大學(xué)課程設(shè)計(jì)模板

1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)血管生成的作用09050841班 楊志艷、 高小帆 、趙東東題 目目錄： 一、設(shè)計(jì)目的與意義 三、設(shè)計(jì)方案 二、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用及背景 四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、心得體會(huì) 1、通過鞏固、復(fù)習(xí)以前所學(xué)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)知識(shí)，結(jié)合查閱的相關(guān)資料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使學(xué)生掌握生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本思路和基本方法，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力。 2、 通過本課程設(shè)計(jì)使學(xué)生對(duì)以后的專業(yè)課學(xué)習(xí)、實(shí)踐與畢業(yè)設(shè)計(jì)等有所幫助。一、設(shè)計(jì)目的與意義 1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），早期亦稱作血管通透因子（VPF)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在 體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。 2 、VEGF在內(nèi)皮細(xì)

2、胞中的作用 血管滲透性: VEGF是一個(gè)通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞上同系受體介導(dǎo)多重功能的多效的生長(zhǎng)因子。 VEGF由于其對(duì)小靜脈有高滲作用而被命名為VPF。 事實(shí)上, VEGF是已知的最有效的VPF,比組織胺要強(qiáng)50 000倍。 由于VEGF及VEGFR途徑在腫瘤血管生成中的中心作用, 它已經(jīng)是腫瘤學(xué)領(lǐng)域藥物發(fā)展和基礎(chǔ)研究的焦點(diǎn)。腫瘤血管的高滲透性被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF有關(guān)。 血管高滲透性可導(dǎo)致多種血漿蛋白, 包括纖維蛋白原及其他凝固蛋白的外漏。這種能力可導(dǎo)致纖維蛋白在細(xì)胞外間質(zhì)沉積,最終二、血管生長(zhǎng)因子的作用及背景：可延緩水腫液體的清除, 從而使正常組織抗血管生成向促血管生成轉(zhuǎn)化。VEGF可增

3、加多種血管床的滲透性, 包括皮膚、腹膜、腸系膜和隔膜的血管床, 可導(dǎo)致惡性腹水和惡性腫瘤性胸腔積液等病理狀態(tài)。事實(shí)上, 抑制VEGF可減少胸腔積液和腹水的形成。 VEGF增加微血管滲透性的精確機(jī)制還不是很清楚。 Dvorak等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF通過跨內(nèi)皮細(xì)胞途徑誘導(dǎo)大分子從內(nèi)皮細(xì)胞滲出。其他研究者證實(shí)VEGF可通過其他跨細(xì)胞途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞開窗, 或者是VEGF增加細(xì)胞間內(nèi)皮細(xì)胞而打開相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間的連接。 最近更多的研究證明VEGF誘導(dǎo)滲透性可能是介導(dǎo)鈣離子依賴通路, 他涉及氧化亞氮生成、激活A(yù)kt通路和增加cGMP, 這是除了激活前列腺素的Erk1/2途徑外的一條新途徑。 內(nèi)皮細(xì)胞的激活:

4、VEGF在血管內(nèi)皮和內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮著許多不同的作用。 這些作用包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變, 細(xì)胞骨架的變更以及刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)。VEGF可誘導(dǎo)增加許多不同的內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá), 包括促凝血組織因子和溶解纖維蛋白途徑的蛋白, 其中溶解纖維蛋白途徑的蛋白包括尿激酶, 組織型纖維蛋白溶酶原激活劑, 纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑,尿激酶抑制劑, 金屬基質(zhì)蛋白酶, 谷氨酸葡萄糖載體, 氮氧合酶, 整合素, 和多種分裂素。 VEGF已經(jīng)被證實(shí)能通過釋放氧化亞氮和前列腺素誘導(dǎo)活體外血管舒張。將VEGF注射入大鼠體內(nèi)可造成短暫的心動(dòng)過速, 低血壓和心臟輸出量的減少。VEGF的這種作用可能可以從部分上解釋臨床抗V

