綜述藥品生產(chǎn)車間污染菌溯源技術

1、藥品生產(chǎn)車間污染菌溯源技術綜述前言：微生物包括：細菌、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內的一大類生物群體，它微小，生存能力強，蹤跡遍布全球各個角落。涵蓋了有益跟有害的眾多種類，廣泛涉及食品、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領域。200年前列發(fā)現(xiàn)微生物世界以后的間，微生物學的研究基本上停留在形態(tài)描述和分門別類階段。顯微鏡技術使人類開始認識了微生物，然而在對微生物的生 命活動和功能有所知曉之前，微生物學并沒有誕生。直到19世紀中期，以法國斯德和德國的為代表的科學家才將微生物的研究從形態(tài)描述推進到生理學研究階段，了微生物是造成發(fā)酵和人畜疾病的原因，并建立了分離、培養(yǎng)、接種和滅菌等一系列獨特的微生物技術。從

2、而奠定了微生物學的基礎，促使微生物學 迅速誕生，同時開辟了醫(yī)學和工業(yè)微生物等分支學科。無菌藥品是關系國計民生的特殊商品，微生物是無菌產(chǎn)品主要污染來源?？稍凇⑽锪?、公用系統(tǒng)、工藝流程設計、操作設計、包裝系統(tǒng)、測試方式方法等各個環(huán)節(jié)產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)異常物質時，首先要確定異常物質是不是微生物？是的話，是什 么微生物？它從哪里來的？如何去除方法？鑒別微生物是任何有關環(huán)境或事件 中的基礎部分。國內外動態(tài)：2015版中國藥典全面與國際標準接軌，建議對受控環(huán)境收集到的微生物進行適當水平的鑒定，以掌握微生物菌群信息，有助于制定有效的清潔、及微生物檢測方法。通則9204對檢出微生物的鑒定已做了明確規(guī)定，當微生物的鑒定

3、結果有爭氏系統(tǒng)細菌學手冊 (Bergeys Manual of Systematic議時，以Bacteriology)現(xiàn)行版的鑒定結果為準。微生物鑒定是指借助現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，通過對未知微生物的特征測定，對其進中分離的微生物進行鑒定，以判定試驗是否重試；藥品潔凈微生物監(jiān)測和控制指導原則（通則 9203）中建議對潔凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進行鑒定，以掌握環(huán)境微生物污染情況，有助于污染。此外，在藥品生產(chǎn)中，有時亦需對藥物原料、輔料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)品中檢出的微生物進行適 當水平的鑒定。微生物鑒定系統(tǒng)是基于不同的分析方法，其局限性與方法和數(shù)據(jù)庫的局限息相關，未知菌鑒定時通過與

4、微生物鑒定系統(tǒng)中的標準微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配來完成。如果數(shù)據(jù)庫中沒有此模式菌株，就無法獲得正確的鑒定結果。在日常的微生物鑒定試驗中，用戶應明確所采用鑒定系統(tǒng)的局限性及所要達到的鑒定水平(屬、種、菌株)，選用最適合要求的鑒定技術，必要時采用多種行細菌、酵母菌和霉菌大類的區(qū)分，或屬、種及菌株水平確定的過程，它是藥品微生物檢驗中的重要環(huán)節(jié)，藥典通則相應章節(jié)中對檢出微生物的鑒定做了明確規(guī)定，如“非無菌藥品的微生物檢查:控制菌檢查”（通則 1106）中選擇培養(yǎng)基或指示培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)的疑似菌落需進行鑒定； 對“無菌檢查法”（通則 1101）的陽性實驗結果鑒定方法確定。目前微生物鑒

5、定方法主要有以下幾點：（1）常規(guī)鑒定 常規(guī)鑒定內容有形態(tài)特征和理化特性.形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應、酶反應和學反應等.（2）BIOLOG碳源自動分析鑒定 BIOLOG鑒定系統(tǒng)以微生物對不同碳源的利用情況為基礎,檢測微生物的特征圖譜,建立與微生物種類相對應的數(shù)據(jù)庫.通過將待測微生物與數(shù)據(jù)庫參比,得出鑒定結果.該系統(tǒng)已獲FDA認可,已逐步應用于食品和飲品企業(yè)、環(huán)保、海洋生物/水產(chǎn)品、制藥、農(nóng)業(yè)微生物、生物治理、化妝品、臨床等領域的微生物鑒定試驗中.CICC擁有國內最全的BIOLOG數(shù)據(jù)庫,涉及革蘭氏菌、革蘭氏陽性菌、厭氧菌、酵母、絲狀真菌在內

