān)點(diǎn)已很早提出來(lái)（Wolfram等，1984） 。 近十年，編碼哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸和二肽、三肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNAs 序列被克隆，使揭示日糧氨基酸和蛋白對(duì)小腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響成為可能。 2022/8/112飼料氨基酸在體內(nèi)的消化和代謝2022/8/113氨基酸經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑1,一種是穿過(guò)細(xì)胞膜的經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通道（transecellular t

2、ransport）,又分為兩類(lèi)。 (1)一類(lèi)是由基頂向基底膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，稱(chēng)為吸收，如存在于基頂膜的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體； (2)另一類(lèi)是由基底向基頂膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，稱(chēng)為分泌，如基底膜的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)。2,另一種是穿過(guò)側(cè)細(xì)胞間隙的細(xì)胞旁路通道（paracellular transport）。2022/8/114腸上皮微觀(guān)結(jié)構(gòu)及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑2022/8/115腸道粘膜細(xì)胞刷狀緣頂端存在的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)1,Na+依賴(lài)性中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)B0+，Na+依賴(lài)性中性和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)B0+，2,Na+和K+依賴(lài)性酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)XAG，3,H+驅(qū)動(dòng)脯氨酸和甘氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)IMINO(PAT)，4,Na+依賴(lài)性中

3、性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ASC，5,非Na+依賴(lài)性中性和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)b0,+。2022/8/116腸道粘膜細(xì)胞基底部位存在的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)1,Na+依賴(lài)性中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)A和N，2,Na+依賴(lài)性堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)y+L，3,非Na+依賴(lài)性中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)asc和L。2022/8/117哺乳動(dòng)物主要堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2022/8/118腸道堿性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制2022/8/119不同的物種，起關(guān)鍵作用的氨基酸不同。攝食賴(lài)氨酸含量豐富的雞，其小腸刷狀緣膜的b0,+類(lèi)似的賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)提高。在人Caco-2腸細(xì)胞模型中，用胞外賴(lài)氨酸培養(yǎng)細(xì)胞2天后，b0,+轉(zhuǎn)運(yùn)活性持續(xù)下降。2022/8/1110物種之間的差

4、異，使得對(duì)不同物種的氨基酸和肽轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程不能從一個(gè)物種推斷到另一物種。 關(guān)于豬腸道中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的組織特異性的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。 2022/8/1111目前豬基因組測(cè)序的完成還未完成。我們首次克隆了三個(gè)堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA的部分序列，為從分子水平研究轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)奠定了基礎(chǔ)(周響艷等 2007)。2022/8/1112成功克隆豬腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體b0,+AT和y+LAT1 cDNA的部分片斷，其長(zhǎng)度分別為1118bp和302bp，基因庫(kù)登陸序列號(hào)分別為EF127855和EF127856;與人的b0,+AT和y+LAT1 cDNA序列進(jìn)行同源性比較分析發(fā)現(xiàn)，同源性分別為8

5、7.6%和95.7%。 2022/8/1113b0,+AT427bpy+LAT1302bpb0,+AT447bpb0,+AT407bpb0,+AT635bpb0,+AT和y+LAT1基因PCR擴(kuò)增的電泳圖100250500750100020002022/8/1114b0,+AT427bpy+LAT1302bpb0,+AT635bpb0,+AT407bp菌液鑒定PCR電泳圖b0,+AT447bp100250500100020002022/8/1115為了研究豬腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化，我們選擇了長(zhǎng)白豬和廣東地方品種藍(lán)塘豬作為試驗(yàn)動(dòng)物(周響艷等 2007) 。2022/8/1

6、116純種藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬1日齡150日齡2022/8/1117豬腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的組織特異性兔小腸粘膜細(xì)胞不同氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA的表達(dá)從空腸到回腸逐漸升高（Munck等，1992） 。與我們的研究的結(jié)果基本一致，即豬腸道四種堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體b0,+AT、y+LAT1、CAT1和CAT2的mRNA表達(dá)回腸均高于空腸。在我們進(jìn)行的肉雞腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的研究中，嶺南黃肉雞，rBAT和y+LAT2 mRNA表達(dá)回腸高于空腸，與豬的研究結(jié)果一致。 2022/8/1118rBAT mRNA的表達(dá)豐度在小腸的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，即回腸高于空腸，空腸高于十二指腸，十二指腸

7、高于結(jié)腸，與我們的研究的結(jié)果CAT1 mRNA在 不同腸段的表達(dá)比較一致，與b0,+AT、y+LAT1和CAT2的mRNA表達(dá)不一致； 2022/8/1119b0,+AT, CAT1和CAT2回腸mRNA表達(dá)豐度顯著高于十二指腸和空腸。表明了腸道遠(yuǎn)端有吸收那些未在腸道近段吸收的氨基酸的作用，從而更有效地吸收氨基酸。 2022/8/1120 2022/8/1121我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAT1和CAT2的mRNA在不同腸段的表達(dá)豐度比b0,+AT和y+LAT1相對(duì)要低。證實(shí)了我們的肉雞研究的推測(cè)：堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)b0,+ 和y+L是在腸道堿性氨基酸吸收中起主要作用，y+系統(tǒng)不是主要的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。2

