HE染色和巴氏染色法

1、HE染色和巴氏染色法普通染色又稱常規(guī)染色或HE(Haematoxylinandeosin)染色。它是病理技術(shù)中最常用的一種方法，通過它可以做出病理診斷和發(fā)現(xiàn)尋求別的輔助方法，以達(dá)到準(zhǔn)確，完整的病理診斷。一、染色目的病理學(xué)的所有切片，都必須通過一種以上的染料，通過各種不同的方法，將切片中各種不同的物質(zhì)，在不同染液的作用下，將其顯示出來，使之在光學(xué)顯微鏡下，能夠完全的觀看各種結(jié)構(gòu)。例如，HE染色，好質(zhì)量的切片可以清晰地顯示出許多不同的結(jié)構(gòu),細(xì)胞核著藍(lán)黑色，細(xì)胞漿著粉紅色，軟骨著藍(lán)色等。清晰的結(jié)構(gòu)為診斷提供可靠的依據(jù)，因此，染色技術(shù)也是病理技術(shù)中的重要組成部分，必須不斷地總結(jié)，方能提高。如果染色不好

2、，切片染色一團(tuán)糟，紅藍(lán)不分，結(jié)構(gòu)不清，層次不明，影響了鏡下的觀察，直接影響了臨床診斷，染色結(jié)果的好壞直接關(guān)系到診斷的準(zhǔn)確性。二、染色的作用1化學(xué)作用：所有的染色液中，可把它們分為兩種類型，一種為酸性，另一種為堿性。酸性染料中有染色作用的為陰離子；堿性染料中有染色作用的為陽離子，每個細(xì)胞也存在著兩種物質(zhì)，細(xì)胞核含的是酸性物質(zhì)，細(xì)胞漿含的是堿性物質(zhì)。在染色時，細(xì)胞核中的酸性物質(zhì)與蘇木素染液中的陽離子發(fā)生作用，細(xì)胞漿中的堿性物質(zhì)與伊紅染液中的陰離子發(fā)生作用，由于反應(yīng)的部位不同，結(jié)果著色有異。2物理作用：在染色過程中，染液中的色素微粒子浸入到被染組織的粒子間隙內(nèi)，此時，因受分子的引力作用，色素微粒子被

3、吸附而著色。由于各種組織有不同的吸附能力和不同的吸附程度，因此就可顯出來不同的顏色來。一般來說，染色的學(xué)說還有許多，但說服力強(qiáng)的僅有上述兩種。但不管怎么樣解釋，實際上完成的每一種染色，都與上述兩種學(xué)說分不開，它們的作用是相輔相成，同時存在的。三、染色方法及步驟1人工蘇木素，伊紅染色法(HE法)(1)切片浸入二甲苯中5-10min；(2)切片浸入二甲苯中5-10min；(3)100%酒精lmin。(4)100%酒精lmin。(5)95%酒精1min。(6)95%酒精1min。(7)90%酒精1min。(8)80%酒精1min。(9)自來水洗1min。(10)浸入蘇木素染液浸染10-15min。(

4、11)自來水洗30second-1min。(12)1%鹽酸酒精分化30second。(13)流水沖洗15min以上。(14)1%伊紅酒精染3-5min。(15)90%或95%酒精分化30sec。(16)95%酒精30sec-1min。(17)95%酒精30sec-1min。(18)95%酒精30sec-1min。(19)100%酒精1min。(20)100%酒精1-2min。(21)碳酸二甲苯1min。(22)二甲苯1-2min。(23)二甲苯1-2min(24)二甲苯1-2min。(25)中性樹膠封固。結(jié)果：細(xì)胞核被染成深藍(lán)黑色；細(xì)胞漿被染成粉紅色；軟骨及鈣鹽被染成藍(lán)色；膠原纖維染成淡粉紅色