6、近2000種微生物.（3）分子生物學鑒定 由于大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的，所以 DNADNA 雜交、聚合酶鏈反應、16S rRNA 序列和 18S rRNA 序列、多位點序列分型、焦磷酸、DNA 探針和核糖體分型分析等型微生物鑒定方法從遺傳進化角度闡明微生物種群之間的分類學關系,是目前微生物分類學研究普遍采用的鑒定方法.CICC擁有微生物菌種分類鑒定的分子生物學,配有PCR儀、高速冷凍離心機、電泳儀、HPLC、凝膠成像系統(tǒng)、紫外控溫分析系統(tǒng)等先進儀器設備,以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列.（4）API細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)API鑒定系統(tǒng)涵蓋15個

7、鑒定系列,約有1000種生化反應,目前已可鑒定超過600種的細菌.鑒定過程中,可根據(jù)細菌所屬類群選擇適當?shù)纳砩b定系列,通過將待測細菌與數(shù)據(jù)庫參比,得出鑒定結果.CICC目前可應用API 50CH系列、API 20 E系列、API Sta系列對乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）和相關細菌、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌屬（Staylococcus sp.）、微球菌屬（Micrococcus sp.）和菌屬（Locuria sp.）進行鑒定.（5）TLC薄層層析CICC將TLC薄層層析技術應用于微生物菌種鑒定,進行細菌、放線菌細胞壁化學組分分析（氨基酸、糖）,作為

8、劃分屬特征的重要鑒定技術,起到了良好的輔助作用.（6）全細胞脂肪酸分析鑒定系統(tǒng) 采用Sherlock全自動細菌鑒定系統(tǒng),通過對不同菌株的脂肪酸圖譜進行分析,并 與標準數(shù)據(jù)庫進行比對,來鑒定細菌及酵母.該技術是細菌或酵母種水平鑒定的有效之一.微生物常規(guī)鑒定技術簡介：為了迅速而簡單地鑒定一個有機體，鑒定時，一般先將待檢菌進行初步的分類。在鑒定工作中所應用的實驗項目應保持最少，這是很重要的。為做到這一點，首先必須明確鑒定目的。大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風險評估中，對所檢出微生物鑒定需達到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學、細胞形態(tài)學(桿狀、球

9、狀、細胞群、孢子形成模式等)、革 蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結論的關鍵生化反應(如氧化酶、過氧化氫酶和凝固酶反應)進行分析，一般即可滿足需要；非無菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應達到種屬的水平；無菌試驗結果陽性和無菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗時，對檢出的微生物鑒定至少達到種屬水平，必要時需達到菌株水平。微生物鑒定的操作技術1、待檢菌的分離純化微生物鑒定的第一步是待檢培養(yǎng)物的分離純化，微生物在自然界中呈混雜狀態(tài)存在，每種微生物有不同的形態(tài)和生理特征，要了解某種微生物，就必須單獨2、表型試驗表型微生物鑒定通常需要大量的純培養(yǎng)物，而微生物的恢復、增殖和鑒定易受性。因此，在表型鑒定時應注意采

10、用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)對鑒定結果的影響。目前已有的基于碳源利用和生化反應特征的鑒定方法，如氣相色譜法分析微生物的脂肪酸特征、MALDI-TOF質譜法分析微生物蛋白等微生物鑒定系統(tǒng)，在進行結果判斷時需借助于系統(tǒng)自身的鑒別數(shù)據(jù)庫，還依賴特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法以確保鑒定結果的一致性。 表型微生物鑒定方法已廣泛應用于藥品微生物。根據(jù)微生物表型鑒定所提供的信息可以判斷藥品中污染的微生物種類，也可掌握環(huán)境微生物菌群的變化，并進行產(chǎn)品的風險評估。在許多質量控制中，單獨的表型鑒定結果就能給出充足的信息幫助進行深入，并按需要制定適宜的糾正措施。初篩表型試驗 常規(guī)的微生物鑒定，一般要先進行初篩試驗確定待檢