5、EGF實(shí)驗(yàn)時(shí)偶然發(fā)生高血壓和頭痛的現(xiàn)象。3、VEGF與腫瘤 VEGF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞滲透、激活、存活、增殖、浸潤(rùn)和遷移, 與腫瘤血管生成和淋巴管成密切相關(guān), 阻斷VEGF信號(hào)途徑可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。 腫瘤為自身的生存發(fā)展、創(chuàng)造有利的微環(huán)境, 他可促進(jìn)其微血管的生成, 獲取豐富的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng), 而淋巴管的生成在腫瘤擴(kuò)散過程中發(fā)揮著更重要的作用, 因此闡明VEGF在腫瘤血管生成合淋巴管生成的機(jī)制, 有利于為抗腫瘤治療開辟一條有效的途徑。 新血管的形成是腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和傳播過程中的一種基本活動(dòng)。 因此,在癌癥研究領(lǐng)域, 人們對(duì)研究腫瘤血管生成的分子機(jī)制十分感興趣。 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)路徑是這一

6、過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。VEGF/VEGFR軸由多重配基和受體質(zhì)量 疊加交錯(cuò)組成,并且受體與配基結(jié)合具有專一性, 在不同的細(xì)胞中具有不同的細(xì)胞類型表達(dá)和功能。 啟動(dòng)VEGFR信號(hào)通路,觸發(fā)了一個(gè)網(wǎng)狀的信號(hào)過程, 從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和存活。此外, VEGF介導(dǎo)的血管滲透性, 已經(jīng)被證實(shí)與惡性滲出有關(guān).最近, VEGF的一個(gè)重要作用表現(xiàn)為可動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移從而形成新生血管。 VEGF促進(jìn)腫瘤血管生成的作用和與人類癌癥的發(fā)病機(jī)制的關(guān)系是確定的, 因而有必要設(shè)計(jì)和發(fā)展針對(duì)這一途徑的抑制因子。 許多的VEGF/VEGFR治療的研究表明, 這些因子能有效地抑制臨床前模型的血管生成和腫瘤

7、生長(zhǎng)。因此, 抑制VEGF途徑被確認(rèn)為是一種重要的有效的抗癌模式。 應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因,探討其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及其血管生成的影響。將自行構(gòu)建的以VEGF基因?yàn)榘邢虮磉_(dá)短發(fā)夾狀RNA的重組質(zhì)粒(pAVU6+27-VEGF-siRNA)轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株中(C組),以空質(zhì)粒(pAVU6+27)轉(zhuǎn)染為陰性對(duì)照(B組),經(jīng)G418篩選出陽性克隆細(xì)胞,未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞株為空白對(duì)照(A組),建立裸小鼠皮下移植瘤模型。通過測(cè)量移植瘤的質(zhì)量、體積觀察移植瘤生長(zhǎng);免疫組化檢測(cè)瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)及組織內(nèi)的微血管密度(MVD)

8、改變，得出VEGF在沉默情況下對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及血管生成的影響，從而得到VEGF對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及血管生成的影響。三、設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)器材與用品： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： BALB/c裸小鼠15只, 45周齡,雄性,體質(zhì)量1923 g,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, SPF實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)試劑：人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株，DMEM高糖培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)小牛血清，含U6啟動(dòng)子的質(zhì)粒pAVU6+27,表達(dá)VEGF shRNA質(zhì)粒，兔抗人VEGF多克隆抗體,兔抗人因子相關(guān)抗原多克隆抗體, S-P 9000免疫組化試劑盒,DAB顯色試劑盒，G418,DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %滅活小牛

