RNA干擾技術(shù)與siRNA藥物

1、RNA干擾技術(shù)與siRNADORNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指內(nèi)源性或外源性短鏈RNA誘導(dǎo)同源mRNA降解，導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象。RNAi被認(rèn)為是目前國際上最具潛力的一種基因治療方法。從理論上講，幾乎所有涉及基因異常高表達(dá)的人類疾病都有可能設(shè)計出相應(yīng)的siRNA來沉默疾病相關(guān)基因，從而達(dá)到治療目的。2001年和2002年，RNAi技術(shù)連續(xù)兩次被Science雜志評為當(dāng)年十大科學(xué)成就之一，安德魯法爾和克雷格梅洛兩位科學(xué)家因在RNA干擾領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)獲得2006年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。RNAi介導(dǎo)的特定基因沉默的有關(guān)機(jī)制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，故稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。

2、在起始階段，外源性短雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入細(xì)胞被一種稱為Dicer的酶識別，該酶可將dsRNA切成長度為2123nt(核苷酸)的小片段RNA，即小干擾RNA(siRNA)。在效應(yīng)階段，siRNA結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC在ATP供能的情況下將攜帶的siRNA解螺旋而激活。激活的RISC通過堿基互補(bǔ)配對與同源mRNA結(jié)合，并在距離siRNA5端10-11bp的位置切割mRNA。斷裂的RNA小分子在核酸酶的作用下被降解，從而導(dǎo)致特定基因的沉默。ODicer5dsRNAshRNAsiRNAdupl

3、exFormationofRISCsiRNA/mRNA-complexslicedmRNA(SILENCINGn研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中導(dǎo)入dsRNA會引起嚴(yán)重siRNA轉(zhuǎn)siRNA的的細(xì)胞毒性反應(yīng)，但利用人工合成的21nt雙鏈siRNA可成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人胚腎293細(xì)胞和Hela細(xì)胞。隨后，在體外培養(yǎng)的鼠源、靈長類及人源細(xì)胞中均證實存在siRNA啟動的RNAi效應(yīng)，并且siRNA可以啟動較dsRNA更高效的基因沉默現(xiàn)象；表明siRNA可能是直接啟動RNAi的結(jié)構(gòu)單元，目前藥物開發(fā)也主要是針對siRNA的研究。由于RNAi技術(shù)可用于特異性降低或沉默某些致病基因的表達(dá)，因此RNAi類藥物在人類疾病

4、治療中的應(yīng)用前景廣闊，發(fā)展?jié)摿薮?。RNAi藥物研發(fā)的一般技術(shù)路線是：確定目的基因，設(shè)計siRNA序列，獲得siRNA產(chǎn)物，染，RNAi效果檢測。(1)siRNA序列設(shè)計長度一般為2123nt；由于siRNA在序列上必須與靶標(biāo)基因避免選擇起始密碼子下游游lOOntO及5和3非編碼區(qū)RNAi的高特異性，mRNA序列完全一致；50100nt、終止密碼子上(UTR)的序列；siRNA序列設(shè)計一般遵循以下原則：和炎性因子(TNFa、IL6等)的產(chǎn)生。siRNA通過細(xì)等方法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在siRNA5端必須磷酸化，3端最好懸掛2個dTdT；對siRNA適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾可增加其在

5、體內(nèi)的穩(wěn)定性。如磷酸骨架修飾、核糖修飾、堿基修飾等。(2)siRNA的給藥途徑局部給藥：:目前用于局部給藥的有：玻璃體內(nèi)注射給藥治療眼??；鼻內(nèi)給藥治療呼吸道合胞病毒(RSV)；瘤內(nèi)注射針對實體瘤；肌內(nèi)注射治療肌肉組織疾病等。局部給藥藥物可直接作用于靶器官，降低siRNA被核酸酶降解的概率，并可減少siRNA的藥物和炎性因子(TNFa、IL6等)的產(chǎn)生。siRNA通過細(xì)等方法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在和炎性因子(TNFa、IL6等)的產(chǎn)生。siRNA通過細(xì)等方法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在使用劑量。全身給藥：全身給藥主要采用口服、皮內(nèi)或靜脈注射。全身給藥可用于治

6、療全身性疾病，但需要較多的siRNA以使靶器官或靶組織獲得有效的藥物濃度。同時，siRNA需要有較高的靶向性和穩(wěn)定性，能有效地被靶細(xì)胞吸收而不被破壞。近年研究采用對siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾、納米顆粒包埋等方法有效避免siRNA在體內(nèi)的降解，促進(jìn)細(xì)胞對siRNA的攝取。同時，使用抗體Fab片段或配體與siRNA結(jié)合以及病毒載體體內(nèi)的利用率。全身給藥已成為當(dāng)前siRNA藥物主要的給藥途徑。(3)siRNA安全問題及解決方法1)脫靶效應(yīng)(off-target)：是指由siRNA通過RNAi機(jī)制作用于非靶mRNA導(dǎo)致的非靶基因沉默現(xiàn)象。一般來說RNAi對靶基因的沉默是高度特異性的，但近來研究發(fā)現(xiàn)，合成的