11、菌的基本微生物特征，將 待檢菌做初步分類。常見的初篩試驗包括：培養(yǎng)物： 菌落形態(tài)、菌落顏色、形狀、大小和產(chǎn)色素；形態(tài)學： 細胞形態(tài)、細胞大小、細胞形狀、鞭毛類型、內容物、革蘭氏染色、 芽孢和抗酸染色、孢子形成模式 ；生理學： 氧氣耐受性、 范圍、最適溫度和范圍、耐鹽性；生態(tài)學：微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長條件等。培養(yǎng)時間影響，事實上許多環(huán)境微生物在普通的微生物增殖培養(yǎng)基中是無法恢復的；此外，一些從初始培養(yǎng)物中剛分離出的受損微生物還可能不能完整的表達其表型屬把這種微生物分離出來研究。微生物分離和純化的方法很多，最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化，以獲取待檢菌的

12、純培養(yǎng)物（單個菌落）必要時可進一步進行純培養(yǎng)，也可采取稀釋分離法，即將待分離的樣品進行一定的稀釋，并使微生物的細胞(或孢子)盡量以分散狀態(tài)存在，然后使其長成一個個純種單菌落。微生物的生長條件也是準確測定微生物的重要前提條件，應選擇能使特定樣品中微生物生長的適宜培養(yǎng)基，可通過細菌生長試驗證實。使用培養(yǎng)基前要檢查其靈敏度和無菌性。根據(jù)不同的檢查項目選用各類培養(yǎng)基，確定培養(yǎng)溫度和時間。驗證實驗的采用的培養(yǎng)條件要與實際檢測的條件相一致， 以保證實驗的真實性與重現(xiàn)性。從藥物原材料、制藥用水、及生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)品的樣品中檢出的受損微生物，經(jīng)分離純化程序使其由不利生存易產(chǎn)生變化的狀態(tài)轉變?yōu)樵跔I養(yǎng)富集

13、和最佳培養(yǎng)溫度條件下生存的穩(wěn)定狀態(tài)，以保證鑒定結果準確性。初篩試驗可為評估提供有價值的信息，對于微生物鑒定方法來說，初篩試驗是最關鍵的一步，若給出了錯誤的結果，將影響后續(xù)試驗，包括微生物鑒定試劑盒和 引物的選用。 進一步表型鑒定 通過比較微生物的理化特征和特征化學成分與典型微生物的差異的進一步進行鑒別。生化反應： 碳源的利用、碳水化合物的氧化或發(fā)酵、酶的模式 抑制性： 膽鹽耐受性、抗生素敏感性、耐受性 學： 凝集反應、熒光抗體 化學分類： 脂肪酸、微生物毒素、全細胞組分 生態(tài)學：細胞成分、表面抗原、生化反應和對抗菌劑的敏感性等表型的表達， 微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長條件等。4、型（分子遺傳

14、學）微生物鑒定傳統(tǒng)的細菌分類一直以分離培養(yǎng)為前提，然后再依據(jù)其形態(tài)學、生理生化反應特征以及免疫學特征加以鑒定。只能反映極少數(shù)微生物的信息。20世紀6O年代末 Woese CR開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類。分子生物學理論與技術的迅速發(fā)展給傳統(tǒng)微生物分類鑒定帶來了巨大的革新.當代微生物分類學利用遺傳學原理和方法分析微生物種、屬間的親緣關系.遺傳分類法是根據(jù)核酸分析得到的遺傳相關性(genectic relatedness)所做的分類.因為這種分類方法是以決定生物表型特征的遺傳物質-核酸作為比較的準繩,所以它是一種客觀和度較高的分類方法1.目前較常使用的方法有：1 、DNA 中 G+Cmol

15、%分析每一個微生物種的 DNA中 GCmol% 的數(shù)值是恒定的，不會隨著環(huán)境條件、培養(yǎng)條件等的變化而變化，而且在同一個屬不同種之間，DNA中 GCmol%的數(shù)值不會差異太大，可以某個數(shù)值為中心成簇分布，顯示同屬微生物種的 GCmol%范圍。 DNA 中GCmol%分析主要用于區(qū)分細菌的屬和種，因為細菌 DNA中 GC含量的變化范圍一般在 25 75 ；而放線菌 DNA 中的 GC 比例范圍非常窄 (37 51%) 。一般認為任何兩種微生物在 GC 含量上的差別超過了10 ，這兩種微生物就肯定不是同一個種。因此可利用 G+Cmol來鑒別各種微生物種屬間的親緣關系及其遠近程度。共有兩種方法可測，溶

