實驗植物過氧化物酶同工酶的測定凝膠圓盤電泳

1、實驗九-十 植物過氧化物酶同工酶 的測定（凝膠圓盤電泳法）生物化學實驗之1【實驗目的】 1. 學習聚丙烯酰胺凝膠電泳原理； 2. 掌握聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的操作技術； 3. 學習過氧化物酶同工酶的檢測方法。2【實驗原理】 以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。 聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下聚合而成，具有三維網(wǎng)狀結構，其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié)。3聚丙烯酰胺凝膠結構4 PAGE電泳兼有電荷效應和分子篩效應。由于被分離物質(zhì)所載電荷數(shù)量、分子大小和形狀的差異，因此在電泳時產(chǎn)生不同的永動速率而相互分離。利用

2、特異性的顏色反應使待測酶著色，這樣就可以在凝膠中展現(xiàn)出酶譜。 5 為了提高聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率,通常采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)，即在分離膠上面加一層濃縮膠，因濃縮膠和分離膠中的離子成分、pH、凝膠濃度不同，電泳開始后，由于濃縮效應,較厚的樣品層可以被濃縮的很薄，使電泳具有良好的分辨率。6 過氧化物酶是植物體內(nèi)常見的氧化酶。它能催化H2O2將聯(lián)苯氨氧化成藍色或棕褐色產(chǎn)物。因此，將經(jīng)過電泳后的凝膠置于H2O2-聯(lián)苯胺溶液中染色，出現(xiàn)藍色或褐色的部位即為過氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構成過氧化物酶同工酶的酶譜。7【器材與試劑】（一）材料 小麥芽（二）儀器設備 穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀

3、、冷凍離心機及離心管、 成套電泳槽（圓盤型），pH試紙，其他常規(guī)用具 （三） 試劑 1、分離膠緩沖液（pH 8.9） 2、分離膠貯液 3、過硫酸銨溶液 4、濃縮膠緩沖液 5、濃縮膠貯備液 6、電極緩沖液 7、四甲基乙二胺（TEMED） 8、0.1%溴酚藍溶液 9、聯(lián)苯胺染色母液 8【實驗步驟】 （一）過氧化物酶的提?。喝?12粒發(fā)芽的麥粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris- HCl緩沖液（pH 6.8），冰浴上研成勻漿。 轉入離心管，再用2ml上述溶液沖洗研缽壁并全部轉入離心管，4000r/min離心10 min，上清液供電泳分析用。9 （二）凝膠的制備 1.準備工作： （1）

4、將一空心橡皮塞套在距玻璃管上端2cm處。（2）用封口膜封住玻璃管下端至不漏液體。 103.制備小孔膠（分離膠） 取2個小燒杯，按A:C:水:F等于1:2:1:3的比例，分別取A液、C液和水置于一小燒杯中，混勻；F液置另一小燒杯中。將兩個小燒杯同時放在真空干燥器中同時抽氣510min，可見有氣泡冒出。11 將2個小燒杯內(nèi)的液體倒在一起輕輕混勻（勿重新帶入空氣），用滴管先取少量凝膠液加至玻璃管內(nèi)并甩幾下，使液體置于底部，同時注意觀察是否漏膠。然后盡快將其它凝膠液裝入至達高度距上端口1cm為止。仔細地向表面加一層水以隔絕空氣。此時可 見水與膠之間有一界線，但很快消失。 將玻璃管垂直固定在一試管中，

5、置2535溫箱聚合3060min，當再次看到水與凝膠之間的界線時，表示聚合完成。吸去表面的水。124.制備大孔膠（濃縮膠） 取2個小燒杯，按照B:D:E:F等于1:1.5:1:4的比例，分別取B液、D液和E液置于一小燒杯中，混勻；F液置另一小燒杯中，抽氣。將2個小燒杯內(nèi)的液體輕輕混勻加至小孔膠上面1cm高度，仔細地向表面加一層水。2535聚合2030min，聚合后的大孔膠呈乳白色。仔細吸去表面的水。13（三）電泳1.安裝電泳槽：向電泳槽下槽加入適量甘氨酸Tris電泳緩沖液。去掉玻璃管下端的封口膜，將玻璃管固定在電泳槽上，陰極在上，陽極在下。142.點樣：取樣品50L，蔗糖溴酚籃50L, 混勻，

6、加入玻璃管中。加緩沖液至浸沒過玻璃管上端口及電泳槽上蓋的電極。排除玻璃管下端口的氣泡，連接好電泳儀。153. 電泳：開始電流為23mA/管，當樣品至分離膠時，電流加大到45mA/管。當溴酚藍指示劑接近管底時切斷電源，終止電泳。164. 剝膠：取下玻璃管，用裝有長針頭的注射器沿玻璃管內(nèi)壁慢慢地邊注水邊進入，并試著沿玻璃管內(nèi)壁輕輕轉動針頭。當膠條松動時，用洗耳球小心地將膠條壓出，裝于試管中。17（四）染色：臨用時配制染色液：（10 ml ） 聯(lián)苯胺母液 0.5 ml H2O 9.3 ml 3% H2O2 0.2 ml 將染液倒入盛有凝膠條的試管中（沒過膠條）。約10min后用自來水沖洗。18（五）記錄并計算： 觀察、記錄酶譜，并計算各同工酶的相對遷移率。19【要點提示】1. 分離膠聚合時間應控制在3060min，聚合過快使凝膠太脆易斷裂，主要是AP或TEMED過量引起；聚合過慢甚至不聚合，可能是AP或TEMED用量不足或已失效。2. 電泳時如果電泳槽蓋上有冷凝水，則表示電壓或電流過大，體系發(fā)熱，可引起蛋白質(zhì)變性、凝膠底部斷裂等，應注意調(diào)整。特別是進入分離膠后應通過控制電壓，調(diào)節(jié)電流不超過5mA/管。