9、血清, 1105U/L青霉素, 100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中,于37、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用Roche公司的DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒包裹經(jīng)滅菌處理的重組質(zhì)粒(質(zhì)粒脂質(zhì)體=16)。轉(zhuǎn)染前1 d,換取新鮮培養(yǎng)液(含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液, 37, 5%CO2孵箱中培養(yǎng))后調(diào)整濃度為2105/m,l以每孔2 ml接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),待細(xì)胞增至60% 80%時(shí),將質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中, 18 h后棄去轉(zhuǎn)染液,換含新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),棄去原培養(yǎng)液。設(shè)計(jì)過程 重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后, 400g/mlG41

10、8篩選1周,實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組均可見抗性克隆開始形成,空白對(duì)照組細(xì)胞全部死亡,換正常培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的陽性克隆繼續(xù)細(xì)胞擴(kuò)增、傳代培養(yǎng),取抗性克隆形成1周后細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pAVU6+27-VEGF siRNA的HCT116細(xì)胞記為C組,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的pAVU6+27的HCT116細(xì)胞作為陰性對(duì)照B組,未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞作為空白對(duì)照A組。 2裸小鼠移植瘤模型建立將已培養(yǎng)好基本長(zhǎng)滿瓶壁的3組HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞PBS液沖洗2次,加入0. 25%胰蛋白酶數(shù)滴消化,將消化好的細(xì)胞吸入離心管內(nèi), 600 r/min離心6 min,棄上清,加入不含小牛血清的DMEM高糖

11、培養(yǎng)基3 m,l吸管吹打混勻(取適量計(jì)數(shù)細(xì)胞) ,再離心(600 r/min, 6 min),棄上清,按每只裸小鼠皮下接種細(xì)胞數(shù)2. 5107/m,l再加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基,供裸小鼠皮下接種用。準(zhǔn)備好的HCT116細(xì)胞懸液經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)95%,按每只0. 2 mlHCT116細(xì)胞懸液注射于消毒后的裸小鼠背部皮下。 3腫瘤生長(zhǎng)的觀察每隔5 d測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)軸(a)和短軸(b),按公式V=ab2/2(cm3)求出近似體積代表腫瘤體積4。 4病理學(xué)檢查于第30天脫頸椎處死,剝離腫瘤,標(biāo)本以4%多聚甲醛固定作組織病理檢查。 5免疫組化技術(shù)選取收集的術(shù)后病理標(biāo)本石蠟塊進(jìn)行5m連續(xù)切片,防脫片

12、處理后進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化S-P法步驟按試劑盒說明進(jìn)行。VEGF蛋白表達(dá)均以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性,按Breasalier半定量公式5判斷染色結(jié)果,在每張切片上隨機(jī)選取10個(gè)視野,根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí),并分別計(jì)分:陰性:細(xì)胞無著色(0分),弱陽性,淺黃色(1分),中度陽性:棕黃(2分),強(qiáng)陽性:棕褐(3分)。計(jì)數(shù)每一強(qiáng)度的視野數(shù),根據(jù)下列公式計(jì)算每張切片的平均染色強(qiáng)度( intensity score, IS): IS=(0F0+1F1+2F2+3F3),F為在10倍視野下計(jì)數(shù)。 6VEGF蛋白表達(dá)測(cè)算 7MVD結(jié)果判定因子陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀,定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞

13、膜及細(xì)胞質(zhì)。光鏡下先以100倍視野選擇3個(gè)微血管染色最豐富區(qū)(新生血管熱點(diǎn)區(qū)) ,然后在200倍視野下計(jì)數(shù)每一區(qū)中的微血管,取其平均值。任何被因子染成棕色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇必須與鄰近微血管、腫瘤細(xì)胞和周圍結(jié)締組織分界清楚,才可作為1個(gè)微血管計(jì)數(shù),管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞及有較厚肌層的血管不計(jì)數(shù),背景中陽性染色的漿細(xì)胞、白細(xì)胞依據(jù)形態(tài)排除. 8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以-xs表示,采用SPSS 10. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,兩組間均數(shù)比較行t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較行單因素方差分析,雙變量行Spearman相關(guān)性分析。1裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況3組裸鼠皮下單側(cè)接種野生型、轉(zhuǎn)染PAVU6+27及pAVU6+27-

