蛋白質(zhì)分離純化和定性定量分析

1、關(guān)于蛋白質(zhì)的分離純化與定性定量分析第一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是蛋白質(zhì)的分離純化分離：將蛋白質(zhì)混合物分成單一的蛋白成分。純化：得到單一蛋白的純品。第二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月為什么要純化蛋白質(zhì)？研究特定蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能（酶、生物活性蛋白，etc）制備抗體蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用第三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月怎樣純化蛋白質(zhì)？生化學(xué)家根據(jù)特定蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的性質(zhì)差異，來分離或純化它。可溶性、等電點、分子大小、生物學(xué)性質(zhì)可溶性：硫酸銨沉淀等電點：離子交換層析分子大?。耗z過濾層析生物學(xué)性質(zhì)：親和層析第四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作

2、于2022年6月蛋白質(zhì)純化的基本設(shè)計原則原料應(yīng)易得到，并盡可能富含目的蛋白；應(yīng)有特異性的蛋白質(zhì)檢測方法（最重要的因素，決定了純化能否成功）；分級分離，先粗后細；純化條件盡量溫和，避免蛋白失活。第五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)的檢測方法蛋白質(zhì)的活性檢測方法：必須快，必須是特異性的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測方法：western-blot，前提是有特異的抗體第六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月分離純化的一般程序前處理（取決于采用的材料） 動物材料處理：剔除結(jié)締組織和脂肪組織 種子處理：去種皮，有機溶劑脫脂 動物細胞破碎：勻漿器、超聲波處理 植物組織：研磨，纖維素酶 細菌破碎：超聲波

3、，溶菌酶如果蛋白質(zhì)定位于某一細胞器，可用差速離心法將其分離。第七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月相對離心力/g時間/min沉降的組分1 0005真核細胞4 00010葉綠體、細胞碎片、細胞核15 00020線粒體、細菌30 00030溶酶體、細菌細胞碎片100 000310 h核糖體第八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月粗分級分離（rough fractionation） 獲得蛋白質(zhì)提取液后，用一定方法，將蛋白質(zhì)與其它雜蛋白分離開來。 常用方法：鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級分離等 特點：簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)（包括脫鹽），又

4、能濃縮蛋白質(zhì)溶液。第十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月細分級分離（fine fractionation） 主要方法： 層析：凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析等 第十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 蛋白質(zhì)的層析分離第十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月層析（chromatography）chrome意為“色彩”，graphy源自希臘文，意為“寫”。“層析”就是“色譜” 。層析最早由俄國植物學(xué)家 于1903年創(chuàng)造，1941年英國學(xué)者Martin和Synge提出分配層析，此后這種方法得到很大的發(fā)展。層析是利用物質(zhì)在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目

5、的的技術(shù)。第十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月固定相：固定相是層析的基質(zhì)。通常是固體（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。 第十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。 紙層

6、析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用；柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。第十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月怎樣純化蛋白質(zhì)？生化學(xué)家根據(jù)特定蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的性質(zhì)差異，來分離或純化它。可溶性、等電點、分子大小、生物學(xué)性質(zhì)可溶性：硫酸銨沉淀等電點：離子交換層析分子大小：凝膠過濾層析生物學(xué)性質(zhì)：親和層析第十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 離子交換層析離子交換層析利用物質(zhì)的電荷與層析載體（

7、離子交換劑）電荷之間的相互作用而達到分離純化的目的，屬于吸附層析。離子交換層析的固定相稱為離子交換劑，由基質(zhì)和基團兩部分組成。基質(zhì)：纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二乙烯苯等高分子聚合物；基團：共價結(jié)合在基質(zhì)上的帶電基團，可分為正電基團和負電基團。第十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Ion-Exchange chromatographyIf pH mobile phase =7.2 Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)-+-+Anion exchange column = + charg

8、ed第二十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Increased salt concentrationIon-Exchange chromatography-+-Na+Na+Na+Na+Na+Na+Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-+-Na+Na+Na+第二十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月基本操作過程樣品制備，裝柱與平衡上樣（樣品溶解于A液中）洗脫：穿透峰，洗脫峰收集、鑒定第二十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月離子交換層析有兩種洗脫方式分步洗脫：用間斷地遞增的不同離子強度的流動相分次洗脫樣品蛋白的方法；梯度洗脫：連續(xù)改變流動相離子強度的方法。目前隨著層析的自動化，梯

9、度洗脫成為大多數(shù)情況下的首選方案。第二十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月分步洗脫第二十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月梯度洗脫第二十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 凝膠過濾層析利用分子量不同的蛋白質(zhì)，通過凝膠分子篩時速度不同來分離蛋白質(zhì)的方法。固定相：凝膠顆粒（gel bead），多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔決定了凝膠的分級分離范圍，即能被該凝膠分離的蛋白質(zhì)混合物的Mr范圍，如Sephadex G-50的分離范圍是150030000。常用的凝膠有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。第二十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022

