waters高效液相色譜

1、Waters高效液相色譜操作說明一.簡介本高效液相色譜實(shí)驗(yàn)包括：waters1525泵+waters2487雙波長檢測器+色譜柱+電腦（breeze圖譜處理軟件）+流動相二.操作流程0.準(zhǔn)備工作確定色譜實(shí)驗(yàn)方法，處理好流動相1,換好流動相，確定色譜柱選擇無誤1開機(jī)打開泵開關(guān)，聽到兩聲“嘀”的響聲之后，再打開波長檢測器。檢測器進(jìn)入預(yù)熱階段（此時檢測器面板進(jìn)入5min倒計(jì)時）這期間打開電腦，進(jìn)入英文windows操作系統(tǒng)2,待檢測器自檢完畢（整個自檢過程約67min）,打開電腦桌面的（Breeze軟件）。待程序完全啟動，整個開機(jī)過程結(jié)束。系統(tǒng)默認(rèn)進(jìn)入上次使用的方案。2.建立新方法和新方案2.1新建

2、方案方案主要用來儲存你的各個實(shí)驗(yàn)方法，數(shù)據(jù)等內(nèi)容，你可以把它理解為一個文件夾。2.1.1創(chuàng)建步驟選擇f單擊f單擊next在projectname中輸入方案名稱（如abc）,comments中可填注釋,也可不填。一單擊finish2.1.2打開創(chuàng)建的方案在界面下一單擊一在project中找至U你倉U建的方案（如abc）一點(diǎn)擊OK，即進(jìn)入到我們自己的方案中了2.2新建方法在新建的方案中，需要建立不同的試驗(yàn)方法。試驗(yàn)方法主要設(shè)定的包括洗脫方式，檢測波長等參數(shù)。2.2.1新建方法步驟單擊f單擊f單擊（Flow選項(xiàng)卡）一在programmedflow中設(shè)定你的洗脫方式（此步在2.2.2詳述）一單擊UVD

3、etjf單擊(channel1選項(xiàng)卡）f在wavelength框內(nèi)設(shè)定你的檢測波長（如265nm,280nm,215nm等等）f（設(shè)定結(jié)束，保存）：單擊2.2.2洗脫方式的設(shè)定（重要）f輸入方法名稱如（abc1）f單擊saveh在programmedflow中可看到。其中Isocratic為等度洗脫，Gradient為梯度洗脫。以下我們來分述。若你用等度時（Isocratic）：pumpmode中選擇Isocratic表格中IsocraticFlowA為流動相A的流速/IsocraticFlowB為流動相B的流速，TotalFlow為總流速。例如：假設(shè)方法要求用乙腈做A相，用純水做B相，乙腈占

4、70%,水占30%，等度，貝V：若你用梯度時（Gradient）：pumpmode中選擇Gradient表格中第1行默認(rèn)已有，單擊下面空白行處添加新行。Time為時間，即此行開始時間；Flow不作更改，保持1ml/min的總流速；%A處填A(yù)相比例；%B處填B相比例；curve處為曲線型號，一般不變。例如：假設(shè)用方法要求乙腈做A相，用純水做B相,010min乙腈從100%到50%；1030min乙腈從50%到40%；3060min乙腈從40%到80%；則:ProgrammedFlowPumpMode:|Gradient習(xí)Timei：riin；iFlow(jril.imiri)Curve11.00

5、100.00.0210.001.0050.050.06330.001.0040.060.06斗60.001.0080.020.06洗脫設(shè)置完畢繼續(xù)按照2.2.1完成方案的創(chuàng)建。3.洗泵和平衡方法設(shè)定完畢，我們還要進(jìn)行洗泵與平衡兩項(xiàng)工作，讓機(jī)器做好進(jìn)樣前的準(zhǔn)備。3.1洗泵在更換流動相，第一次使用機(jī)器，長時間未使用的情況下需要進(jìn)行洗泵的工作。步驟如下：單擊（purgepump）fnextf按指示圖操作：打開泵面板，取塑料注射器，扭開排液閥旋鈕，用注射器抽取泵中液體10ml左右（無氣泡即可），反向扭緊旋鈕，取出注射器。根據(jù)需要灌洗AB泵。單擊nextf按圖示操作：向左打開參比閥，單擊next（即是對

