高中生物 選擇性必修三 基因工程的基本操作程序 課件

1、第二節(jié) 基因工程的基本操作程序人教版高中生物學教材生物技術(shù)與工程（選擇性必修三）第三章主講人：田夢麗 學 校：深圳科學高中問題探討蘇云金桿菌培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉需要哪幾步？Bt基因表達蘇云金伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白）攝食害蟲死亡蘇云金桿菌與載體拼接 普通棉花（無抗蟲特性） 棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程問題探討基因工程的基本操作程序（4個步驟）1234目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取一、目的基因（1）概念：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因；與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、

2、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。（Bt抗蟲蛋白基因：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉）。主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子（2）實例：目的基因的篩選與獲取二、篩選合適的目的基因方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。DNA測序儀核苷酸序列比對氨基酸序列比對美國國家生物信息中心越來越多基因的功能和結(jié)構(gòu)被分析。目的基因的篩選與獲取三、目的基因的獲取方法：利用PCR獲取和擴增目的基因聚合酶鏈式反應(yīng)，根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術(shù)。概念目的基因的篩選與獲取體內(nèi)DNA復制要點回顧（1）條件原料：游離的脫氧

3、核苷酸（A、T、G、C）模板：DNA的兩條鏈酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等能量：ATP（2）復制原則堿基互補配對原則（保證復制的準確進行）目的基因的篩選與獲取三、目的基因的獲取方法：利用PCR獲取和擴增目的基因聚合酶鏈式反應(yīng)，根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術(shù)。概念條件Taq酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶）目的基因（模板DNA）四種游離的脫氧核苷酸引物：核苷酸聚合作用的起始點目的基因的篩選與獲取三、目的基因的獲取過程模板DNA變性 復性 延伸 方法：利用PCR獲取和擴增目的基因553395目的基因的篩選與獲取過程951.

4、變性：加熱至9095，雙鏈DNA間的氫鍵斷裂，解旋為單鏈。變性 復性 延伸 三、目的基因的獲取三、目的基因的獲取利用PCR獲取和擴增目的基因5353使用耐高溫的Taq酶保證高溫條件下仍具有活性。目的基因的篩選與獲取50引物1引物2DNA引物2.復性：冷卻至5560，兩條引物與單鏈DNA結(jié)合過程三、目的基因的獲取三、目的基因的獲取利用PCR獲取和擴增目的基因變性 復性 延伸 5353引物結(jié)合在模板DNA鏈的3端，新合成的子鏈方向為5到3。目的基因的篩選與獲取過程引物1引物272Taq酶Taq酶變性 復性 延伸 3.延伸：加熱至7075，以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈。三、目的基因的獲取三

5、、目的基因的獲取利用PCR獲取和擴增目的基因53533553目的基因的篩選與獲取第1輪結(jié)束第2輪開始第一輪結(jié)束：此時目的基因的量是原始的2倍。三、目的基因的獲取過程變性 復性 延伸 三、目的基因的獲取利用PCR獲取和擴增目的基因53533535目的基因的篩選與獲取三、目的基因的獲取過程955072TaqTaqTaqTaq變性 復性 延伸 三、目的基因的獲取利用PCR獲取和擴增目的基因目的基因的篩選與獲取三、目的基因的獲取過程955072TaqTaqTaqTaq變性 復性 延伸 三、目的基因的獲取利用PCR獲取和擴增目的基因目的基因的篩選與獲取第2輪結(jié)束第二輪結(jié)束：此時目的基因的量是原始的22倍

6、。三、目的基因的獲取過程變性 復性 延伸 三、目的基因的獲取利用PCR獲取和擴增目的基因目的基因的篩選與獲取三、目的基因的獲取擴增方式：利用PCR獲取和擴增目的基因以指數(shù)方式擴增，即_（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）2n（1）若開始只有一個DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為 個。（2）若開始有N個DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為 個。2nN2n目的基因的篩選與獲取堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶解旋酶催化體外復制細胞內(nèi)（主要在細胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶DNA在高溫下變性解旋大量的DNA片段形成整個DNA分子PCR與DNA復制過程比較三、目

7、的基因的獲取利用PCR獲取和擴增目的基因基因表達載體的構(gòu)建 一、基因表達載體的目的（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發(fā)揮作用。 二、基因表達載體的組成位置：功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)?；虻氖锥耍ㄒ欢斡刑厥饨Y(jié)構(gòu)的DNA片段）人們所需要的基因位置：功能：基因的尾端（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉(zhuǎn)錄用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細胞基因表達載體的構(gòu)建 三、基因表達載體的構(gòu)建過程基因表達載體構(gòu)建模式圖載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同

8、黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種培育抗蟲棉的簡要過程使用一種DNA限制酶進行切割，共有幾種連接情況？問題探討應(yīng)用過程中往往選擇2種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割，減少自連情況出現(xiàn)；載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接 反向連接112212212211培育抗蟲棉的簡要過程將目的基因?qū)胧荏w細胞 一、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法-雙子葉植物目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA中重組DNA轉(zhuǎn)入桿菌農(nóng)桿菌侵入植物將目的基因帶入植物細胞 含外源目的基因的重組DNA整合到植物細胞的基因組中目的基因

9、遺傳特性穩(wěn)定維持和表達農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法步驟：培育抗蟲棉的簡要過程將目的基因?qū)胧荏w細胞 二、花粉管通道法在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法導入外源DNA培育抗蟲棉的簡要過程將目的基因?qū)胧荏w細胞 三、顯微注射法-動物細胞目的基因的表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動物顯微注射技術(shù)個體大，易操作。受精卵全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。培育抗蟲棉的簡要過程將目的基因?qū)胧荏w細胞四、Ca2+處理-原核細胞（1）使用Ca2+處理：可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中

10、DNA分子的生理狀態(tài)。（2）過程繁殖快，單細胞，遺傳物質(zhì)相對較少。Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子原核細胞（大腸桿菌）大腸桿菌細胞目的基因的檢測與鑒定檢測是否插入目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否翻譯基因表達的過程生物是否具有新目的基因的檢測與鑒定 一、分子水平的檢測（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法：PCR擴增或DNA分子雜交技術(shù)M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖DNA分子雜交結(jié)果圖目的基因的檢測與

11、鑒定 一、分子水平的檢測（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴增或分子雜交技術(shù)RNA分子雜交(Northern Blot)流程圖Bt基因在抗蟲棉中的表達從左至右依次是苗期葉片、花鈴期葉片，苞葉，花，雌雄蕊和鈴殼目的基因的檢測與鑒定 一、分子水平的檢測（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：抗原-抗體雜交技術(shù)蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交目的基因的檢測與鑒定轉(zhuǎn)Bt基因非轉(zhuǎn)基因 二、個體水平的檢測抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株接種棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達目的基因的檢測與鑒定類型步驟檢測內(nèi)容方法分子檢測第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR擴增DNA分子雜交技術(shù)第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAPCR擴增分子雜交技術(shù)第三步目的基因是否翻譯形成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體水平鑒定抗蟲或抗病的接種實驗抗性以及抗性程度 抗性檢測；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性