14、VEGF的HCT116細(xì)胞后,觀察腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、生長(zhǎng)速度、腫瘤大小。VEGF靶向的siRNA干擾重組體pAVU6+27-VEGF轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后與空質(zhì)粒組、未轉(zhuǎn)染組相比,致瘤性下降,腫瘤生長(zhǎng)減緩(P005)。見表1。表1各組結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤比較(n=5,-xs)組別成瘤時(shí)間(d) 30 d腫瘤體積(cm3) 30 d腫瘤質(zhì)量(g)未轉(zhuǎn)染組7. 331. 53a0. 2560. 016a0. 3240. 026a空質(zhì)粒組7. 760. 96a0. 2480. 014a0. 3160. 015a重組質(zhì)粒組12. 502. 03 0. 1690. 009 0. 1920. 022a:

15、P005,與重組質(zhì)粒組比較五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2各組移植瘤組織的病理檢測(cè)結(jié)果 2. 1大體形態(tài)重組質(zhì)粒pAVU6+27-VEGF轉(zhuǎn)染組皮下腫瘤瘤體較小呈球形,黃白色,質(zhì)軟,剖面如魚肉,剖面滲血較少;未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pAVU6+27組瘤體顯著增大,表面結(jié)節(jié)狀,剖面滲血較多。 2. 2光鏡下形態(tài)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pAVU6+27組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞大小不均,呈高度異形性,毛細(xì)血管較豐富,核/漿比例增大,提示腫瘤生長(zhǎng)旺盛;重組質(zhì)粒pAVU6+27-VEGF轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,毛細(xì)血管明顯減少。 2. 3免疫組化結(jié)果空載體轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞和HCT-116細(xì)胞荷瘤組織中VEGF均表達(dá)

16、強(qiáng)陽性,表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上,呈棕黃色。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞荷瘤組織中VEGF呈弱陽性表達(dá),組間差異顯著(P005)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞荷瘤組織中MVD明顯小于兩對(duì)照組,組間差異顯著(P005)。VEGF表達(dá)與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0. 810,P001)。見表2。表2移植瘤組織中MVD和VEGF表達(dá)(n=5,-xs)組別MVD VEGF(IS)未轉(zhuǎn)染組28. 42. 3a2. 100. 12a空質(zhì)粒組27. 42. 4a2. 040. 14a重組質(zhì)粒組14. 41. 6 1. 060. 10a:P005,與重組質(zhì)粒組比較 C組腫瘤瘤塊的體積(0. 1690.

17、 009)cm3和質(zhì)量(0. 1920. 022)g明顯小于A、B組(P005)。A、B組荷瘤組織中VEGF均表達(dá)強(qiáng)陽性,表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上,呈棕黃色。C組荷瘤組織中VEGF呈弱陽性表達(dá),組間差異顯著(P005)。C組荷瘤組織中MVD明顯小于兩對(duì)照組,組間差異顯著(P005)。 VEGF表達(dá)與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0810,P001)。結(jié)論應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默VEGF基因能明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng),其機(jī)制與其抑制移植瘤中VEGF的表達(dá)和瘤組織內(nèi)血管生成有關(guān)。 腫瘤的惡性增殖受到多種因素的影響,其中腫瘤血管生長(zhǎng)對(duì)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)起重要作用,是影響腫瘤生物行為的重要因素。VEGF是一種重要的促血管形成因子,通過增加微血管的通透性和特異性,與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖,進(jìn)而導(dǎo)致新生血管的生成,具有促血管形成和增加血管通透性的雙重功能,而且還以自分泌的形式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自身生長(zhǎng),在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等方面均起著重要的作用。研究表明,在結(jié)腸癌中VEGF表達(dá)