6、AB泵以默認(rèn)的5mi/min的流速進(jìn)行沖洗，若只充一個泵，只選一個即可。）默認(rèn)沖洗時間5min，5min后自動停止，向右關(guān)緊參比閥一finish結(jié)束洗泵3.2平衡洗完泵后，還要將色譜柱內(nèi)雜質(zhì)洗凈。所以我們需要進(jìn)行平衡。在每次進(jìn)樣前，我們都必須洗平衡。步驟如下：單擊（equilibrate）在彈出的對話框選擇所需方法（一般為你的實(shí)驗(yàn)方法，如abc1）f待基線穩(wěn)定，且達(dá)到小數(shù)點(diǎn)后5位數(shù)字4的時候，即可停止洗平衡（一般十幾鐘到幾十分鐘不等）f4進(jìn)樣(abort)平衡好之后，即可進(jìn)樣（請先將注射器中樣品準(zhǔn)備好5）進(jìn)樣步驟如下：單擊ngleinjetion）f在出現(xiàn)的對話框中輸入進(jìn)樣名稱，方法，進(jìn)樣體積

7、（一般為10ul）,時間等內(nèi)容,SpecifySingleInjectParameters例如設(shè)置好之后一單擊inject按鈕一等到操作動畫出現(xiàn)時，將進(jìn)樣環(huán)手柄搬到load位置，平穩(wěn)插入微量注射器，均勻恒速注入樣品液，除另有規(guī)定外，不應(yīng)立即取下注射器，手柄搬到inject位置，即開始出現(xiàn)圖像f點(diǎn)擊(senddatetoreview)出現(xiàn)大視圖f等到樣品跑結(jié)束，自動出現(xiàn)結(jié)果圖。(中途可以按中止(abort)停止進(jìn)樣5數(shù)據(jù)處理得出了色譜圖，下一步就是對色譜圖各峰的統(tǒng)計(jì)，并得出最終結(jié)果。5.1統(tǒng)計(jì)各峰時間，面積，高度等內(nèi)容。步驟如下：單擊f接著單擊(channels選項(xiàng)卡)找到你需要處理的內(nèi)容雙擊打

8、開6單擊(processingparameterswizard)選擇，單擊ok可輸入統(tǒng)計(jì)開始時間和結(jié)束時間，也可不輸，單擊next注意不要選上，單擊next可輸入統(tǒng)計(jì)最小面積或最小峰高，也可不輸，單擊next單擊next單擊nextf單擊next單擊next輸入名稱，單擊finish出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)表格：此時建議右鍵選中某些不重要的行，并單擊deleterow(s)進(jìn)行刪除，只留下需要的幾行數(shù)據(jù)即可一點(diǎn)擊(saveall)，統(tǒng)計(jì)操作結(jié)束。5.2得出結(jié)果圖。步驟如下：點(diǎn)擊點(diǎn)擊亙SampleSetsInjectionsChannelsMethodsResultSetsCurves1（results選項(xiàng)卡）

9、找到你需要處理的內(nèi)容，右鍵單擊那一個結(jié)果行一單擊(preview)f（也可對話框中選以選第三個自己選擇顯示模式，但一般選擇第二個即可），單擊OK單擊（print）即打印出來實(shí)驗(yàn)結(jié)果（當(dāng)然也可以保存此實(shí)驗(yàn)報(bào)告，單擊file單擊savereport即可）6.關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)前用純有機(jī)相（最好是甲醇）洗平衡以保存柱子。洗干凈后停止平衡一單擊file單擊exit彈出單擊OK,關(guān)閉軟件，關(guān)閉波長檢測器，最后關(guān)掉泵及總電源。注釋161流動相的前處理：一般來說，流動相與試液均需過濾與除氣泡后才能進(jìn)入色譜。過濾：用注射器加濾頭進(jìn)行過濾，或者用專用過濾裝置。除氣泡：將過濾后的流動相或試樣放在超聲波里超聲30min以上，

10、至無氣泡逸出即可。2.英文windows系統(tǒng)：學(xué)校電腦即是開機(jī)的第一個默認(rèn)的windows，無需選擇，直接按回車進(jìn)入系統(tǒng)即可3.存儲過你的方法之后（如abc1）,下次開機(jī),打開你的方案（如abc）之后，可在viewmethod中找到你保存的方法（單擊file-單擊open，再找到打開即可）。方法也可進(jìn)行更改，更改后可以選擇覆蓋保存于另存為。4平衡結(jié)束需要滿足以下兩個條件:（1）平衡圖像已經(jīng)穩(wěn)定，沒有出峰的跡象了（可在平衡時使用圖像左側(cè)的在激活狀態(tài)下按右鍵可以調(diào)出更改時間坐標(biāo)的對話框：，更改數(shù)字即可改變時間坐標(biāo)顯示范圍，便于判斷是否還有出峰跡象）（2）平衡圖像縱坐標(biāo)是否穩(wěn)定在小數(shù)點(diǎn)后五位或更多位

