藥物含量測定方法和驗證

1、關于藥物的含量測定方法與驗證第一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月基本要求 一、掌握定量分析方法驗證的效能指標。 二、熟悉定量分析樣品的前處理方法。 三、了解定量分析樣品的前處理方法的 進展及在藥物分析中的應用。第二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月含量測定： 藥物的含量測定系指運用化學、物理化學或生物學的方法測定藥物中主要有效成分的含量。第三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 容量分析法（一）容量分析法的特點： 常用于測定高含量或中含量組分，原料藥含量測定首選 比較準確（相對誤差0.2%）； 操作簡單、快速；儀器普通易得；第四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022

2、年6月（二）有關計算 1.滴定度（T）： 每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當于被測物質的質量(mg) 2.滴定度的計算 aA（待測物） + bB（滴定液） cC + dD a b T/M 1m T = ma/bMm：滴定液濃度 (mol/L)M：被測物分子量第五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月3.百分含量的計算 （1）直接滴定法設至終點時，消耗滴定液體積為V ml則藥物實測質量為VT濃度校正因子W：供試品取樣量 第六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法） 藥物 + A（定、過量） 剩余的 A + B （回滴）V 空白試驗V0第七張，PPT共五十七頁

3、，創(chuàng)作于2022年6月光譜光譜分析法分光光度法分類 紫外-可見分光光度法 紅外分光光度法 原子吸收分光光度法 熒光分光光度法 火焰光度法第二節(jié) 分光光度法第八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、光譜分析法 （一）紫外-可見分光光度法 吸收光譜范圍：紫外：200400nm 可見：400760nm 靈敏度高，可達10-4g/ml -10-7g/ml 1. 特點 準確度高，RSD（%）為2% -5% 儀器價格低廉，操作簡單，易普及，應用廣范 2. 朗伯-比耳定律 A = ECL 吸收系數(shù)： 摩爾吸收系數(shù) 研究分子結構 百分吸收系數(shù) 含量測定第九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月3

4、.儀器的校正和檢定 波長的校正：汞燈中的幾根較強的譜線或用儀器自身 所帶的氘燈的特定譜線為參照進行校正 吸收度準確性的檢定：重鉻酸鉀的硫酸溶液，規(guī)定波 長處測定，應符合規(guī)定 雜散光的檢查：一定濃度的碘化鈉和亞硝酸鈉溶液， 規(guī)定波長處測定透光率，應符合規(guī)定第十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 4. 對溶劑的要求: 含雜原子的有機溶劑通常具有很強的末端吸收 它們的使用范圍均不能小于截止使用波長 石英吸收池、空氣為空白 (nm) 溶劑+吸收池A 220240 0.40 241250 0.20 251300 0.10 300以上 0.05第十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月5.

5、測定方法 要求供試品溶液的A應在0.3 0.7 1）對照品比較法：A供A對C供C對原料藥：制劑：第十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2）吸收系數(shù)法：注意： 應100 應注意儀器的校正和檢定： 作為計算濃度的因數(shù)進行定量的方法，不是任何情況下都適用的，特別時單色光不純的情況下，A會隨儀器不同而變化，誤差較大 但若認定一臺儀器，固定其工作狀態(tài)和測定條件，則C和A間的關系在多數(shù)情況下仍符合LambertBeer定律 第十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月3）計算分光光度法： 方法有多種，具體按每種藥物規(guī)定的方法進行。如：VA的三點校正法4）比色法 加入顯色劑后，按照對照品比較法

6、測定 影響顯色因素很多，故需注意平行操作 空白溶劑：溶劑+顯色劑，同法處理第十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 （二）熒光分析法 靈敏度高，可達10-10g/ml 10-12g/ml 在低濃度進行測定，防止自熄滅作用 1. 特點 用基準溶液代替對照液校正儀器靈敏度 制備熒光衍生物，可提高靈敏度和選擇性 干擾因素多，需做空白實驗 樣品用量少，操作簡單，應用范圍較廣 第十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2.含量測定 原理：當激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質在一定濃度范圍內，其熒光強度R與該物質濃度C成正比 方法：對照品比較法 計算：第十六張，PPT共五十七