16、解溫度（Tm）法*和浮力密度法*。溶解溫度（Tm）法的操作步驟菌株培養(yǎng)和收集DNA 提取和純化Tm 測定計算2 、16SrRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析DNA 提取從平板中直接挑取一環(huán)分離菌株細胞,破壁，抽提得到 DNA，加通用引物， PCR擴增，（3）( )，計算機自動開始搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫中序列并進行序列比較，根據(jù)同源性高低列出相近序列及其所屬種或屬，以及菌株相關信息，從而初步判斷 16SrDNA鑒定結果。3 、DNA-DNA雜交* 結雙鏈 DNA后根據(jù)能生成雙鏈的情況，檢測雜合百分數(shù)。（4）迅速將比色杯內的溫度上升到 50左右，取出比色杯檢查有無氣泡，氣泡用手指輕（6）測定

17、終點判斷 從 50開始繼續(xù)加熱，同時變性曲線，當溫度增加到 A260 吸收不再任何微生物鑒定都應從微生物形態(tài)學、生理要求和微生物來源等方面判斷鑒定結果是否合理。錯誤的鑒定會導致不恰當?shù)募m正和預防措施及產(chǎn)品處置。 微生物鑒定方法的確認應包括準確度、專屬性、重現(xiàn)性、靈敏度、陽性值、值。型鑒定與表型鑒定的結果差異的情況相對比較少見，例如，具有相同或非常相似的微生物具有不同的表型、具有相似表型的卻具有不同的以及型距離很遠的微生物不能被歸為同種或同屬。多相分類學的概念是匯集和吸收了分子生物學、生理學、形態(tài)學、學或生態(tài)學資源的多層信息進行微生物分類，例如，微生物特征描述、表型和數(shù)據(jù)及微生物來源等，都可被成

18、功的應用于微生物鑒定中，以避免因使用單一鑒定方法做出毫無意義的結論。 菌株水平的鑒定在污染過程中非常重要，尤其適用于產(chǎn)品中的微生物數(shù)量物進行評估。 同一地點的同種菌其表型特征和型特征是基本一致的。不同地點的同種菌表型特征可能基本一致，但保守及可變區(qū)域的特征會有一定的差異性。因此污染等應以型特征鑒定為主，表型特征鑒定為輔。 實際工作中無菌試驗陽性結果中分離出的微生物，經(jīng)對其溯源分析，確認污染歸因于無菌試驗過程中所使用的材料或無菌技術的差錯，該試驗可判無效，否則判該產(chǎn)品不符合要求。對潔凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進行適當比率的鑒定，高于建議水平或出現(xiàn)異常高的微生物檢出情況時。菌株水平的鑒定在無

19、菌工藝中也很重要，在無菌試驗結果陽性和培養(yǎng)基灌裝等模擬工藝失敗時，必須對檢出的微生增加時即為測定終點。（7）GC 含量計算在 0.1SSC 溶液中，G+C mol%的計算公式為： G+C mol%=51.2+2.08（Tm（X）- Tm（R）其中 Tm（X）為待測菌 Tm 值，Tm（R）為 E.coli K-12 的的 Tm 值總結：彈除去。（5）設置測定程序 按照每分鐘升溫 1的速度設置升溫程序，具體的設置方法按儀器使用說明進行。DNA 提取將帶測菌株的 DNA 分別裝入兩只石英比色杯中，塞好帶有晶體管點溫度計熱敏電阻探頭的塞子，另一帶塞子的石英比色杯裝入 0.1SSC 作空白對照。比色杯放入分光光度計的帶有加熱裝置的比色架內，固定波長在 260nm。DNA雜交法的基本原理是用 DNA解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的 DNA在體外加熱解鏈，并在合適的條件下，使互補的堿基重新配對（4） 將所得序列通過 Blast 程序與 GenB中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析掌握環(huán)境微生物污染情況，有助于污染。 為了確證微生物為同種中的兩個相同株，需比對的序列和特征片段，甚至是全的比對，實現(xiàn)既鑒定又溯源的目的，同時保證結果的準確性。此外，有些微生物的溯源還需結合表型特征鑒定，如沙門菌屬（ 型的鑒定）