11、。如下圖，即縱坐標(biāo)數(shù)字已到達(dá)小數(shù)點(diǎn)五位，即可。5微量注射器在吸取樣品前應(yīng)先用純有機(jī)相洗（如純甲醇），再用樣品潤洗三次并除去針管內(nèi)起泡后，吸取10ul樣品備用（針頭的殘葉可用濾紙擦去）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前用純有機(jī)相洗干凈注射器內(nèi)壁（也就是反復(fù)抽取幾次），再把注射器裝好。6所有的實(shí)驗(yàn)圖，方法，結(jié)果，都可在finddata中的相應(yīng)選項(xiàng)卡中找到，如我們之前提到的channels三.注意事項(xiàng)1每次必須在洗好平衡之后才能進(jìn)樣2若流動相為酸性物質(zhì)，PH不要低于2.1，否則會損傷C18柱3隨時注意流動相的量，不能讓濾頭露出流動相，暴露在空氣中。流動相不足時盡快更換或補(bǔ)充，更換時盡量輕緩，防止產(chǎn)生氣泡。另外記住流動相與

12、試樣都需要過濾與超聲之后再使用4廢液瓶滿了注意移除廢液。Zzd2011.052.11用液相色譜法測琥珀酸的含量發(fā)酵過程中,伴隨產(chǎn)物琥珀酸生成的同時還有其生成途徑上的有機(jī)酸（如蘋果酸、富馬酸）和其它代謝途徑上的有機(jī)酸（如甲酸、乙酸、乳酸）作為副產(chǎn)物而釋放到環(huán)境中，可能會影響琥珀酸含量的測定。我們選用ZORBAXSB-C8色譜柱,建立了高效液相色譜法測定產(chǎn)琥珀酸發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，分析速度快,精密度較高。2.11.1實(shí)驗(yàn)的儀器與試劑美國公司生產(chǎn)的高效液相色譜儀，包括1525型泵，2487型紫外檢測器,ZORBAXSB-C8柱（water公司生產(chǎn)），PH2型酸度計(jì)試劑：高純水、HPLC級甲醇（北京

13、化工廠）、色譜標(biāo)準(zhǔn)品琥珀酸色譜分離條件色譜分離柱：ZORBAXSB-C8,5口m，4.6mmX250mm保護(hù)柱：HPhypersilODSC18,5um,2.1mmX20mm流動相：0.005mol/L硫酸水溶液,pH2.5（用氨水調(diào)節(jié)）流動相流速：1mL/min檢測器：可變波長檢測器；紫外波長：210nm進(jìn)樣量：20uL；柱溫：30C條件選擇檢測器的選擇培養(yǎng)基組分通過可變波長檢測器（VWD）可檢測到多種物質(zhì)，這是由于培養(yǎng)基中所含有的各種氮（肽、氨基酸等）、糖類、脂類和維生素等成分在紫外波長范圍內(nèi)均有較強(qiáng)的吸收,故這些物質(zhì)在VWD中的圖譜影響了對產(chǎn)物琥珀酸酸的檢測，尤其是琥珀酸含量很小樣品無須

14、稀釋的情況下使用VWD很難對其進(jìn)行定性與定量分析。而培養(yǎng)基組分在示差折光檢測器（RID）中的出峰并不影響該檢測器對目標(biāo)物質(zhì)的檢測。另外，采用VWD分析培養(yǎng)基樣品需要25min，而使用RID只需9min。因此，與VWD相比，使用RID分析乳酸發(fā)酵液樣品不僅排除了其它雜峰對產(chǎn)物乳酸檢測的干擾，而且分析速度快,故本研究選用RID26。流動相的選擇分別以5mmol/LHSO溶液和5mmol/LHPO溶液作為流動相對葡萄糖和32434種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種溶液均可以作為流動相分離葡萄糖和有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，在兩種流動相條件下，各物質(zhì)的出峰順序和出峰時間相近。本研究選用0.005m

15、ol/LHSO溶液作為流動相26。243流動相pH的選擇各有機(jī)酸的保留時間隨著流動相pH的增大而普遍減小,而葡萄糖的保留時間幾乎不發(fā)生變化。通過計(jì)算確定，當(dāng)流動相pH2.5時,各物質(zhì)之間的分離度最大。從填料本身來看,其使用范圍在pH2.08.0,在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下,硅膠基體本身要受到破壞,鍵合相也會受到損失，因此，采用pH2.5的流動相是安全可靠的。本研究確定pH2.5為各物質(zhì)的最佳分離酸度26。4流動相的濃度與流速各物質(zhì)的出峰時間及出峰順序均無多大差異,但由于較高濃度的流動相對色譜柱和輸液泵會造成一定程度的損害,故采用低濃度為宜,所以本實(shí)驗(yàn)采用0.005mol/LHSO溶液為流動相,而且在每批進(jìn)樣分析結(jié)束時，及時使用水和甲醇沖24洗柱子,以免損壞色譜柱。經(jīng)對不同流動相流速分離混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的比較,確定最終流速為1mL/