7、頁，創(chuàng)作于2022年6月 第三節(jié) 色譜法 根據(jù)混合物中各組分的色譜行為差異，先行分離后再在線或離線對各組分逐一進行分析的方法，是分離分析混合物的最有力手段。 按分離原理：吸附；分配；離子交換；空間排阻 分類 按分離方法：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC 特點：高靈敏度、 高效能、高速度、應用廣泛第十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）HPLC法 1. 對儀器一般要求 固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變 其他均可適當改變 色譜圖20分鐘內記錄完畢 2. 系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱的理論板數(shù)：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分離度：R = 2（tR1 tR2)/(

8、W1 + W2); 應大于1.5 重復性：對照液連續(xù)進樣5次，峰面積RSD2.0 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 應在0.95 1.05 第十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月流動相真空脫氣機四元泵自動進樣器柱溫箱紫外檢測器蒸發(fā)光散射檢測器第十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月液質聯(lián)用儀質譜檢測器第二十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月流動相：對于以C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，常用甲醇-水，間或加以乙腈、緩沖液等為流動相，有機溶劑比例通常不低于5第二十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月四元泵第二十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月自動進

9、樣器第二十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱填充劑常用：十八烷基硅烷鍵合硅膠第二十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月檢測器第二十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月測定方法1)內標法加校正因子測定供試品中主成分含量峰面積 含量對照液（R）： AR CR 內標液（S）： AS CS供試液（X）： AX CXf= AS/CSAR /CRf= AS / CSAx /CxCx=f AxAS / CS第二十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2)外標法測定供試品中主成分含量對照液（R）： AR CR 供試液（X）： AX CX 要求：進樣量準確、操作條件穩(wěn)定CX

10、 CRAX ARCXCR AXAR第二十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 （二）GC法1. 對GC儀器一般要求 載 氣：氮氣 色譜柱：填充柱或毛細管柱 填充柱：內徑24mm，長110m，內裝吸附劑 高分子多孔小球或涂漬固定液的載體 毛細管柱：內徑0.20.5mm，長10100m，一般為空 心柱，內壁或載體經涂漬或交聯(lián)固定液檢測器：氫火焰離子化檢測器色譜圖：30分鐘內記錄完畢 2. 色譜適用性實驗：同HPLC 3. 測定法：同HPLC第二十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 第四節(jié) 藥品分析方法驗證 目的：證明采用的方法適合于相應檢測要求。 起草藥品質量標準 生產工藝變更

11、制劑組分改變 原分析方法修訂驗證內容：準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性均需對分析方法進行驗證第二十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月一、準確度（accuracy）：測量值與真實值接近的程度表 示: 回收率測定方法： 回收試驗 加樣回收試驗第三十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月含量測定方法的準確度 1. 原料藥：可用已知純度對照品或供試品進行測定；或與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較 2. 制劑：考察其他組分和輔料對回收率的影響 用含已知量被測物的制劑各組分混合物（包括制劑輔料）進行測定，回收率計算同原料藥 向制劑中加入已知量的被測物進行測定

12、與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較具體做法： 測定高、中、低三個濃度，n=3, 共9個數(shù)據(jù)來評價回收率；用UV和HPLC法時，一般回收率可達98%102%；容量法可達99.7%100.3%第三十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月二、精密度（precision ）：定 義: 同一樣品多次測量值之間相互接近的程度表 示：偏差，標準偏差,相對標準偏差 1. 偏差(deviation ,d) d = 測得值-平均值=Xi-X2. 標準偏差（standard deviation,SD或S） S =(Xi X)2/(n-1)1/23. 相對標準偏差(relative standard de

13、viation,RSD) RSD=標準偏差/平均值100%=S/X 100% 第三十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月重復性: 同一實驗室,同一人多次測定的精密度中間精密度: 同一實驗室，不同人，不同儀器測定的精密度重現(xiàn)性: 不同實驗室，不同人測定的精密度數(shù)據(jù)要求 均應報告標準偏差、相對標準偏差和可信限第三十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月三、專屬性（specificity）: 指在其他成分(如雜質、降解產物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準確測定出被測物的特性 （鑒別、雜質檢查、含量測定方法，均應考察其專屬性） 1.鑒別反應 應能與其它共存的物質或相似化合物區(qū)分，不含

14、被測組分的樣品均應呈現(xiàn)負反應第三十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.含量測定和雜質測定 色譜法和其他分離法，應附代表性的圖譜，以說明專屬性。 圖中注明各組分位置，色譜法中分離度應符合要求。 在能獲得雜質的情況下，可加到試樣中，考察對結果的干擾。 在雜質和降解物不能獲得的情況下，可用以驗證方法和藥典方法進行對照；也可用對試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。第三十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、檢測限（ limit of detection， LOD) 是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗指標。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。1.

