粗多糖測定方法的比較

1、一）苯酚法測定可溶性糖【實驗原理】植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合 成一種橙紅色化合物，在10100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且 在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用于 甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白 質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定 160min以上。【實驗儀器及試劑】.儀器：分光光度計、電爐、鋁鍋、20mL刻度試管、刻度吸管、記號筆、吸 水紙適量。.試劑：90%苯酚溶液：稱取90g苯酚（AR）,加蒸

2、儲水10mL溶解，在室溫下 可保存數(shù)月。9%苯酚溶液：取3mL 90 %苯酚溶液，加蒸儲水至30mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。（3）濃硫酸（比重1.84）。1%蔗糖標準液：將分析純蔗糖在 80c下烘至恒重，精確稱取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸儲水定容至刻度。100ug/L蔗糖標準液：精確吸取1 %蔗糖標準液1mL加入100mL容量瓶 中，加水定容。【實驗步驟】.標準曲線的制作： 取20mL刻度試管11支，從010分別編號，按表27 1加入溶液和水，然后按順序向試管內(nèi)加入 1mL 9 %苯酚溶液，搖勻，再從管 液正面以5 20s。加入5 mL濃硫酸，搖勻。比色

3、液總體積為8 mL ,在恒溫下 放置30min。顯色。然后以空白為參比，在 485nm波長下比色測定，以糖含量 為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線，求出標準直線方程。.可溶性糖的提取 取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取 0.10 - 0.30g,共3份，分別放入3支刻度試管中，加入5-10mL蒸儲水，塑料薄膜封 口，于沸水中提取30min （提取2次），提取液過濾入25mL容量瓶中，反復沖 洗試管及殘渣，定容至刻度。.測定吸取0.5mL樣品液于試管中（重復2次），加蒸儲水1.5mL,同制作標 準曲線的步驟，按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液，顯色并測定光密度。由標準 線性方程求出糖的

4、量，按下式計算測試樣品中糖含量。式中：C 一標準方程求得糖量（ug）a吸取樣品液體積（mL）V 提取液量（mL）n 一稀釋倍數(shù)W一組織重量（g）可溶性糖含量（）=從標準曲線查得糖的量（g） x提取液體積（ml） x稀釋倍數(shù)/測定用樣品液的體積（ml） x樣品重量（g） x 106 x 100粗多糖的檢驗方法1、方法原理粗多糖在硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測定樣品在粗多糖含量。2、主要設備和儀器設備721型分光光度計（上海第三分析儀器廠）試齊I葡萄糖標準液：精確稱取105c干燥恒重的標準葡萄糖0.1000g,置100mL容量瓶中加熱蒸儲

5、水溶解稀釋至刻度，其濃度為1.0mg/mL,用稀釋成濃度為0.1mg/mLd的標準工作液。5嘛酚溶液：取苯酚100g,沙浴蒸儲，收集180C-182 c溜分，稱取此儲分5g,用水溶解后，定 容至100mL棕色容量瓶中備用（現(xiàn)用現(xiàn)配）。3、測定步驟最大吸收波長的選擇精密吸取0.04mg/mL無水葡萄糖溶1.0 mL ,置10mL具塞試管中，加入蒸儲水使體積為 2.0mL,再 加苯酚試液1.0mL,搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL,搖勻后放置5min,置沸水浴中加熱15min,取 出后冷卻至室溫。以蒸儲水代替糖溶液如加上法配制空白。用721分光光度計在470-510nm測定吸 光度，測定最大吸收波長

6、為490nm.標準曲線的繪制精密吸收濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標準標準工作液 0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL,分別置于10mL具塞試管中，各加蒸儲水使體積為 2.0mL,再加苯酚試液1.0mL,搖勻，迅速滴加濃硫酸 5.0 mL搖勻后放置5min,置沸水浴中加熱15min,取出后冷卻至室溫。以蒸儲水代替糖溶液如上 法配制空白。用721分光光度計，1cm比色皿，在490nm處測定吸光度，繪制葡萄糖濃度-吸光度 工作曲線。結(jié)果濃度在0.010-0.04mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)性關(guān)系。回歸方程 Y=7.52X10-3X+1.13 X10-3, Y=0.9997(n=

7、6)。含量測定多糖的提取與精制 取300mL用氟仿多次萃取，以除去蛋白質(zhì)，加活性炭1%兌色，抽濾，濾液加入95濃醇，使含醇量達80%靜置過夜。過濾，殘渣用無水乙醇、丙酮、乙醍多次洗滌， 真空干燥，即得粗多糖。供試液的配制 精密稱取粗多糖粉末0.2000g,置于50mL容量瓶中，定容，搖勻，即得供試 品溶液。樣品含量測定精密度吸取供試品溶液2.0mL,按“標準曲線繪制”項下方法分別測定吸光 度。結(jié)果計算：多糖含量(衿=(C- D) /VX100式中：C供試液葡萄糖濃度(mg/mL ;D-代試液的稀釋因素；V供試液體積(mL。粗多糖測定方法的研究摘要:應用硫酸-苯酚比色法測食品中的粗多糖的含量而且