10、年6月Size-exclusion chromatography第二十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Size-exclusion chromatographyAbsorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.第二十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月要根據(jù)待分離物質(zhì)的分子量，選擇特定的凝膠過濾基質(zhì)；凝膠過濾層析不僅可用于親水性分子的分離，也可用于疏水性分子的分離，當(dāng)用于疏水性分子分離時，該類層析往往被

11、稱為“凝膠通透層析”；凝膠過濾層析可提供樣品的分子量信息；凝膠過濾的上樣量一般在柱床體積的15；凝膠過濾的樣品濃度越大越好，但一般不要超過100mg/ml。凝膠過濾的注意事項第二十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 親和層析以樣品的生物活性為依據(jù)的分離方法。生物分子的特點是有專一的活性，如酶與底物的結(jié)合，抗原與抗體，激素與受體，糖與凝集素等。將上述作用體系的一方連接到層析基質(zhì)上，使之固定化，就有可能分離純化專一作用的另一方。第三十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Affinity chromatographyMakes use

12、of specific binding interactions between molecules 1- Incubate crude sample with the immobilized ligand 2- Wash away non bound sample components from solid support 3- Elute 第三十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Commonly used affinity columns:Ni2+ binds to poly Histines (example 6xHis)Specific antibodies (anti-Fla

13、g tag)glutathione binds to GSTProtein A or G binds antibodiesAffinity chromatography第三十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Possible elution strategies:pHIon strenghDenatureCompetitor ligand or analogAffinity chromatography第三十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Ni-NTA columnsThe high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged

14、 proteins or peptides is due to:1- the strength with which these ions are held to the NTA resinNTA has a tetradentate chelating group that occupies four of six sites in the nickel coordination sphere第三十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2- the specificity of the interaction between histidine residues and immobili

15、zed nickel ions第三十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月在各種表達載體上都帶有各種標(biāo)簽蛋白，如GST-tag、His-tag、V5-tag等，它們不僅可用于鑒定蛋白表達與否，更可用于與之相連的目標(biāo)蛋白的純化；通過免疫親和層析技術(shù)，只需一步，即可純化帶有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白。親和層析是基因工程中最常用的純化技術(shù)第三十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月高效與簡便：一旦固定化配體制備好后，操作使用非常方便；親和層析是高度濃縮的過程；可從樣品中去除大量雜質(zhì)；可在活性物質(zhì)中去除理化性質(zhì)幾乎完全相同的但已失活的那些“雜質(zhì)”。親和層析的

16、優(yōu)點第三十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫親和層析：將蛋白質(zhì)抗體偶聯(lián)到免疫親和柱可用于抗原蛋白的純化；凝集素親和層析：凝集素是一大類能專一性和糖類和糖復(fù)合物結(jié)合的蛋白質(zhì)，固定化凝集素可用于糖蛋白純化；染料親和層析：有多種染料可與各種類型的酶結(jié)合，又不受酶的作用，可用于多種蛋白的分離。親和層析中的三大通用技術(shù)第四十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 疏水層析與反向?qū)游龅鞍踪|(zhì)具有親水與疏水兩重性，如果在層析基質(zhì)上接上疏水的基團，就能在一定條件下與某些蛋白質(zhì)的疏水基團相互作用，使之吸附，而達到分離純化的目的。一般情況下，是高鹽吸附（12M 硫酸銨），降低流動相的鹽濃度，使樣品

17、洗脫。疏水層析的機制與離子交換層析正好相反，因此兩者是互補的。第四十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月反向?qū)游?，或稱反相色譜，reverse phase chromatography，是液相色譜分析中最常用的技術(shù)。當(dāng)反相色譜用于蛋白質(zhì)分離時，其原理與疏水層析基本相同，區(qū)別在于：疏水層析的配基疏水性較弱（苯基等），所以高鹽吸附，低鹽洗脫；反相色譜配基疏水性強（C18等），所以需要使用有機溶劑洗脫。反向?qū)游雠c疏水層析原理相同第四十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月反相色譜分離蛋白質(zhì)的原理第四十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月反相色譜是最高效的蛋白質(zhì)層析技術(shù)之一第四十四張，

18、PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 蛋白質(zhì)的電泳分離第四十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳（electrophoresis）帶電粒子在電場中向與自身電荷相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同pH溶液中帶不同電荷，在直流電場中能夠泳動。第四十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳基本原理蛋白質(zhì)在電場中泳動時，受到兩種方向相反的力的作用：電場力 FqE，q為帶電量，E為電場強度摩擦力 Fffv，f為摩擦系數(shù)，v為遷移速度當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)以恒速運動時，F(xiàn)Ff0，即qEfv，此時：v/Eq/fq/6r第四十八張，PP