15、目視法 用含已知濃度被測物的試樣進行分析，目視確定能被可靠地檢測出的被測物的最低濃度或量，常用于顯色鑒別法，TLC 2.當用GC和HPLC法時，一般以S/N2或3時的相應濃度來確定檢測限。第三十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 五、定量限（ 1imit of quantitation， LOQ) 是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應具一定準確度和精密度。 雜質和降解產物進行定量測定時，要求LOQ。 常用信噪比法確定定量限。 一般以S/N=10時相應的濃度進行測定。第三十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 六、線性（linearity ） 是指在設計的范圍內，

16、測試結果與試樣中被測物濃度或量直接呈正比關系的程度。 回歸方程的相關系數(shù)（r）越接近1，表明線性越好 可用一貯備液經精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列（至少5份）供試液進行測定，以響應值對濃度作圖，建立回歸方程，求出r 如UV：制備一個標準系列，濃度點n =5 A=0.3-0.7 建立回歸方程C = aA + b r 0.9999第三十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月CA500.22750.351000.451250.581500.69AC線性的偏離第三十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月七、范圍 （range） 是指達到一定精密度、準確度和線性、測試方法適用的高低限度

17、或量的區(qū)間。 如原料藥和制劑含量測定：應為測試濃度的80%120% 制劑含量均勻度檢查：應為測試濃度的70%- 130%。 溶出度或釋放度中的溶出量測定：應為限度的20%。第四十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 八、耐用性（robustness） 是指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。典型的變動因素有： 被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時間等。HPLC變動因素有： 流動相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。GC變動因素有： 色譜柱，固定相，擔體、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。 第四十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月檢驗項目和驗證內容：項目內容鑒別雜質測定含量

18、測定及溶出量測定定量限度準確度精密度重復性中間精密度 專屬性檢測限 定量限線性范圍耐用性 已有重現(xiàn)性驗證，不需驗證中間精密度 如一種方法不夠專屬，可用其他分析方法予以補充 視具體情況予以驗證第四十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 第五節(jié) 定量分析樣品的前處理方法 一、概述 1.結構特征與分析方法之間的關系 含鹵素有機藥物 R-X （F，Cl, Br, I ） 鹵素與芳環(huán)相連 Ar-X 結合牢固 鹵素與脂肪鏈相連 R-X 結合較不牢固 含金屬有機藥物 含金屬有機藥物 R-O-Me，有機酸或酚的金屬鹽/配位化合物； 結合不牢固，可直接測定 有機金屬藥物 R-Me ，結合牢固，適當處理后

19、測定 第四十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 不經有機破壞的分析方法2. 藥物分析中常用的分析方法 經有機破壞的分析方法第四十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月二、不經有機破壞的分析方法（一）直接測定法 例如：富馬酸亞鐵的含量測定 終點： 鄰二氮菲(+Fe3+)溶于熱稀礦酸指示劑:鄰二氮菲(+Fe2+)紅色淡藍色Fe3+Fe2+Ce4+第四十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）經水解后測定法 1. 堿水解后測定法 適用于X與脂肪鏈相連的鹵代烷烴 例如：三氯叔丁醇的含量測定 CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + H

20、COONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 2. 酸水解后測定法 例如：硬脂酸鎂的含量測定 Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O 三氯叔丁醇第四十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）經還原分解后測定法 適用于Ar-I的藥物 例如：泛影酸的含量測定指示劑：曙紅鈉終點：黃紅第四十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、經有機破壞的分析方法 金屬原子、鹵素等與C結合牢固者，必須有機破壞 常用的有機破壞的方法有濕法破壞干法破壞第四十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）干法破壞 適用于含鹵素、S、P等有機藥物分析的前處理，也用于某些藥物中硒及砷鹽的檢查。 1. 高溫熾灼法 加無水Na2CO3、硝酸鎂、氫氧化鈣或ZnO以助灰化2.氧瓶燃燒法第四十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 1） 儀器裝置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬質 玻璃錐形瓶 2）稱樣 固體樣；液體樣要求