8、022/8/1122我們的研究結(jié)果表明，存在于腸細(xì)胞刷狀緣的堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)b0,+和存在于基底膜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)y+L的轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA在十二指腸、空腸和回腸的表達(dá)豐度都高于y+系統(tǒng)的CAT1和CAT2，據(jù)此可推測(cè)系統(tǒng)b0,+和y+L是腸道近端堿性氨基酸吸收的主要轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。2022/8/1123b0,+AT和y+LAT1回腸mRNA表達(dá)高于十二指腸和空腸，這說(shuō)明氨基酸的吸收主要在腸道近段。但腸道遠(yuǎn)端對(duì)未被吸收的氨基酸進(jìn)行吸收也是非常重要的，這樣腸道就能更大程度吸收氨基酸。 2022/8/1124豬腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化 十二指腸和回腸中b0,+AT和y+LAT1 mRNA

9、的表達(dá)分別具有類(lèi)似的發(fā)育性變化，空腸中這兩個(gè)基因mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化與十二指腸和回腸有較大的差異，這表明腸道不同部位在堿性氨基酸吸收功能上可能存在差異。 2022/8/1125我們的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)b0,+AT和y+LAT1 mRNA在十二指腸的表達(dá)豐度。這表明b0,+AT和y+LAT1 mRNA的表達(dá)在十二指腸在長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬具有相似的發(fā)育性變化。長(zhǎng)白和藍(lán)塘豬回腸中，b0,+AT mRNA的表達(dá)在30-150d呈逐漸上升的趨勢(shì)，150d達(dá)最高，y+LAT1 mRNA的表達(dá)在1-30d各個(gè)時(shí)期差異都不顯著，60d都顯著升高，90d顯著下降，150d又顯著升高到60d時(shí)水平；長(zhǎng)白和藍(lán)塘豬空腸中，b0

10、,+AT mRNA的表達(dá)在60d都達(dá)到最高，且與其他各個(gè)階段都達(dá)到顯著水平，y+LAT1 mRNA的表達(dá)都在90d時(shí)達(dá)到最低水平。 2022/8/1126兩個(gè)品種豬同一基因在不同腸段，其mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化有所差異，同一基因在不同品種豬的十二指腸和回腸具有類(lèi)似的發(fā)育性變化，空腸的發(fā)育性變化差異較大。 2022/8/1127比較斷奶前后b0,+AT和y+LAT1 mRNA在十二指腸、空腸和回腸的表達(dá)都有所下降。表明斷奶應(yīng)激導(dǎo)致各個(gè)腸段堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)豐度下降，這可能是斷奶應(yīng)激造成豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，即腸絨毛萎縮，隱窩加深，而影響?zhàn)B分在腸道吸收的主要原因。2022/8/1128

11、腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體b0,+AT和y+LAT1的mRNA在各腸段的表達(dá)豐度都較y+系統(tǒng)的CAT1和CAT2要高，這表明腸道y+系統(tǒng)在氨基酸吸收中可能不是起主要作用的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。 2022/8/1129這些結(jié)果表明兩個(gè)品種豬CAT1 mRNA在不同腸段表達(dá)的發(fā)育性變化基本相似，同一階段的表達(dá)豐度有所差異，長(zhǎng)白豬有高于藍(lán)塘的趨勢(shì)。 2022/8/1130我們的研究表明，豬堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體b0,+AT、y+LAT1、CAT1和CAT2 mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化在十二指腸、空腸和回腸都有較大差異。不同品種豬的十二指腸和回腸中b0,+AT、y+LAT1和CAT1 mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化分別存在

12、有相似的發(fā)育規(guī)律，CAT2 mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化規(guī)律都存在差異，但其mRNA表達(dá)的高峰時(shí)期及其下降幅度等存在差異。不同品種豬y+LAT1和CAT2 mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化規(guī)律不同。b0,+AT、y+LAT1、CAT1和CAT2 mRNA 表達(dá)的發(fā)育性變化也存在品種差異。2022/8/1131十二指腸堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化2022/8/1132空腸堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化2022/8/1133回腸堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化2022/8/1134藍(lán)塘和長(zhǎng)白豬十二指腸、空腸和回腸中b0,+AT、y+LAT1、CAT1和CAT2 mRNA

13、表達(dá)的發(fā)育性變化趨勢(shì)分別存在較大差異；藍(lán)塘和長(zhǎng)白豬的十二指腸和回腸中b0,+AT、y+LAT1和CAT1 mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化分別存在有相似的發(fā)育規(guī)律，但其mRNA表達(dá)的高峰時(shí)期及其下降幅度等存在差異；CAT2 mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化規(guī)律在不同腸段都存在較大的差異。 2022/8/11352022/8/1136豬日糧中添加乳酸菌，對(duì)十二指腸和空腸b0,+AT、y+LAT1 、CAT1和CAT2 mRNA的表達(dá)豐度都有提高的趨勢(shì)，且在空腸b0,+AT和十二指腸y+LAT1 mRNA的表達(dá)達(dá)到顯著水平；對(duì)回腸y+LAT1和CAT1 mRNA的表達(dá)豐度有提高的趨勢(shì)，但差異不顯著。2022/8/1137長(zhǎng)白豬腸道中b0,+AT和y+LAT1 mRNA表達(dá)的組織特異性有所差異。 b0,+AT mRNA表達(dá)豐度回腸極顯著高于十二指腸，空腸和結(jié)