DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

1、Aptamer的穩(wěn)定性考察一聚丙烯酰胺凝膠電泳Aptamer識(shí)別腫瘤細(xì)胞若選擇4C識(shí)別，則需要提前控溫離心機(jī)，且樣品在上樣檢測(cè)前宜放置于冰中；37C就不用控溫了。Aptamer濃度：熒光標(biāo)記的是50uM,沒(méi)有標(biāo)記的是1OOuMDNA提取注意實(shí)驗(yàn)中戴好橡膠手套，穿好實(shí)驗(yàn)服，以防苯酚粘到皮膚上。取7.3ulaptamer（100uM）于1460ul小鼠血清（無(wú)需過(guò)濾）中，在37C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育；于不同時(shí)間點(diǎn)（6h,5h,4h,3h,2h,1h,1min）取200ul該小鼠血清到新的EP管中，加入200ul（等體積）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先將苯酚-氯仿混勻），混勻，管中溶液變渾濁；用150

2、00轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，管中出現(xiàn)3層：上清、白色變性蛋白層、苯酚層；取上清到新的EP管中。在原EP管（變性蛋白層和苯酚層）中加入200ulTE溶液，混勻（該步進(jìn)一步提取殘留的DNA）；用15000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清；重復(fù)4、5步直到上清澄清；在上清中加入等體積的氯仿（用于去除苯酚），混勻，用15000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清到新的EP管中；加入等體積乙醚（用于去除氯仿），混勻后靜置10分鐘，棄上層乙醚（乙醚比水輕，在上層）；重復(fù)步驟8，敞開(kāi)管蓋15分鐘，待乙醚揮發(fā)；加入1/10體積的3MNaAc、2倍體積的無(wú)水乙醇，放置于-20C冰箱中30分鐘（DNA沉淀）；用16500轉(zhuǎn)/分（轉(zhuǎn)

3、速不宜再高，EP管容易破裂?。╇x心30分鐘；將管中溶液吸出，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。原管中保留約30ul溶液，打開(kāi)管蓋，待管中溶液蒸發(fā)；（我通常將EP管敞開(kāi)，封上封口膜，再扎7、8個(gè)孔，放在通風(fēng)櫥中過(guò)夜。）（管底看不到沉淀，因?yàn)镈NA含量太低。）在管中加入16uL1*TE溶液；進(jìn)行電泳分析前，將樣品在95C水浴中加熱10分鐘（小心管蓋沖開(kāi)或進(jìn)水），在冰上驟冷（使DNA成單鏈）,上樣或保存在-20C冰箱中。聚丙烯酰胺凝膠電泳注意實(shí)驗(yàn)中戴好手套！準(zhǔn)備：清洗干凈玻璃板、涼干！裝好電泳的玻璃板（用1.5mm的厚玻璃板）；有凹槽的一面向內(nèi)！壓緊，避免漏液！配膠：20%變性聚丙烯酰胺凝膠8ml：稱(chēng)取尿素3.3

4、6g,加入45%丙烯酰胺溶液3.56ml,5XTBE1.6ml,加熱使尿素溶解（可用55C水浴加熱），通過(guò)10ml量筒加水至8ml,輕混勻后放在冰上冷卻（溶液溫度較高時(shí)，加入催化劑后將迅速凝膠，甚至來(lái)不及灌膠），加入3-6ulTEMED（助催化劑）、10%過(guò)硫酸銨60ul（催化劑）。催化劑過(guò)多可能導(dǎo)致來(lái)不及灌膠就凝膠！3灌膠：加入TEMED和過(guò)硫酸銨后，用tip頭輕攪混勻，迅速灌膠；灌膠應(yīng)當(dāng)一次性、順暢地完成，避免形成斷層！插上梳子,約30分鐘成膠（觀察梳孔間的凝膠情況）；垂直小心地拔出梳子，小心產(chǎn)生氣泡；拿掉玻璃板底下的防漏膠帶！重新裝好玻璃板！注意有凹槽的一面向內(nèi)！用超純水、1XTBE溶液