8、分別用葡萄糖做標準 品和用葡聚糖做標準品。結(jié)果表明前者測的結(jié)果稍偏高 ，大約高于4.8 %。此方 法簡便快捷，準確度高，重現(xiàn)性好，可適用于各種粗多糖的測定。關(guān)健詞：枸杞多糖；靈芝多糖；分光光度法；由十個以上單糖通過糖昔鍵連接而成的碳水化合物稱為“多糖”。它一般都是天然高分子化合物。多糖包括活性多糖和膳食纖維兩大類。 活性多糖專指具有某種 特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和殼聚糖等。這些多糖具有 復雜的、多方面的生理活性和功能，如：免疫調(diào)節(jié)功能；抗月中瘤作用；延緩衰老 作用；降血脂、抗血栓作用等功能1-2,因而越來越引起人們的關(guān)注。多糖的測定方法目前還沒有國家規(guī)定的方法，文獻報道的

9、方法基本上是苯酚-硫 酸法和慈酮-硫酸法，在作標準曲線大部分都是用葡萄糖來做標準品，而不是用 葡聚糖(MW500 000),因為葡聚糖標準品在國內(nèi)難于獲得且價格昂貴。但是根 據(jù)國內(nèi)外大量研究資料表明：香菇、金針菇、云芝、冬草、夏草、靈芝、扶苓、 豬苓中所含的具有增強免疫、抑制月中瘤、鎮(zhèn)靜、強心、消炎等生理活性的水溶性 多糖均由6(13)或6(16)糖昔鍵連接葡聚糖構(gòu)成主鏈和支鏈，有的甚至就 是B-葡聚糖，那么用葡萄糖作標準品和用葡聚糖作標準品去測食品中的多糖含 量時是否有差別且差別為多少，本文以枸杞多糖和靈芝多糖來進行上述實驗。.材料與方法供試材料枸杞多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含

10、量在40-60 %,其含量由國家 檢測部門檢測)；靈芝多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60 %,其含量由國家 檢測部門檢測)；葡聚糖(MW500 000) sigma 公司；試齊1J(1)銅儲備液：稱取0.3gCuS045H2O,3g寧檬酸鈉，力口水溶解并稀釋至100ml,混勻，備用。(2)銅試劑溶液：取銅儲備液50ml,加水50ml,混勻后加入固體無水硫酸鈉12.5g并使其溶解。 臨用新配。(3)洗滌劑：取水50ml,加入10ml銅試劑溶液，10ml氫氧化鈉溶液，混勻。(4)乙醇溶液(80 %): 20ml水中加入無水乙醇80ml,混勻。(5)氫氧化鈉溶液(10 %):稱

11、取lOg氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至100ml,加入固體無水硫酸鈉至飽和，備用。(6)硫酸溶液：取10ml濃硫酸加入到80ml左右水中，混勻，冷卻后稀釋至 100ml。(7)苯酚溶液(5%):取苯酚100g,油浴蒸儲，收集180c -182C微分。稱取精制苯酚5.0g,加入溶 解并稀釋至100ml,混勻，溶液置冰箱中可保存一個月。(8)葡萄糖/葡聚糖標準儲備溶液：精密稱取在1050c于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖標準品1.0080g,加水溶解，并 定容至100ml,混勻，置冰箱中保存。此溶液每 ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。(9)葡萄糖/葡聚糖標準使用溶液：吸取葡萄糖/葡聚糖標準儲備溶液2.

12、00ml,置于100ml容量瓶中，加水至刻度， 混勻，置冰箱中保存。儀器752C紫外分光光度計離心機旋轉(zhuǎn)混勻器實驗方法葡萄糖標準曲線制備精密吸取葡萄糖標準使用溶液 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,(相當于葡萄糖0, 0.04032 , 0.08064 , 0.12096 , 0.16128 , 0.2016mg)分別置于 25ml 比色管中， 準確補充水至2.0ml ,加入苯酚溶液2.0ml ,在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃 硫酸10ml,于旋轉(zhuǎn)混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min,冷卻后用分光光度 計在490nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。

13、具體結(jié)果 見表1。表1葡萄糖標準與濃度的關(guān)系 標準液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0濃度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10吸光度(A) 0 0.166 0.343 0.514 0.690 0.882以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪標準曲線(圖 1) 0圖1標準回歸曲線方程圖其回歸方程 Y=4.4122X-0.0147,相關(guān)系數(shù)r=0.9996。葡聚糖標準曲線制備精密吸取葡聚糖標準使用溶液 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,(相當于葡聚糖0, 0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mg)分別置于25ml