19、T共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月在一定介質(zhì)中，蛋白質(zhì)的q/f是一個定值，因此v/E也是定值，它被稱為電泳遷移率，即：v/E可通過實驗測定，蛋白質(zhì)的值為0.110-4 1.010-4 cm2V-1s-1，它是蛋白質(zhì)的特性之一。第四十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳的分類自由電泳（移動界面電泳）區(qū)帶電泳：在支持物上，蛋白質(zhì)混合物被分離成若干區(qū)帶。穩(wěn)態(tài)電泳：蛋白質(zhì)遷移一段時間后達到穩(wěn)態(tài)，帶的寬度不再隨時間而改變。第五十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（bis）經(jīng)共聚合而成，此過程在TEMED和過硫酸銨催化下進行。A

20、cr在AP和TEMED的作用下形成單鏈，隨后通過bis的作用交叉互聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚合成凝膠。凝膠的孔徑可在較寬范圍內(nèi)變化，以迎合不同的分離需要。第五十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)凝膠的均勻性（孔徑、pH）可分為連續(xù)與不連續(xù)兩類；根據(jù)是否加蛋白質(zhì)變性劑，可分為變性與非變性兩類；根據(jù)是否加還原劑2-巰基乙醇或DTT，可分為還原與非還原兩類；還可根據(jù)電泳裝置的不同，分為圓盤電泳和平板電泳。PAGE的分類第五十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月平板PAGE第五十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月不連續(xù)平板PAGE，是使

21、用 最廣泛的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)，它由濃縮膠與分離膠兩部分組成。不連續(xù)PAGE有很高的分辨力，因為它有以下三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)不連續(xù)PAGE第五十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月制備凝膠樣品電泳目的蛋白檢測基本操作第五十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月染色法：考馬斯亮藍染色法（多種類型可選）、銀染法；活性檢測法：適用于Native PAGE，其中蛋白質(zhì)保持天然活性，可用酶學(xué)方法檢測；免疫印跡法：用特異性抗體檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。PAGE的檢測方法多種多樣第五十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 等電聚焦電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點進行分離的一種技術(shù)。基本原理：利

22、用兩性電解質(zhì)載體形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，使pH從正極到負極逐漸增加。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的pH位置帶電，因此在電場中可以移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動到pH等于pI位點，其靜電荷為0，在電場中不再移動，據(jù)此可將不同pI的蛋白質(zhì)分離。第五十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點樣品加樣位置和體積不受限制；分辨率高于其它類型電泳；可測定pI值；缺點樣品在pI區(qū)域易沉淀，為增加樣品溶解度，可以在膠中加入尿素，但導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活；樣品前處理麻煩。等電聚焦的優(yōu)缺點第六十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 雙向電泳將等電聚焦技術(shù)與SDS技術(shù)

23、組合起來的新技術(shù)，是目前分離蛋白質(zhì)混合物最強大的技術(shù)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)?；静襟E：第一相等電聚焦后，在等電聚焦的垂直的方向進行第二相SDS。第六十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月pH 3 - - - - - - 10（1） IEF等電聚焦電泳（2）SDS（3）染色脫色第六十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月考馬斯亮藍銀 染第六十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月可綜合利用層析和電泳分離純化蛋白質(zhì)第六十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)的濃縮超濾法使用特制薄膜對溶液中的溶質(zhì)分子進行選擇性過濾的技術(shù)

24、。常用離心力使蛋白質(zhì)透過濾膜，而使蛋白質(zhì)截留在膜內(nèi)。第六十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月冷凍干燥法在冷凍狀態(tài)下使樣品中水分升華而濃縮蛋白質(zhì)的技術(shù)，保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的最好方法。注意：必須保證蛋白質(zhì)始終處于冷凍狀態(tài)（在70冰箱預(yù)冷），為提高溶解度可加賦形劑（右旋糖酐、甘露醇等）。第六十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月吸收法采用吸水劑直接吸去蛋白質(zhì)溶液中的水。PEG、蔗糖、凝膠干粉等。沉淀法硫酸銨、PEG、有機溶劑沉淀；免疫沉淀。第六十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 蛋白質(zhì)的含量測定第六十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)的含量測定目前蛋白質(zhì)的直接定

25、量分析技術(shù)只能測定樣品的總蛋白含量；目前沒有任何方法能直接分析樣品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考馬斯亮藍）、BCA法、紫外分光光度法等。第七十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. Lowry法1951年Lowry在Folin酚試劑法和雙縮脲法的基礎(chǔ)上建立原理：第一步反應(yīng)：在堿性溶液中蛋白與Cu2+反應(yīng)形成紫紅色的絡(luò)合物； 第二步反應(yīng)：酚試劑（磷鉬酸和磷鎢酸混合液）與蛋白質(zhì)芳香族氨基酸反應(yīng)呈深藍色。第七十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：同時分析多個樣品，簡便；靈敏度提高；避免酚試劑局限于色氨酸和酪氨酸所造成的蛋白質(zhì)含量測定