5、，嗜酸性細(xì)胞及嗜酸性顆粒呈鮮紅色；彈力纖維呈淡粉紅色；某些蛋白性物呈粉紅色等。染色時的注意事項：切片用二甲苯脫臘，應(yīng)視不同的季節(jié)有不同的脫蠟時間，在夏天，室溫較高，脫蠟較迅速，往往在2-3min就可脫蠟干凈，二在冬季，時間應(yīng)相對延長。切片在進(jìn)入二甲苯前，可用電吹風(fēng)吹切片，使切片上的蠟處于熔解狀態(tài)，這樣脫蠟較迅速，尤其是冬天，此法更可行。切片上的蠟一定要清除徹底干凈，否則將影響染色，造成切片染色不均的現(xiàn)象。切片進(jìn)行無水化處理，這一步驟，一是可增加切片的附帖，二是可延長蘇木素的使用壽命。切片用二甲苯脫蠟后，不能直接水洗，因二甲苯不溶于水，必須經(jīng)過酒精，酒精可溶解二甲苯，又能與水混合，按照以前教科書

6、的要求，切片在整個染色過程中，都不要讓其干燥。經(jīng)過多年的實踐及經(jīng)驗，筆者認(rèn)為，切片用酒精將二甲苯徹底消除后，在進(jìn)入蘇木素染液前，可用電吹風(fēng)吹干，這一步對于切片沒有充分的烤片時間，對于血塊等的切片來說，尤為重要，切片經(jīng)此步驟，增加了附貼的牢固性，減少切片在染色過程中脫離載片的機(jī)會，保證了染色的成功率。另者，切片進(jìn)入蘇木素染液全無水，可保證了蘇木素染液的濃度和PH值，延長其使用壽命。以往切片進(jìn)入蘇木素染液前，都須經(jīng)水洗，每次染色，都帶入不少的水分，稀釋了蘇木素染液的濃度，改變了它的PH值，使染液壽命縮短。切片無水化除了用電吹風(fēng)外，還可用火燒，切片用90%酒精洗后，取出切片，用火輕燒，也可達(dá)到切片的

7、無水化?；饘η衅袚p害嗎？否，經(jīng)實驗證明，切片火燒時最高溫度為80C左右，對切片沒有影響。用火燒時必須徹底清除二甲苯，因為二甲苯燃燒時可產(chǎn)生濃煙，如果存留于切片，將會影響觀察。當(dāng)然，用火時應(yīng)特別注意防火，因為病理技術(shù)室的大部分試劑都為易燃品。蘇木素染液中的最佳染色時間，確切地回答還是比較困難的，因為各種組織都有不同的染色時間，核的染色時間從30sec至15min不等。對于核的染色，為了充分地顯示各種核染色質(zhì)，一定要過染，尤其對于初學(xué)者來說，更是如此。蘇木素染液有多種，常規(guī)應(yīng)用的通常為明磯蘇木素，明磯蘇木素又有Harris蘇木素，Mayers蘇木素，和Ehrish蘇木素等。鹽酸酒精分化切片，濃度

8、有0.25%,0.5%和1%根據(jù)各人的情況而使用。這一步主要是將過染的顏色及不該染的染色去除掉，這一步要掌握得當(dāng)，必須靠經(jīng)驗，核的染色清楚與否靠分化這一招，分化過度，核染色淡，分化不足，核染色質(zhì)一團(tuán)，分不清。初學(xué)者應(yīng)于顯微鏡下控制分化程度。水洗藍(lán)化，也可用溫?zé)崴畞泶偈骨衅{(lán)化，可用氨水，碳酸鋰等化學(xué)藥品來促藍(lán)，雖然如此，自來水沖洗藍(lán)化切片是最好的，這對于切片的保存較為有利。伊紅酒精濃度有0.25%,0.5%和1%之分，根據(jù)各單位的情況而定。切片一放入伊紅染液，即可馬上著色，但是，要染好切片，必須染夠染足時間。分化伊紅須用濃度較高的酒精，以往伊紅染色以后，用低濃度的酒精分化，洗去多余的染液，實踐

9、中發(fā)現(xiàn)低濃度的酒精褪色能力特強(qiáng)，如果掌握不好，染上的伊紅，便會被褪去大部分。改用較高濃度酒精后，這種現(xiàn)象便不會出現(xiàn)。作為切片脫水劑的酒精，要經(jīng)常更換，尤其是無水酒精，更要保持其無水性。否則切片脫水不干凈，含有水份就會褪色。切片取出后，不能令其干涸，即刻進(jìn)行下一步。碳酸二甲苯，對于南方地區(qū)來說，是一種很有用的試劑，碳酸吸水性強(qiáng)，用它可加強(qiáng)脫水，它是二甲苯與酒精之間的緩沖劑，切片經(jīng)此試劑后更加透明和光亮。有人認(rèn)為碳酸為一種弱酸，切片用它后可能會褪色，這種擔(dān)心是多余的，切片褪色，最主要是切片本身含有水份所導(dǎo)致。根據(jù)我們的實驗，82年的切片經(jīng)碳酸處理后，17年來顏色仍然保持鮮艷就足以說明。二甲苯須換三