14、比色管中，準確補充水至2.0ml , 加入苯酚溶液2.0ml,在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10ml,于旋轉(zhuǎn)混勻 器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min,冷卻后用分光光度計在485nm波長處以試2。劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。具體結(jié)果見表表2葡聚糖標準與濃度的關(guān)系標準液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0濃度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1吸光度(A) 0 0.083 0.171 0.256 0.352 0.456以葡聚糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線(見圖2) 圖2標準回歸曲線方程圖其回歸方程 Y=4.635X

15、-0.0145,相關(guān)系數(shù)r=0.9983。樣品的測定樣品提取稱取混合均勻的含粗多糖樣品(M)2.0g,置于100ml(V1)容量瓶中，加水80ml左右, 于沸水浴上加熱2h,冷卻至室溫后補加水至刻度，混勻，過濾，濾液供沉淀多糖。沉淀粗多糖精密取1.5.1項下濾液4.0ml(V2)(作四組平行實驗)或液體樣品(V2)4.0ml(即被 測多糖就是液體而不是固體樣品)置于50ml離心管中，加入無水乙醇16ml,混勻 后，以4000rpm離心15min,棄去上清液。沉淀用乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄 去上清液，反復3-4次操作。接下來沉淀用水溶解并定容至5.0ml(V3),混勻后，供沉淀葡聚糖。沉淀葡

16、聚糖精密取1.5.2項溶液2ml(V4)置于20ml離心管中，加入NaOH7取2.0ml,銅試劑 溶液2.0ml,沸水浴中煮沸3min,冷卻后以4000rpm離心15min,棄去上清液。沉 淀用洗滌劑數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復3次操作后，沉淀用硫酸溶液 2.0ml溶解并轉(zhuǎn)移至50ml(V5)容量瓶中，加水稀薄至刻度，混勻。此溶液為樣品 測定液。測定精密取1.5.3項的樣品測定液2.0ml(V6)置于25ml比色管中，加入苯酚溶液 2.0ml,在旋轉(zhuǎn)混合器上混勻后，小心加入濃硫酸10.0ml后于旋轉(zhuǎn)混合器上混勻 后，置于水浴中煮沸10min,冷卻至室溫用分光光度計在 490nm波長處，以

17、試劑空 白為參比，1cm比色皿測定吸光度值，同時做樣品空白實驗。從葡萄糖/葡聚糖標準曲線上查出葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量，再計算樣品中粗多糖含量(見表3)。表3.以葡萄糖計和以葡聚糖計來確定粗多糖含量編號 吸光度樣品中枸杞多糖含量（mg/g）樣品中靈芝多糖含量（mg/g）枸杞多糖靈芝多糖以葡萄糖計以葡聚糖計以葡萄糖計以葡聚糖計1 0.150 0.146 0.4532 0.145 0.148 0.4403 0.139 0.142 0.4234 0.150 0.151 0.453 TOC o 1-5 h z 0.4310.4230.4030.4170.4290.4080.4020.4130.3940.43

18、10.4370.4162.計算公式X=（W1W2）X V1X W3 W5/MK V2X V4X V6式中：X 樣品中粗多糖含量（以葡萄糖/葡聚糖計）,mg/gW1-樣品測定液中葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量，mgW2-樣品空白液中葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量，mgM樣品質(zhì)量，gV1-樣品提取液總體積,mlV2-沉淀粗多糖所用樣品提取液體積，mlV3-粗多糖溶液體積，mlV4-沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積，mlV5-樣品測定液總體積,mlV6-測定用樣品測定溶液體積，ml.穩(wěn)定性試驗樣品顯色后，每隔一定時間測定吸光度，結(jié)果見表4。表4吸光度穩(wěn)定性試驗時間 10min 20min 30min 1h 1.5h 2hA 0

19、.150 0.151 0.148 0.151 0.150 0.147結(jié)果表明，該顯色反應穩(wěn)定。.回收率測定（采用加樣回收法）吸取多糖樣品溶液0.5ml ,分別加入標準葡萄糖溶液 0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml,分別置于25ml試管中，各加水1ml,加入苯酚溶液2ml,緩緩加濃硫酸10ml于旋轉(zhuǎn)混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min,冷卻后用分光光度計在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。結(jié)果顯示回收率是 93.15-99.7 %。.小結(jié)(1)由表3可知，用葡萄糖來做標準品和用葡聚糖做標準品測食品中的粗多糖含 量時，前者測的結(jié)果稍偏高，大約高4.8