26、偏差。缺點：要求溶液完全溶解透明；酚試劑在堿性溶液中穩(wěn)定性差，導(dǎo)致測定誤差；反應(yīng)受多種物質(zhì)干擾。第七十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. Bradford法由Bradford等人于1976年建立?；驹恚嚎捡R斯亮藍G-250在一定條件下可與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致其顏色從紅色變?yōu)樗{色，最大光吸收峰從465nm移至595nm，其吸收度與蛋白質(zhì)濃度成正比。目前絕大多數(shù)公司都提供基于此原理的蛋白質(zhì)定量試劑盒。第七十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡便，配合酶標(biāo)儀，可同時測定多個樣品；可測定低達25 g/ml的蛋白質(zhì)樣品；對干擾劑不敏感；缺點：染料主要結(jié)合蛋白質(zhì)的疏水區(qū)

27、，因此不同組成的蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合比例不同。第七十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月3. BCA法原理：第一步，在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)形成復(fù)合物；第二步，BCA試劑與該復(fù)合物反應(yīng)，生成深紫色化合物，在562nm處有吸收峰。優(yōu)點：操作簡便，線性范圍202000 g/ml；有試劑盒出售。第七十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 紫外分光光度法原理：蛋白質(zhì)中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽鍵在215nm附近有特異吸收?？赏ㄟ^測定該波長的光吸收度，計算蛋白質(zhì)濃度。CA/KL，其中A為吸光度，K為摩爾消光系數(shù)，L為光程。K值可通過各種方法得到（包括軟件分析等）

28、。第七十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡便，且敏感度高（20 g/ml ）；樣品不損失，測定后可繼續(xù)使用。缺點：核酸可干擾測定結(jié)果；不同蛋白質(zhì)芳香族氨基酸含量變動較大。第七十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 凱氏定氮法1883年，丹麥化學(xué)家Kjeldahl建立，基于蛋白質(zhì)的含氮量在16%左右。蛋白質(zhì)+硫酸CO2+H2O+NH3硫酸銨+強堿氨優(yōu)點：適用樣品廣泛，結(jié)果可靠缺點：樣品中非蛋白態(tài)氨影響測定值；蛋白質(zhì)氨基酸有偏差時（大量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣。第七十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 蛋白質(zhì)分子量的測定第

29、七十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. SDS測定分子量基本原理：SDS可以破壞蛋白質(zhì)中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例（1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS）和蛋白質(zhì)組成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶的負電荷的量遠遠超過其本身的電荷量，并與蛋白質(zhì)的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質(zhì)二硫鍵，使蛋白質(zhì)呈橢圓棒形，其軸長與分子量成正比。q/fq/6r，所有蛋白質(zhì)的遷移率都相同。第八十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月在SDS中遷移的蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率的關(guān)系符合下述公式：lg MrlgKbmK1bm其中Mr為蛋白質(zhì)相對分子量，K、K1為常數(shù)，b為斜率，m為遷移率。注意：此公式也適用于核酸在瓊

30、脂糖凝膠中的遷移第八十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月在半對數(shù)坐標(biāo)紙上做出標(biāo)準(zhǔn)曲線注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率會根據(jù)所用凝膠濃度而發(fā)生微小的改變。第八十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 凝膠過濾層析法測定分子量蛋白質(zhì)在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關(guān)系如下式所示：lg MrK1K2 Ve在實驗中，只要測得幾種蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物的Ve，并以它們的lg Mr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的Ve，即可從圖中得到樣品的分子量。第八十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月SD

31、S與凝膠過濾法是互補的凝膠過濾法測得的是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)（如果它有的話）的分子量；SDS測得的是蛋白質(zhì)亞基的分子量；在有2-巰基乙醇（或DTT）存在時，SDS可測得蛋白質(zhì)每條多肽鏈的分子量。綜合應(yīng)用這兩種方法，可得到待測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的許多信息。第八十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月例如： 凝膠過濾法得到的蛋白質(zhì)分子量：180kD SDS（不加還原劑）結(jié)果：45kD SDS（加還原劑）結(jié)果：兩條蛋白帶（15kD和30kD）則結(jié)論是： 該蛋白質(zhì)由4個相同的亞基組成，每個亞基由兩條多肽鏈經(jīng)二硫鍵連接而成，兩條多肽鏈的分子量分別為15kD和30kD。第八十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)譜法是最精確的分子量測