10、次，以確保切片的透明度，這對于切片的觀察和保存，都大有好處。封片時要做到：切片從二甲苯取出后，不使切片干涸。如果干涸，由于空氣潮濕，封片時就保證不了切片的無水。如果切片上保留著一定量的二甲苯，二甲苯的特性不溶于水，它的存在使切片與空氣隔開，切片無法跟潮濕空氣接觸，就可保證切片的無水，這時及時滴上中性樹膠，切片就能完好地封好。封片用的中性樹膠，不能過稠，也不能過稀，過稠膠難以伸展開，并容易產(chǎn)生氣泡，影響封片的速度。過稀是因膠中含過多的二甲苯，封完切片后，膠一收縮及二甲苯揮發(fā)，切片就不能被完全封蓋上，這都影響切片的質(zhì)量。2、臥色自動染色機(jī)染色方法及步驟自動染色機(jī)應(yīng)用于病理切片的染色是近幾年的事情，

11、目前國內(nèi)僅有少數(shù)單位擁有自動染色機(jī)，南方醫(yī)院自1997年引進(jìn)英國Shandon公司研制的VaricstainTMxy多程序全自動染色機(jī)以來，已完成活檢HE染色和脫落細(xì)胞染色。應(yīng)用該機(jī)染片的優(yōu)點(diǎn)該機(jī)全部由電腦控制，可設(shè)置20種操作程序，任意設(shè)定各種時間。有21個裝試劑的罐，其中2個為自來水沖洗罐，切片前水洗和蘇木素染色后水洗以及鹽酸分化時的水洗，都在這兩個罐中進(jìn)行。該機(jī)配有多種不同的染色架，根據(jù)工作量的不同，自行選擇，其中最大容量為6張切片。該機(jī)設(shè)置自動操作手臂，可在設(shè)置的范圍內(nèi)朝不同的方向和位置到達(dá)任何一個染色罐，朝上下活動。染色罐可多套配備，作多種染色，如組織學(xué)的HE染色，細(xì)胞學(xué)的巴氏染色等

12、。根據(jù)我們的應(yīng)用情況，現(xiàn)將我們的染色程序列表如下：自動染色機(jī)工作程序一覽表水21（6+1）10-30sec15min90%630sec95%530sec100%alc430sec100%alc330sec二甲苯23min二甲苯15min水2020sec蘇木素7伊紅890%alc995%alc1095%alc100%alc10-15min3min30sec30sec30sec30sec鹽酸酒精19二甲苯18二甲苯二甲苯16碳酸二甲苯100%alc100%alc10sec2min172min1min151min142min131min注意事項表中二甲苯的脫蠟時間，可根據(jù)季節(jié)不同，可隨意更改。由于為

13、機(jī)器操作，切片無法作無水化處理，因此切片在入水洗前要充分去二甲苯。切片入蘇木素染色前必須水洗，但在表中沒有專門供這一次水洗的罐子，在表里21號中注有（6+1）的字樣，在程序輸入時必須將其輸入，否則將沒有沖洗這一步。因為整個染色過程，需要三次水洗，而機(jī)器的固定水洗罐只有兩個，因此罐的使用可以重復(fù)使用。機(jī)器雖然在每一步中，在進(jìn)入下一罐前設(shè)有一定的時間，目的是將試劑控干后再進(jìn)入下一個缸，雖然如此，還是帶一定的試劑進(jìn)入下一缸。蘇木素要經(jīng)常觀察，發(fā)現(xiàn)染核不好，就必須馬上更換，因為水洗后的切片可帶入水份染液，可稀釋染液的濃度。蘇木素最好設(shè)置在靠近水洗缸的旁邊。如果設(shè)置在遠(yuǎn)離水缸的一邊，當(dāng)要水洗時，由于切片