5、沖洗加樣孔（很重要，若沒(méi)有清洗干凈，將影響電泳）；加滿整個(gè)梳孔后用濾紙吸干即可。將電泳槽及電泳裝置灌滿1*TBE緩沖液（蓋過(guò)凝膠）；上樣：取8ul樣品和2ulloadingbuffer混勻，用10ul微量注射器加樣（方便伸入加樣孔）；&電泳：先用40V電壓電泳1小時(shí)，再用80V電泳約3-4小時(shí)，至溴酚蘭帶（loadingbuffer中一般含有2種指示劑，跑的較慢的青蘭色是二甲苯氰，跑的較快的藍(lán)色是溴酚蘭）跑至膠的1/2-2/3，停止電泳；（在不同濃度的膠中，溴酚蘭電泳的速度可與某長(zhǎng)度的核酸相當(dāng)，參見(jiàn)我電泳的資料或者李偉師姐的實(shí)驗(yàn)書(shū)）；電泳過(guò)程中會(huì)產(chǎn)熱而影響電泳效果，可以將電泳裝置置于冰盒中，注

6、意保持水平！染色：小心取出凝膠，放在合適的培養(yǎng)皿中，用1XSYBRGold（至少30ml）避光、在搖床中染色20分鐘（室溫還是？）（第2次染色30min，第3次40min，建議SYBRGold最多重復(fù)利用3次。）成像：用凝膠成像系統(tǒng)成像。開(kāi)機(jī)密碼：123456。溶液的配制Bindingbuffer在D-PBS中加入：葡萄糖+MgCl2+BSA（在307超高速離心機(jī)旁冰箱的柜門(mén)中間欄）；混勻后取部分加入10%胎牛血清；剩下溶液中加入10%NaN3（在307超高速離心機(jī)旁冰箱的4C最上層的左邊最里面），混勻，為Washingbuffer。苯酚-氯仿Tris飽和苯酚：氯仿：異戊醇=25：24：1配制

7、方法：將Tris-Hcl平衡酚與等體積的氯仿/異戊醇（24:1）混合均勻后，移入棕色瓶4C保存。45%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺：43.4g加水定容100ml,用一次性濾頭過(guò)濾，保存于棕色瓶中。N,N-亞甲基雙丙烯酰胺：1.6g（可加熱至37C促進(jìn)溶解）（丙烯酰胺單體具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，可通過(guò)皮膚吸收且具有累積效應(yīng)，配制過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格戴手套實(shí)驗(yàn)服；聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作。）O.5MEDTA，50ml稱(chēng)取NazEDTAQO（372.24g/mol）9.306g,加水40ml后邊攪伴邊加NaOH（濃NaOH或者固體NaOH1g左右！）調(diào)pH值至8.0（EDTA將逐漸溶解，若pH值到&0后仍有少量不

8、溶，可適當(dāng)加熱），定容至50ml。高溫高壓滅菌，室溫保存。5XTBETris：27g硼酸：13.75g加水至500ml。（用橡膠塞做瓶蓋）0.5M的ETDA（pH8.0）：10ml（5*TBE是配膠時(shí)用的，電泳時(shí)所用的緩沖液是1*TBE濃度?。?.05M的Tris-HCl，pH8.0，100ml稱(chēng)取Tris0.6057g，加水至80ml后，用濃HCl調(diào)pH值至8.0，定容至100ml。高溫高壓滅菌，室溫保存。1*TE溶液，pH&0,100ml0.05MTris：20ml加水至100ml。高溫高壓滅菌，室溫保存。0.05MTris：20ml加水至100ml。高溫高壓滅菌，室溫保存。0.5METDA：200ul3MNaAc,pH5.2,50ml稱(chēng)取NaAc3H20(136.08g/mol)20.412g,用冰醋酸調(diào)pH值至5.2,定容至50ml,高溫高壓滅菌后使用，室溫保存。SYBRGold染色前配制取10000XSYBRGold(n)ul,加入到(10n)ml1XTBE溶液中，