7、siRNA分子在哺乳動物體內(nèi)亦會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。siRNA可產(chǎn)生兩類“脫靶”效應(yīng)，一類由siRNA進(jìn)入miRNA通路引起的，siRNA可發(fā)揮miRNA功能,和炎性因子(TNFa、IL6等)的產(chǎn)生。siRNA通過細(xì)等方法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在和炎性因子(TNFa、IL6等)的產(chǎn)生。siRNA通過細(xì)等方法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在通過部分匹配，尤其種子區(qū)匹配使許多基因表達(dá)量下降，引起脫靶效應(yīng)，這種脫靶效應(yīng)會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。RISC復(fù)合物，正義鏈進(jìn)入RISCO另一類脫靶效應(yīng)是由于發(fā)揮RNAi作用時，siRNA正義在藥物研發(fā)中顯得非常關(guān)鍵。2)免疫反應(yīng)：人為引入的夠

8、激活天然免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)干擾素siRNA在哺乳動物體內(nèi)能(IFN-a、IFN-b)起非靶基因沉默，導(dǎo)致脫靶效應(yīng)。實驗證明，優(yōu)化siRNA設(shè)計可消除“脫靶”效應(yīng)，這使得siRNA設(shè)計鏈和反義鏈競爭進(jìn)入義鏈進(jìn)入RISC引起的脫靶效應(yīng)，例如，siRNA雙鏈等方法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在胞內(nèi)吞作用進(jìn)入內(nèi)涵體而被TLRs識別，存在于內(nèi)涵體的TLR-7和TLR-8可識別含有免疫刺激序列模體的單鏈RNA,存在于細(xì)胞膜和內(nèi)涵體的TLR-3可識別含有免疫刺激序列的dsRNA。此外，大于30bp的dsRNA可直接激活PKR、RIGI和TLRs進(jìn)一步激活NF-kB、MAPK、IRF等從而刺激IFN

9、和炎性因子的分泌。IFN通路激活后可引起非特異性的翻譯抑制，阻止蛋白合成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?；罨腜KR也可通過使eIF-2a磷酸化而導(dǎo)致普遍的蛋白合成抑制和細(xì)胞程序性死亡。此外，在IFN的誘導(dǎo)下，dsRNA可激活25-OAS，從而進(jìn)一步激活RNA酶L通路，最終引起細(xì)胞內(nèi)mRNA的非特異性降解。不過，通過對siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾能逃避機(jī)體免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。3）解決方法：化學(xué)修飾siRNA可有效避免“脫靶”效應(yīng)和降低免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，反義鏈5端2O-甲氧化修飾，可避免miRNA同源引起的脫靶效應(yīng)；鎖核酸（LNA）化學(xué)修飾siRNA，正義鏈5端甲基化，或在正義鏈3端插入8個DNA核苷酸，可以避免正等方

10、法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在被2-O-甲氧基核苷、2-F(氟代)-核苷和DNA修飾后就沒有檢測到影響干擾素水平和細(xì)胞因子，而對應(yīng)的未修飾siRNA則明顯的發(fā)生免疫激活反應(yīng)。另外，被驗證刺激免疫系統(tǒng)的siRNA的正義鏈末端經(jīng)鎖核酸修飾后，可以消除該siRNA的IFNP免疫刺激活性。(4)siRNA藥物的進(jìn)展以AlnylamPharmaceuticals、TransDerm、PTCTherapeutics、CalandoPharmaceuticals、QuarK、SilenceTherapeutics等公司為代表的一批生物科技公司已經(jīng)開發(fā)了近二十個siRNA藥物進(jìn)入臨床試驗，其中

11、抗腫瘤藥物就有五個，而且采用全身給藥。如PTCTherapeutics公司治療實體腫瘤的RNAi藥物PTC299是通過口服給藥，作用靶點為腫瘤細(xì)胞VEGF，2009年7月進(jìn)入臨床II期試驗，預(yù)計今年完成此階段試驗。CalandoPharmaceuticals公司的CALAAO1則通過靜脈注射給藥，siRNA包被在環(huán)糊精-人轉(zhuǎn)鐵蛋白-AD-PEG納米顆粒中，防止被核酸酶降解。包被上的人轉(zhuǎn)鐵蛋白可以靶向的與膜表面上高表達(dá)人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的癌細(xì)胞結(jié)合，并通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入癌細(xì)胞，干擾靶基因的核糖核酸還原酶亞基，通過降低核糖核酸還原酶抑制腫瘤生長和縮小腫瘤體積的作用。還有如VSP02、TKM08031都是治療肝癌的向驅(qū)動蛋白樣紡錘體蛋白質(zhì)M2M2亞基的表達(dá)，達(dá)到ALN-RNAi藥物，分別靶(kinesin-likespindleprotein,KSP)和PLK1,均已進(jìn)入臨床試驗。鑒于siRNA藥物的迅猛發(fā)展，眾多國際醫(yī)藥巨頭也已紛紛投向這一領(lǐng)域。Merck以11億美元收購了等方法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在等方法可使siRNA特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，提高其在Sirna公司，通過收購方式與Allergan公司合作展開siRNA藥物開發(fā)。諾華和羅氏分別同Alnylam公司簽署了7億美元和10億美元的合作協(xié)議，包括其專利使用的非獨占許可協(xié)議。阿斯利康與SilenceT