14、從提藍(lán)中提起，經(jīng)長途輸送方能到達(dá)水缸，雖然切片有控干的時間，但仍不夠，還會有些許染液滴下，這樣會污染機(jī)器。切片脫水用的100%alc也可設(shè)置兩個缸，根據(jù)實際情況使用。碳酸后所設(shè)置的三個缸為二甲苯，目的是使切徹底得到透明，當(dāng)然兩個缸也可以，但效果沒有三個缸的好。切片經(jīng)一個程序完結(jié)后，擱置在所設(shè)置的二甲苯最后一缸，如沒有去妄動它，它將永遠(yuǎn)不起來。3酒精燈加溫快速染色法及步驟該法可用于臨床快速冰凍切片，快速石蠟及某些快速診斷的切片。它不象常規(guī)染色法那樣，各種步驟都需要一定的時間?？焖偃旧坏笠?，而且染色質(zhì)量要好，否則將給診斷造成困難。所有切片包括冰凍切片和石蠟切片都須用電吹風(fēng)吹，使切片附貼牢固

15、。石蠟切片還須經(jīng)過快速脫蠟，切片經(jīng)電吹風(fēng)吹一定時間后約（1min左右），即刻浸入二甲苯，此可見成片的石蠟溶解于二甲苯中，取出切片再用電吹風(fēng)吹，然后再浸入二甲苯，如此反復(fù)2-3次，石蠟即脫干凈，酒精洗后，繼用電吹風(fēng)吹干。用滴管滴染蘇木素染液于切片上，在酒精燈上加熱染色。加熱時要來回移動切片，不要在一個點(diǎn)上加熱，否則染色不均勻，一點(diǎn)加熱的地方容易將切片掀起來，導(dǎo)致切片脫離載片。當(dāng)加熱的蘇木素染液有蒸汽出現(xiàn)時，即可停止染色（時間約為30sec-1min）。傾去余液，急洗，速分化，水洗。將切片浸入70C左右的熱水中返藍(lán)約30sec-1min。速染伊紅，切片浸入伊紅液即可，后速往下酒精至切片封固，整個染

16、色過程約4min左右，其結(jié)果與常規(guī)法同。4.超聲波快速染色法及步驟切片處理同3法。用一小燒杯，將入蘇木素染液，浸入超聲波的工作范圍內(nèi)，開動超聲波計時表30sec，染色即可完成。取出切片，速水洗，分化，浸入熱水或于超聲波工作范圍內(nèi)超聲20sec,速染伊紅直至封片。結(jié)果同常規(guī)染色法兩種快速染色法染色時的注意事項：切片要附貼牢固，薄切片是很重要的，如果切片過厚，加熱染色時，切片容易翻起脫離載片，導(dǎo)致染色失敗。超聲波快速染色原理見（超聲波快速石蠟制作程序）。染色的目的是使細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞透明度高，便于觀察。染色歸納起來有兩大類，即常規(guī)染色方法和特殊細(xì)胞化學(xué)染色方法。常用的染色方法有：蘇木精伊紅染色法

17、（同組織切片染色）、巴氏染色法、紹氏染色法、邁格吉染色等。巴氏染色法染液配制（1）Harris蘇木精的配制：（同組織染色）（2）橙黃-G6：取橙黃-G60.5g,溶于95%酒精100ml中，加磷鎢酸15mg。（3）EA36染液：先配制原液（貯備液）：亮綠液：亮綠0.5g,溶于5ml蒸餾水中，再加純酒精至100ml。俾士麥棕液：俾士麥棕0.5g,溶于5ml蒸餾水中，再加純酒精至100ml。伊紅Y液：伊紅Y0.5g，溶于5ml蒸餾水中，再加純酒精至100ml。臨用前，將上述亮綠液45ml，伊紅Y液45ml,俾士麥棕液10ml混合后，再加人磷鎢酸0.2g,飽和碳酸鋰水溶液1滴。也可配制EA50液：3%亮綠水溶液10ml純甲醇250ml20%伊紅Y水溶液20ml；冰醋酸20ml磷鎢酸2g（水溶后加入）95%酒精700ml染色步驟（1）將固定后的涂片入水、蘇木精染核、鹽酸酒精分化、返藍(lán)同HE染色。（2）70%、80%、95%酒精逐級脫水各：1分鐘。（3）橙黃-G63-5分鐘。（4）95%酒精I(xiàn)、II缸洗各1分鐘。（5）EA36或EA505分鐘。（6）95%酒精I(xiàn)、II缸洗各1分鐘。（7）無水酒精I(xiàn)