20、%，但葡聚糖標準品的價格昂貴且在國內(nèi) 難于買到，故可以用葡萄糖來代替葡聚糖做標準品。(2)食品中分子量10000的高分子物質(zhì)在80%乙醇溶液中沉淀，與水溶性單糖和 低聚糖分離，用堿性二價銅試劑選擇性的從其它高分子物質(zhì)中沉淀具有葡聚糖結(jié) 構(gòu)的多糖，粗多糖在硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物， 與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測定樣品在粗多糖含量。(3)此方法可很好的用于食品中粗多糖含量的測定，因為不需要對多糖進行純化 和脫色處理。洗滌粗多糖沉淀時，一定要將離心管壁上玷污的其它糖分和碳水化合物用 80%乙醇洗凈，否則結(jié)果會受影響。參考文獻：1方積年，多糖的研究現(xiàn)狀，藥學學報，1

21、986, 21 (12) : 944-9492劉美琴，靈芝多糖的研究進展，微生物學通報， 1998, 25 (3) : 173STUDY ON CONTENT DETERMINATION OF CRUDE POLYSACCHARIDEHu Juwu, Fan Qingsheng xiao xiaonian(Sino-Germen Joint Research Institute,The key Laboratory of Food Science of MOE, Nanchang University , Nanchang 330047 )Abstract:The content of cru

22、de Polysaccharides were determinated by themeansof UV spectrophotometry and using the criterion of Glucose and the criterion of dextran,respectively.The result is showed: the former sresult is higher than the la tter s and the method is simple,rapid .accurate and reproducible and can be used to many

23、 Polysaccharides.Key words:Ganoderma Lucidum Polysaccharide ; Lycium Barbarum Polysaccharide ； UV spectrophotometry ；粗多糖的測定方法.原理分子量大于 10, 000道爾頓的多糖經(jīng)80%乙醇沉淀后，加入堿性銅試劑，選擇性地從其他高分子物質(zhì)中沉淀出葡聚糖，沉淀部分與苯酚-H2SO4反應，生成有色物質(zhì)，在485nm條件下，有色物質(zhì)的吸光度值與葡聚糖濃度成正比。.適用范圍參照AOAC方法。適用于檢測含有分子量大于10, 000道爾頓葡聚糖的樣品。.儀器分光光度計離心機旋轉(zhuǎn)混勻器恒溫水浴

24、鍋4.試齊IJ除特殊說明外，實驗用水為蒸儲水，試劑為分析純。80%乙醇：800ml無水乙醇加水 200ml。2.5 mol/L NaOH 溶液：100 g NaOH加蒸儲水稀釋至1 L ,加入固體無水硫酸鈉至飽和。銅貯存液：稱取 3.0 g CuSO4 5H2O , 30.0 g檸檬酸鈉加水溶解至1 L。溶液可貯存 2周。(4)銅應用溶液： 取銅貯存液 50 ml ,加水50 ml混勻后加入無水硫酸鈉12.5 g ,臨用新配。洗滌液：取水 50 ml ,加入10 ml銅應用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH 溶液， 混勻。1.8 mol/L H2SO4 :取100ml濃硫酸用水稀釋

25、至1L。20 g/L苯酚溶液：稱取 2.0g苯酚，加水溶解并稀釋至100ml ,混勻備用。(8)葡聚糖標準液：稱取 500mg葡聚糖(分子量 500,000D )于稱量皿中，105 c 干燥4h至恒重，置于裝有干燥硅膠的干燥器中冷卻。準確稱取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml ,葡聚糖標準濃度為1.0mg/ml。(9)葡聚糖標準應用液：吸取葡聚糖標準液10ml,用水稀釋 10倍，葡聚糖終濃度為0.1mg/ml。.操作方法樣品處理樣品提取：稱取樣品15g,加水100ml ,沸水浴加熱 2h,冷卻至室溫，定容至200ml (V1),混勻后過濾，棄初濾液，收集余下濾液。沉淀高分子物質(zhì)：準確吸取上述濾液100ml ( V2 ),置于燒杯中，加熱濃縮至10ml ,冷卻后，加入無水乙醇 40ml ,將溶液轉(zhuǎn)至離心管中以3000rpm 離心5min ,棄上清液，殘渣用 80%乙醇洗滌3次，殘渣供沉淀葡聚糖之用。沉淀葡聚糖：上述殘渣用水溶解，并定容至50ml (V3),混勻后過濾，棄初始濾液后，取濾液2.0ml (V4),加入 2.5mol/L NaOH2.0ml , Cu應用溶液 2.0ml,沸水浴中煮沸 2mim ,冷卻后以 3000rpm離心5min ,棄上清液，殘渣用洗滌液洗滌3次，殘渣供測定葡聚糖之用。測定葡聚糖：上述殘渣用 2.0mL 1.8mol/LH2SO4